RANK信号调控破骨细胞分化与成熟的研究进展
梅良伟;桑文华;陈富春;李晓春;王登峰;吴卓;穆佐洲;邵海龙
团队意识简短总结【摘 要】破骨细胞来源于微环境造血前体细胞,它的生存、增殖、分化和激活需要巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)参与.RANKL与相应的RANK受体结合,从而刺激破骨前体细胞分化成为破骨细胞.这一过程由不同的调节蛋白和激酶来调控,并且依赖于RANKL-RANK信号.本文中,笔者总结了目前已知的在破骨细胞发生过程中调节RANK信号的机制.在早期阶段,RANK信号的调节通过募集调节蛋白如肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6),引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinas,MAPKs)以及转录因子核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的活化.活化的NF-κB进一步激活调节破骨细胞生成的重要因子-T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1).在信号传递的中间阶段,共刺激信号通过激活磷脂酶Cγ2(phospholipa Cγ2,PLCγ2)连同c-Fos/AP-1引起钙离子(Ca2+)振荡,同时Ca2+信号促进NFATc1的产生.在破骨细胞生成的晚期阶段,NFATc1入核诱导大量的破骨细胞特异性靶基因的表达,从而使细胞融合并发挥其功能.
大空调【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》
【年(卷),期】2018(024)012
绿色蝈蝈【总页数】5页(P1652-1656)
【关键词】破骨细胞;核因子κB受体活化因子;肿瘤坏死因子受体相关因子6;NF-κB激活T细胞核因子1
【作 者】梅良伟;桑文华;陈富春;李晓春;王登峰;吴卓;穆佐洲;邵海龙
【作者单位】陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院病理科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043;陕西省第四人民医院骨科,陕西 西安710043
【正文语种】中 文
书墨聚【中图分类】R68
健康骨骼通过骨的重塑来维持，首先由破骨细胞行使骨吸收功能形成骨吸收陷窝，接着成骨细胞在腔隙内重新成骨，这是一个动态平衡的过程[1]。因此，破骨细胞和成骨细胞的结合在空间和时间上都受到严格的调控。破骨细胞是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞，其主要来源于骨髓中形成的造血前体细胞。M-CSF和RANKL由成骨细胞或骨细胞表达，为破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞所必需[2]。M-CSF刺激破骨前体细胞表面表达RANK(由Tnfrsf11a编码)，进而使RANKL与其受体RANK结合。Tnfsf11或Tnfrsf11a基因缺失的小鼠表现为严重的石骨症，同时伴有因破骨细胞完全死亡而导致的牙齿脱落缺陷[3]。RANKL-RANK信号也受到骨保护素(osteoprotegerin,OPG)(Tnfrsf11b编码)的负调控，OPG是RANKL的一个可溶性诱导受体，能够阻碍RANKL与RANK的结合[4]。踯躅
RANK是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一名成员，它缺乏激活下游信号分子所需的内在酶活性。因此，RANK必须通过募集配体分子例如TNFR相关性因子(TRAFs)，进而激活MAPKs和NF-κB传导细胞内信号[5]。RANK信号调控下游信号，从而导致单核细胞/巨噬细胞前体细胞向破骨细胞谱系的分化和成熟破骨细胞的激活。
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在RANK信号的起始步骤，RANKL与相应的受体RANK结合导致衔接蛋白如TRAF6的募集，从而形成RANK三聚体，同时快速激活MAPKs、NF-κB和AP-1[6]。继而通过激活AP-1和协同刺激信号介导的细胞内Ca2+振荡，放大 NFATc1进行信号传递[7]。最终，活化的NFATc1促使破骨细胞基因转录从而调控破骨细胞的多核和骨吸收功能。本文中笔者主要阐述目前已知的在这一过程中所涉及的分子机制，以及近期关于RANK信号调控破骨细胞的新发现。
1 RANK信号和TRAF衔接蛋白
RANKL与RANK结合促使RANK形成三聚体并募集衔接蛋白—TRAF6，从而启动下游信号的级联放大反应。TRAF家族的其他成员如TRAF2、TRAF3和TRAF5，也可以与RANK结合激活破骨细胞分化所需的转录因子。然而，对TRAF6缺陷小鼠的研究[8]表明，TRAF6是主要的衔接蛋白，主要负责RANKL激活引起的信号级联反应。活化的TRAF6通过激活IκB激酶(IKK)复合体或者非典型蛋白激酶C(aPKC)或TGFβ活化激酶1(TAK1)依赖的磷酸化刺激NF-κB的激活，同时这也是一个需要IKKγ(也被称为NEMO)泛素化以实现最佳激活的过程[9]。支架蛋白p62结合到TRAF6并与aPKCs相互作用，导致多聚蛋白复合物的形成并调节I
KKβ[9]。TRAF6还可与TAK1、衔接蛋白TAK1结合蛋白1(TAB1)和TAB2形成复合物[10]。激活后，TAK1使IKK复合物磷酸化，从而进一步激活NF-κB通路[11]。NF-κB信号对破骨细胞的形成至关重要，有研究表明，NF-κB p50/p52双敲除小鼠因无法生成破骨细胞而表现出严重的骨硬化性疾病[12]。AP-1转录因子包括Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、Jun(c-Jun、JunB和JunD)和ATF(ATFa、ATF2、ATF4和B-ATF)家族成员的激活也是通过衔接蛋白诱导c-Fos实现[13]。c-Fos基因敲除小鼠表现为严重的骨硬化病[14]。这些结果表明，转录因子如NF-κB和AP-1是早期RANKL信号通路重要的下游靶点。衔接蛋白的募集也导致MAPKs的激活，包括c-Jun氮端激酶(JNK)、p38、细胞外信号调节激酶和Akt/PKB[15]。近期有研究[16]发现，激活的C激酶1受体(RACK1)为Trp-Asp40(WD40)重复蛋白家族的一名成员，是破骨细胞分化的必要条件。RACK1充当支架蛋白将TRAF6-TAK1复合物与MKK6而不是MKK3相结合，通过选择性地促进p38的激活在RANKL诱导的破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中起重要作用。此外，考虑到RACK1在RANKL诱导下的表达方式及其与β1、β2整合素亚单位和c-Src之间的关系，RACK1可能参与到破骨细胞的骨吸收功能阶段。其他研究[17]表明，Akt、JNK和NF-κB通路的激活需要生长因子受体结合蛋白2(Grb2)—相关性结合-2(Gab2)。此外，磷脂酶Cγ2(PLCγ2)与Gab2形成复合物进而使G
ab2磷酸化，同时调节RANK募集Gab2。Lee等[18]的研究表明RANK-TRAF6-Rac1-NADPH氧化酶1依赖途径产生的活性氧是MAPK激活和破骨细胞形成的必要条件。
2 共刺激信号
在初始阶段NF-κB、c-Fos/AP-1和NFATc2诱发NFATc1后，RANK信号与免疫球蛋白样受体/免疫受体酪氨酸活化基序(immunoglobulin-like receptor/immunoreceptor tyrosine-bad activation motif,ITAM)信号共同作用，这导致NFATc1的瀑布样放大并且移位入核结合到DNA上联同其他转录因子一起上调NFATc1靶基因的转录[19]。大量的体内研究证明了NFATc1在破骨细胞形成中的重要作用。在动物实验中，破骨细胞特定NFATc1条件性敲除小鼠表现出骨硬化和破骨细胞形成抑制[20]。此外，NFATc1不仅调节破骨细胞活性和骨形成，还调节其他生物系统中细胞的活化和发育，如免疫系统、心血管系统和骨骼肌系统[21]。
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除了RANK信号，免疫球蛋白样受体如2型髓系细胞触发受体(triggering receptor expresd in myeloid cells-2,TREM-2)和破骨细胞相关受体(osteoclast-associated receptor,OSCAR)也可以诱导NFATc1信号[22]。这些免疫受体具有短细胞质尾的特点，并
且与衔接蛋白如DNAX-活化蛋白12(DNAX-activation protein 12,DAP12)或Fc受体共同的γ亚基(Fc receptor common γ subunit,FcRγ)相关联，其中就包含ITAM[19]。当ITAM由于RANKL的刺激发生酪氨酸磷酸化时，一个含有酪氨酸激酶的复合物便形成，这些酪氨酸激酶包括布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kina,Btk)/Tec、衔接分子B细胞连接蛋白(adaptor molecules B cell linker protein,BLNK)和SLP-76，这些复合物将RANK和ITAM下游信号融为一体，最终激活PLCγ2的磷酸化[23]。Btk和Tec缺陷小鼠由于破骨细胞分化被破坏、RANKL诱导的PLCγ2酪氨酸磷酸化高度抑制而表现为骨硬化表型[23]。同时，由于Btk和Tec缺陷，使得RANKL诱导的Ca2+振荡在细胞内消失。这表明，Btk和Tec对破骨细胞形成至关重要，并且这些激酶通过PLCγ2和Ca2+信号通路调节NFATc1的激活。当DAP12和FcRγ缺乏时，在细胞内无法检测到Btk/Tec和BLNK/SLP-76复合物的形成，这表明Tec激酶和BLNK复合物的形成均需要ITAM信号的激活，该复合物可作为连接RANK和ITAM信号的分子开关。近期一项研究[24]表明，在破骨细胞形成过程中由RANKL刺激产生的早期雌激素基因1(EEIG1)能够与RANK相互作用，并且RANKL刺激后与Gab2、PLCγ2和Btk/Tec激酶相连接。EEIG1敲除导致RANK诱导的破骨细胞形成明显减少，这是因为RANKL介导的PLCγ2的活化和NFATc1的产生被抑制所引起。在RANKL的刺激下，RANK
形成了包括EEIG1、Gab2、PLCγ2和Btk/Tec在内的信号复合物，这表明，EEIG1为一种衔接蛋白同时也是RANK和ITAM信号的连接蛋白[24]。
PLCγ2也通过其高度保守域与RANK相互作用，并且与Gab2和TRAF6形成复合物，从而表现为一种信号依赖方式的磷酸化。ITAM信号与RANK信号一起介导长期的感应性PLCγ2激活。活化的PLCγ2通过分解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸产生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网(ER)表面的IP3受体结合。因此，储存在内质网中的Ca2+被释放到胞质中，并诱导产生Ca2+振荡[25]。NFATc1的诱导也受其亚细胞定位的调控，这依赖于其丝氨酸残基的磷酸化[26]。在缺乏RANKL刺激的条件下，NFATc1主要由位于细胞质中的活性糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化。当RANK信号在其抑制性丝氨酸残基(GSK-3β的Ser9)处诱导GSK-3β磷酸化后，GSK-3β即被灭活。这使NFATc1通过钙依赖磷酸酶去磷酸化，随后转移进入细胞核。在细胞核中，NFATc1诱导靶基因的表达。在破骨细胞过表达GSK-3β的突变型转基因小鼠中，由于体内破骨细胞数量的减少以及体外破骨细胞形成和NFATc1感应受损而表现出骨硬化病[27]。此外，抑制3-磷酸肌醇激酶可以降低破骨细胞的形成，减弱NFATc1的表达。GSK-3β因磷酸化增加而失活，Akt在破骨细胞前体中过表达也可以引起NFATc1的表达及其核定位。最近的一项研究[28]表明，PKCβ通过灭活GSK-3β调控NFATc1的激活，从而
导致破骨细胞生成。这些结果表明，在破骨细胞分化过程中，GSK-3β/NFATc1级联信号在RANK信号通路内具有重要作用。
3 破骨细胞分化晚期的主要信号
在RANK信号后期，扩增的NFATc1激活和诱导破骨细胞特异性基因表达，这些基因能够编码与破骨细胞分化、融合和功能相关的蛋白。此外，在破骨细胞分化过程中，NFATc1的正性或负性调节因子得到增强或抑制。在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，负性调节因子的表达下调：v-maf肌肉筋膜纤维肉瘤癌基因家族、蛋白B(MafB)、干扰素调节因子-8(IRF8)以及B细胞淋巴瘤6(Bcl6)等在破骨细胞分化过程中抑制NFATc1表达[29-31]。所有负性调节因子都被转录抑制因子B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(Blimp1)下调[32]。在破骨细胞分化过程中，Blimp1是由RANKL刺激引起的，而在破骨细胞中缺乏Blimp1的小鼠，由于破骨细胞严重破坏而表现出骨硬化表型[33]。最近有研究结果[32]表明，sirtuin 6(Sirt6)是一种核组蛋白去乙酰化酶，通过Blimp1直接抑制抗破骨基因的表达。在造血细胞中，Sirt6的特异性消融可以通过降低破骨细胞的分化而增加骨体积。RANKL诱导的NFATc1上调了Sirt6的表达，而诱导的Sirt6通过抑制MafB与Blimp1的结合，对NFATc1的转录产生了积极
的调控作用[32]。因此，NFATc1通过诱导其靶基因Blimp1和Sirt6的表达来维持其自身的表达，并下调负调节因子的表达。
