基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株
秦智锋;廖立珊;孙洁;张彩虹;花群义;刘建利;卢体康;林庆燕;吕建强;曹琛福;阮周曦;曾少灵;陈书琨种子仓库
【摘 要】To differentiate velogenic (highly virulent), mesogenic (intermediate virulence) from lentogenic (nonvirulent) NDV, a duplex real-time RT-PCR (duplex LNA rRT-PCR) was developed bad on locked nucleic acid (LNA) directed at the fusion-cleavage site of NDV. The nsitivity and specificity of the duplex LNA rRT-PCR was evaluated with the avian paramyxovirus-1 (APMV-1) TaqMan real time RT-PCR (TaqMan-APMV-1-rRT-PCR) assay and virulent (velogenic and mesogenic) NDV TaqMan real time RT-PCR assay (TaqMan-vNDV-rRT-PCR) validated by Unite State department agriculture (USDA). The specificity of the the duplex LNA rRT-PCR was superior to APMV-1-rRT-PCR. The nsitivity of F48E9 strain to LNA assay was 10 times less than TaqMan real time RT-PCR assay, but the same for lentogenic strain (LaSota). The results showed that the duplex LNA-rRT-PCR is a promising method for routine quarantine of NDV and clinic monitoring of Newcastle dia.
%为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR).该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性；通过对副粘病毒Ⅰ型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较.结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100％(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍.本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测.
【期刊名称】妒怎么读《中国预防兽医学报》
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【年(卷),期】2012(034)009
【总页数】5页(P719-723)
【关键词】新城疫病毒;中强毒株;弱毒株;LNA RT-PCR;鉴别检测
【作 者】秦智锋;廖立珊;孙洁;张彩虹;花群义;刘建利;卢体康;林庆燕;吕建强;曹琛福;阮周曦;曾少灵;陈书琨
【作者单位】深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳市外来有害生物质检测技术研发重点实验室,广东深圳518045;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001;深圳出入境检验检疫局,广东深圳518001
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
新城疫病毒（Newcastle dia virus,NDV）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病
毒属I型（APMV-1）病毒，该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，能够在被侵袭的鸡群中迅速传播。NDV被我国列为一类传染病，也是世界动物卫生组织（OIE）须呈报的疫病，是国际动物产品贸易中重点检查的重大动物疫病。根据病毒株致病力的差异，将NDV分为强毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV中强毒株在鸡群中传播迅速，危害严重[1]；而弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，多与其他疾病共同发病而造成一定的危害[2]。因此，建立鉴别NDV并有效区分中强毒株和弱毒株的新型快速分子生物学检测方法成为迫切要求，对有效控制疫情、降低经济损失具有重要意义。
锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一种新型的寡核酸衍生物，与Taq Man探针相比，具有两个明显的优点：一是可增强热稳定性和杂交的特异性，二是LNA探针长度较短，可增加设计的灵活性。
本研究利用LNA探针技术，针对中强毒株和弱毒株特异序列分别设计了碱基锁定的LNA探针，极大地提高了探针的Tm值和特异性，并建立了同时鉴别诊断NDV中强毒株与弱毒株的双重荧光定量锁核酸RT-PCR（Duplex LNA rRT-PCR）检测方法。
三年级班主任工作总结1 材料和方法
1.1 病毒与血清 NDV标准强毒株F48E9、中等毒力I系疫苗（Mukteswar株）购自中国兽药监察所；NDV标准弱毒株Ⅱ系（B1株）、Ⅲ系（F株）、IV系（Lasota株）和Clone-30弱毒疫苗株均由深圳市兽医防疫监督所馈赠；NDV，禽流感病毒（AIV）H5、H7、H9标准阳性血清，均购自哈尔滨兽医研究所；9日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.2 主要试剂 AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit购自美国ABI公司；Qiagen Viral RNA Mini Kit购自Qiagen公司；美国农业部推荐的副粘病毒I型（APMV-1）实时荧光RT-PCR（APMV-1-rRT-PCR）检测引物探针和NDV中强毒株（vNDV）引物探针[3]由上海基康公司合成。happy最高级
1.3 样品的采集与检测 采集2003年以来深圳地区鸡场样品进行NDV监测。每个鸡场分大、中、小3个采样群采样。每个采样群分别采集喉头棉拭子和泄殖腔棉拭子30份，每3份合成一个混合样，即每个鸡场采集30份混合样品，于当日送至实验室进行检测。样品到达实验室后，采用美国农业部推荐的APMV-1-rRT-PCR进行筛选检测[3]。
1.4 NDV株的分离与鉴定 对APMV-1-rRT-PCR筛选阳性的样品，按照《新城疫诊断技术》
（GB/T 16550-2008）进行鸡胚分离与鉴定。将样品处理后接种9日龄SPF鸡胚，接毒3 d后，无菌收获尿囊液进行鉴定。
参照OIE手册中推荐的标准[4]，采用标准的血凝方法（HA）程序进行检测。以血凝价超过≥23初步判定为具有血凝活性。
我爱作文将具有血凝性的抗原统一稀释成4血凝单位的溶液，分别与NDV标准阳性血清，AIV H5、H7、H9亚型标准阳性进行血凝抑制试验（HI）。以血凝抑制价≥23判定为同血清亚型一致的亚型抗原。
1.5 duplex LNA rRT-PCR检测方法的建立
1.5.1 引物与探针设计 采用bioEdit（7.0.9.0）软件，将GenBank中NDV主要代表性强毒力病毒株、中等毒力病毒株和弱毒力病毒株的F基因全序列，以ClusalW方式进行排列，选取F基因裂解位点两端保守区域设计简并引物，选取裂解位点序列设计鉴别诊断简并探针。中强毒株探针和弱毒株探针均使用了简并碱基脱氧次黄嘌呤（I）。引物与探针序列见表1，中强毒株探针的5'端用FAM标记，弱毒株探针用HEX标记，探针的3'端用BHQ基团淬灭。
1.5.2 duplex LNA rRT-PCR检测方法建立 参照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书操作，于全自动核酸抽提工作站中抽提中强毒株5株（强毒株F48E9、中等毒株I系疫苗、vNDV-YF、vNDV-HB和vNDV-KD）、弱毒株 6株（Ⅱ系、Ⅲ系、IV系、Clone-30、aNDV-YF和aNDV-RR）和阴性对照尿囊液中病毒核酸。
参照ABI公司AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit操作说明书配制荧光RT-PCR反应液。进行实时荧光PCR扩增，反应程序如下：50℃30 Min，95℃10m in；95℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，5个循环；95℃10 s、60℃40 s，35个循环，设置60℃时同时收集FAM和HEX两种荧光。
1.5.3 Duplex LNA rRT-PCR与Taq Man rRT-PCR检测方法灵敏度比较 选取强毒株F48E9和弱毒株IV系疫苗尿囊液，10倍系列稀释成1×10-1～10-10等10个稀释度，用EZ1抽提核酸，按照所建立的方法进行灵敏度试验。同时采用美国农业部推荐的Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR检测方法和Taq Man-vNDV-rRT-PCR检测。测定duplex LNA rRT-PCR和Taq-Man rRT-PCR检测NDV的灵敏度。
表1 NDV中强毒株与弱毒株鉴别引物与探针Table 1 Primers and probes for pathotyping of
NDV名称Name NDV-FP NDV-RP vNDV-Pb aNDV-Pb序列Sequence 5'-CGCAGGATMCAAGRG-3'5'-GGAGGATGTTGGCAGC-3'5'-FAM-CCTATAA+AICGIT+TCTGICTCCTTCC-BHQ1-3'5'-HEX-CCTATAA+GICGIC+CCTGTITCCC-BHQ1-3'
1.5.4 Duplex LNA rRT-PCR检测方法特异性试验采用duplex LNA rRT-PCR方法，检测中强毒株和弱毒株均同时收集了FAM和HEX两种荧光，来检测两个探针的特异性。半个刺猬
利用duplex LNA rRT-PCR检测方法，对实验室保存的鸡肉正常组织、鸡血清样品、火鸡肌肉组织、鸽组织、猪肉组织、正常鸡胚尿囊液、AIV H1N1、H3N2、H5N1、H7Nx、H9N2和传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克病毒等其他家禽病毒和大肠杆菌、沙门氏菌、单增李氏特杆菌等细菌共22份非NDV阳性样品进行检测，进一步确定所建立方法的特异性。
1.6 临床样品检测 对2010年～2011年深圳鸡场新城疫普查监测的样品312份混合棉拭子进行duplex LNA rRT-PCR检测，同时按照美国农业部推荐的标准Taq Man-APMV-1-rRT-PCR进行检测，按照出入境行业标准《新城疫中强毒株检测方法荧光RT-PCR法》 （SN/T
光盘行动的手抄报1686-2005）进行 Taq Man-vNDV-rRT-PCR检测。确定所建立方法的可行性。
2 结果
2.1 NDV的检测与鉴定结果 自2003年以来，共采集NDV监测混合棉拭子样品近6 000份。Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR检测结果阳性的共有121份。对2004年以前的筛选阳性样品，全部采用鸡胚进行病毒分离后进行HA和HI鉴定。2003年和2004年共鉴定出NDV中强毒株3株，弱毒株2株，由哈尔滨兽医研究所进行毒力鉴定。详细检测结果见表2。最终分离出5株NDV，用于duplex LNA rRTPCR检测方法建立以及对强弱毒株检测的特异性分析。对于2005以后的样品，采用国家出入境行业标准《新城疫中强毒株检测方法荧光RT-PCR法》（SN/T 1686-2005）进行中强毒株鉴定。
