γ
-氨基丁酸转氨酶的动力学特征及其测定法的改良*胡元元 何善述
同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
摘要 对γ-氨基丁酸转氨酶(G ABA-T )的催化反应动力学进行了系统研究。结果显示,GA BA-T 的催化反应属于
双底物乒乓机制，最适反应温度和反应时间分别为30℃和15min,pH 值为8.75,K α-KG
m 和K GABA m
分别为 2.97和 2.43mmol /L
。故底物α-酮戊二酸(α-K G )、γ-氨基丁酸(G ABA )浓度分别为4.8和18mmo l /L 。此改良法建立了测定大鼠脑组织G ABA -T 活性的微量紫外分光比色法，灵敏度比国外同类方法提高1.9倍。
关键词 γ-氨基丁酸转氨酶; 酶动力学; 微量紫外比色法中图法分类号 Q 55, R446.61
Kinetic Characteristics of GABA -Transamina and Its李白乘舟将欲行
Improvement of Measurement
Hu Yuanyuan,He Shanshu
Department of Biochem istry ,School of Basic Medical Sciences , Tongji Medical University ,Wuhan 430030
Abstract The kinetic cha racteristics of GABA-transamina w ere studied and the optimal reaction condition established.The activity of GABA-transamina fro m rat cerebral co rtex w as measured by using microultrav iolet spectro photometry.The results show ed tha t the reaction ca taly zed by GABA-tra nsami-na obey ed a ping -pa ng reactive mechanism.The optimal reactiv e tem perature and time w ere 30℃and 15min respectiv ely,p H v alue w as 8.75.The estimated K m v alue for α-ketog lutarate a nd GABA w ere 2.97m mol /L and 2.43mmo l /L respectiv ely ,a nd the cor respo nding co ncentrations of substra tes α-ketog lu-tarate and GABA concentra tion w ere 4.8mmo l /L a nd 18mmo l /L respectiv ely.As compared to that in ref-erence,the nsitivity of this modified method w as increa d by 1.9fold.
Key words GAB A -tra nsamina ; kinetic ; microultrav iolet spectro photometry *
国家自然科学基金资助项目(N o .39330210)
胡元元，女,1969年生，博士研究生。
γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)是催化中枢神经系统抑制性神经递质γ-氨基丁酸代谢生成琥珀酸半醛的关键酶，其活性高低直接影响到神经递质γ-氨基丁酸的水平[1]。本文利用微量紫外比色法[2]对GABA-T 的动力学进行了分析研究，阐明了大鼠皮质GABA-T 的酶动力学特征，并在此基础上改良建立了GABA -T 活性测定的最佳反应条件。1 材料与方法
1.1 材料
SD 大鼠，雌雄各8只，体重150
～200g ，由同济医科大学实验动物学部提供,γ-氨基丁酸、α-酮戊二
酸、磷酸吡哆醛购自Sigma 公司(美国),Shimadzu 恒温紫外分光光度计(日本)。
1.2 样品制备
断头处死动物，快速取脑皮质，称取湿重，加入10倍冰冷的匀浆缓冲液(甘油200ml /L ,Trito n X-1001.3g /L,GS H 10
-4
mol /L,PLP 10
-4
mol /L,
Na 2EDTA 10-3
mol /L ,K 2HPO 4/KH 2PO 410
-2
mo l /L p H 6.8)，匀浆后7000r /min,4℃离心15min，收集上清液待测酶活性。
1.3 GABA -T 的测定
G ABA 经GABA-T 作用生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛经琥珀酸半醛脱氢酶脱氢生成琥珀酸，脱下的氢将菸酰胺腺嘌呤二核苷酸(N AD +)还原为还原型菸酰胺腺嘌呤二核苷酸(N ADH )。此酶联反应中琥珀酸半醛脱氢酶活性很高,GAB A -T 是此酶联
第28卷第1期第7页1999年 2月 同济医科大学学报Acta Univ M ed Tongji
Vol.28 No.1 P.7
Feb. 1999
反应的限速酶，故以N ADH 的生成速度反映GA-BA -T 的活性。取样品匀浆上清30μl 加入到570μl,pH 8.75的磷酸钠缓冲液中(N AD +10-3mo l /L,α-巯基乙醇3.5×10-3
mol /L),30℃保温15min,340nm 比色。
1.4 酶活性的计算
GAB A-T 的活性以每min 每mg 蛋白的样品催化生成N AD H 的nmol 数表示
U=△OD ×1t ×106∑N AD H
340×V ×1υ×1p =278×ΔOD
p (nm ol /mg pr ·min)
△OD ：样品紫外比色读数的增加值,t ：反应时间(min),∑
N AD H 340
:N ADH 的摩尔消光系数，本实验
条件下实测N ADH 的摩尔消光系数 4.795×103,V ：反应总体积(m l),υ：样品体积(ml),P ：样品蛋白
含量(mg /ml )。2 结果
2.1 最适温度
反应温度25℃、30℃时测定酶催化产物N ADH 的生成量与反应时间的关系，结果见图1,GABA-T 在25℃时90min 开始失活,30℃时60min 开始失活，但酶失活前反应温度30℃较25℃酶活性高
养花的好处
。
图1 不同反应时间下N AD H 的生成量
2.2 最适P H
用不同pH 的缓冲液与样品30℃保温15min,GABA -T 的p H 活性曲线见图2，结果指出GABA -T 最适p H 为8.75
言志。2.3 底物浓度对酶活性的影响
2.3.1 α-酮戊二酸与酶活性的关系：固定GABA 浓度为6m mol /L ，测定不同α-KG 时GABA -T 活牙齿谜语
性如图3,α-KG 浓度小于5m mol /L 时与酶活性成正比，大于5mm ol /L 即对酶活性有抑制作用。2.3.2 GABA 与酶活性的关系：固定α-KG 浓度为4
好方法
m mol /L ，测定不同GABA 时GABA -T 活性如图
图2 pH 值对G ABA-T 活性的影响
图3 不同浓度α-酮戊二酸对G ABA-T 活性的变化曲线
(G A BA 固定为6mmol /L)
四个月辅食图4 不同浓度G A BA 时G ABA -T 活性的变化曲线(α-酮戊二酸固定为4mmo l /L )
4,GABA 浓度与酶活性成正比。
2.4 双底物酶促反应的米氏常数
将GABA-T 的底物之一α-KG 浓度分别固定在2、3、4mol /L，测定不同GAB A 浓度时GABA-T 的活性并进行双倒数作图(图5)，说明GAB A -T 催化的酶促反应符合乒乓机制；将图5纵轴、横轴上的截距对α-KG 浓度二次作图，得到V max 为117.42
nmol /ml ·min ,K α-KG m 为2.97mo l /L ,K GABA
m 为2.43mo l /L
。2.5 量效关系
根据前述动力学参数分析得到的最佳反应条件
·
8·同济医科大学学报 1999年2月第28卷第1期
ui面试题图5 不同浓度G ABA 对G ABA -T 活性的双倒数作图
〔α-酮戊二酸浓度固定于2mol /L (●)3mmol /L (□)4mmo l /L (▲)〕
下(30℃,15min ,p H 8.75,α-KG 4.8mmo l /L ,
GABA 18mm )，测定GAB A-T 与产物的量效关系如图6，样品量5～55μgpr 范围内酶量与反应速度呈直线关系
。
图6 GA BA -T 的量与其催化活性之间的量效关系
采用本改良法测定16例大鼠脑皮层细胞的GABA-T 活性为(21.14±3.32)nmo l /mg pr ·min 。3 讨论
GAB A 是哺乳动物中枢神经系统抑制性神经递质，介导大约30%～40%中枢神经系统神经元的功能。主要合成途径是由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶脱羧生成,GAB A 在突触前神经末稍合成后释放入突触间隙，激活突触后GABA 受体，导致Cl —通道开放引起突触后膜超极化[3]
。GABA 的合成一般较实际需要高[4]，突触前膜或胶质细胞摄取GABA 后，由GABA -T 催化GABA 的氨基转移到α-酮戊二酸上，转氨基作用需要磷酸吡哆醛的辅助作用以生成琥珀酸半醛，磷酸吡哆醛因此转化成磷酸吡哆胺，而α-酮戊二酸在接受氨基生成谷氨酸的过程中又将磷酸吡哆胺还原为磷酸吡哆醛。由于琥珀酸半醛脱氢酶与GABA -T 耦联且分布一致，琥珀酸半醛
很快被氧化成琥珀酸进入三羧酸循环参与能量代
谢，尽管体外GABA 的代谢是可逆的，但在体内无明显逆反应发生[5]。GABA 的代谢由GABA-T 活性高低调节。
G ABA -T 是不耐热酶,25℃90min 或30℃60min 酶就开始失活，失活前30℃较25℃酶活性高，故我们选择30℃保温15min 。Metcalf 认为碱性环境有利于GABA 与磷酸吡哆醛之间形成Shiff 碱以及G ABA 上γ-碳原子-C H 的去质子化与重新
质子化，从而将氨基转移给γ-酮戊二酸[6]，我们实验结果表明GABA-T 的最适pH 为8.75，与文献报道一致。GABA -T 催化的反应为双底物酶促反应，底物之一GABA 浓度与酶催化活性成正比，而另一底物α-酮戊二酸低浓度时与酶活性成正比，但浓度过高反而抑制酶活性，关于这种抑制机理尚不清楚，可能是α-酮戊二酸浓度过高将对后续反应的底物琥珀酸半醛产生竞争性抑制作用所致。GABA-T 所催化的双底物酶促反应符合双底物乒乓机制
[7,8]
，其米
氏常数K α-K G
角度计m 为2.97mol /L,K GABA
m 为2.43mol /L 。根据米氏常数，实验中选择α-酮戊二酸浓度为 4.8mo l /L,GABA 为18mo l /L 。上述反应条件测定GABA-T 灵敏度较文献提高1.9倍[2]
。
参 考 文 献
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(1998-07-01 收稿)
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9·胡元元等.γ-氨基丁酸转氨酶的动力学特征及其测定法的改良
