53卷
收稿日期：2022-03-23基金项目：广西重点研发计划项目（桂科AB1850016，桂科AB19245033，桂科AB21076008）；广西农业科技自筹经费项目
（Z202065）
通讯作者：黄光华（1975-），orcid/0000-0003-0973-023X ，副研究员，主要从事罗氏沼虾良种选育研究工作，E-mail ：
******************；童桂香（1982-），orcid/0000-0002-6692-8595，高级工程师，主要从事水产病害防控研究工作，E-mail ：*************
第一作者：黄玉英（1969-），orcid/0000-0002-0862-661X ，主要从事水产病害检测技术与防控研究工作，E-mail ：walthw
@
罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重
荧光定量PCR 检测方法的建立及应用
黄玉英1，杨明伟2，谭红连1，梁爱国标语
正1，曾兰1，韦信贤1，黄光华1*，童桂香1*
（1广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁
530021；
2
广西水产畜牧学校，广西南宁
530021）
摘要：【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒（MrNV ）和十足目虹彩病毒1（DIV1）的二重荧光定量PCR ，为罗氏沼虾白尾病（WTD ）及虹彩病毒病（DIV1D ）的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP 基因和DIV1-MCP 基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB 探针，将目的基因片段分别克隆至pGM-T 载体上制备重组质粒（pGM-T-CP MrNV 和pGM-T-MCP DIV1），其中，pGM-T-CP MrNV 用Sal I 酶切后经体外转录获得MrNV 标准品RNA ，pGM-T-MCP DIV1则直接作为DIV1标准品DNA ；以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定，
建立可同时检测MrNV 和DIV1的二重荧光定量PCR ，并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV 标准品RNA 和DIV1标准品DNA 均具有很好的稳定性，可作为标准品和阳性对照使用；标准品起始模板范围为1.0×101~1.0×108Copies/反应时，建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR 灵敏度高，对标准品的检测灵敏度可达10Copies/反应，对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10Copies/mg ；与其他虾类常见病原无交叉反应，且整个检测过程仅需1h 左右。二重荧光定量PCR 检测MrNV 的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%，检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR 和国内现行有效标准的套式PCR 分别对117份临床样品进行MrNV 和DIV1检测，结果显示对MrNV 和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%，且二重荧光定量PCR 检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR 具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV 和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB 探针技术建立的二重荧光定量PCR 能同时检测MrNV 和DIV1，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点，可为WTD 和DIV1D 的临床诊断及实时监测提供技术保障。
关键词：罗氏沼虾野田村病毒（MrNV ）；十足目虹彩病毒1（DIV1）；TaqMan-MGB 探针；二重荧光定量PCR 中图分类号：S945.41
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2022）05-1474-09
Development and application of duplex fluorescent quantitative PCR method for detecting Macrobrachium ronbergii nodavirus
and decapod iridescent virus 1
HUANG Yu-ying 1，YANG Ming-wei 2，TAN Hong-lian 1，LIANG Zheng 1，ZENG Lan 1，
WEI Xin-xian 1，HUANG Guang-hua 1*，TONG Gui-xiang 1*
高中英语试卷
（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture ，
Nanning ，Guangxi 530021，China ；2
Guangxi Aquatic and Animal Husbandry School ，Nanning ，Guangxi 530021，China ）Abstract ：【Objective 】To develop duplex fluorescent quantitative PCR detection method for Macrobrachium ron-bergii nodavirus （MrNV ）and decapod iridescent virus （DIV1），so as to provide a simpler and more effective detection
5期·1475·
0引言
【研究意义】罗氏沼虾野田村病毒（Macrobra-chium ronbergii nodavirus，MrNV）是一种单股正链RNA病毒，隶属于野田村病毒科（Nodaviridae）（黄光华等，2015），主要感染罗氏沼虾苗种，可造成淡化后仔虾的死亡率高达90%，患病虾以肌肉白浊、白斑或白尾等症状为临床特征，因此被称为罗氏沼虾白尾病（White tail dia，WTD）（姜兰等，2002；陈之航等，2015）。WTD是世界动物卫生组织（OIE）规定必须申报的疫病，自报道以来曾在多个国家和地区广泛流行，发病快、死亡率高，给罗氏沼虾养殖业的健康发展造成极大危害，我国已将其列为二类动物疫病（Cheng and Chen，1998；钱冬等，2002；陈之航等，2015）。十足目虹彩病毒1（Decapod iridescent virus1，DIV1）是近年来虾类养殖中新出现的传染性病原，隶属于虹彩病毒科（Iridoviridae）十足目虹彩病毒属（Decapodiridovirus）（Chen et al.，2019），可感染罗氏沼虾、凡纳滨对虾、红螯螯虾、中国对虾及青虾等主要养殖虾品种，并造成大批量死亡（Xu et al.，2016；Li et al.，2017；Qiu et al.，2017），也可感染河虾、河蟹、螺蛳及浮游生物等水生生物成为传染源（王甘翔等，2018）。由于DIV1的多宿主特征，其传播迅速且广泛，DIV1疫情在我国虾类养殖各区域相继暴发，造成巨大经济损失，且疫情有进一步扩大和加剧的趋势，给我国虾类养殖业带来严峻挑战，农业农村部已将DIV1引起的虾虹彩病毒病（Decapod iri-descent virus1dia，DIV1D）定为新发疫病，并暂时参照一类疫病
处置（农渔技疫函〔2018〕95号）。WTD和DIV1D是罗氏沼虾养殖中危害最严重的2种病毒性疾病，目前尚无特效药物及治疗方法，切断病毒传播途经仍是最有效的预防措施。因此，亟待建立一种能同时鉴别MrNV和DIV1的检测方法，为虾苗检疫、亲虾筛选及疾病诊断等提供更高效的技术手段。【前人研究进展】目前，针对MrNV的检测方法有胶体金试纸条、ELISA、RT-PCR、荧光定量RT-PCR 及RT-LAMP等（Romestand and Bonami，2003；Sri Widada et al.，2003；Pillai et al.，2006；童桂香等，2012；黄光华等，2015），关于DIV1的检测方法已报道有套式PCR、荧光定量PCR、LAMP和RPA等（Qiu et al.，2017，2018；韦信贤等，2020；邹莹等，2020；Tong et al.，2022）。这些检测方法在实际检测工作中各具优缺点，RT-PCR需进行PCR和电泳分析，且敏感性较低；套氏PCR敏感性高，但需进行两轮PCR 及电泳分析，检测耗时长，且多次开盖操作易造成交叉污染；ELISA准确性高，但操作繁琐、耗时长；LAMP灵敏、快速，但易出现假阳性。相对而言，实
technology for clinical diagnosis and epidemic monitoring bergii white tail dia（WTD）and decapod irides-cent virus1dia（DIV1D）.【Method】Specific primers and TaqMan-Minor Groove Binder（TaqMan-MGB）probes were designed bad on the conrved quence of MrNV-CP gene and DIV1-MCP gene respectively，and the target gene frag-ments were cloned into the pGM-T carrier to construct recombinant plasmids，pGM-T-CP MrNV and pGM-T-MCP DIV1.Among them，pGM-T-CP MrNV was digested by SalⅠand transcribed in vitro to obtain
MrNV standard RNA，while DNA of pGM-T-MCP DIV1were rved as DIV1standard DNA.The reaction conditions were optimized with standard being taken as tem-plates.And the standard curves were established.Then the duplex fluorescent quantitative PCR detection method for MrNV and DIV1was developed，and the specificity，nsitivity，reproducibility tests and detection of clinical samples were car-ried out to evaluate the applicability of this method.【Result】The prepared RNA transcribed and DNA had good stability and could meet the requirements of the standards，and the standard curves showed a good linear relationship with quantita-tive range from1×101to1×108copies/reaction.The optimized duplex fluorescent quantitative PCR method had a high n-sitivity with the detection limit as low as to10copies/reaction for the standards and approximately10copies/mg for bergii tissue samples.It had no cross reaction with common shrimp pathogens，and the entire detection could be completed within1h for a single sample；the variation coefficients of intra-group and inter-group were0.31%-0.93%and 0.96%-1.33%for MrNV detection，which were0.35%-0.81%and0.78%-1.04%for DIV1detection.The duplex fluores-cent quantitative PCR method and nested PCR method recommended by current standards were adopted to detect117clin-ical samples，the results showed that most of the detection result were the same with coincidence rate of99.15%for MrNV detection and97.44%for detecting DIV1.But the duplex fluorescent quantitative PCR method had better nsitivi-ty in detectin
g samples with low copies target virus.The MrNV and DIV1positive rates of Guangxi were6.0%and11.0% in2020respectively.【Conclusion】The duplex fluorescent quantitative PCR method developed bad on TaqMan-MGB probe technology can detect MrNV and DIV1virus at the same time and it is nsitive，specific，reproducible，simple and rapid，so it can provide technological support for real-time diagnosis and monitoring of WTD and DIV1D.
Key words：Macrobrachium ronbergii nodavirus（MrNV）；decapod iridescent virus1（DIV1）；TaqMan-MGB probe；duplex fluorescent quantitative PCR
Foundation items：Guangxi Key Rearch and Develop Project（Guike AB1850016，Guike AB19245033，Guike AB21076008）；Guangxi Agricultural Science and Technology Self-financing Project（Z202065）桌面快捷方式图标
黄玉英等：罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
53卷
南方农业学报
·1476·
时荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、检测速度快、全封闭反应等优点，已成为实验室诊断最常用的检测方法（钟江华等，2011；隗黎丽，2012）。多重荧光定量PCR是在荧光定量PCR的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测分析，应用于病原检测时可实现对多种病原进行同步检测，具有简便、高效、检测成本低等优势。姜利霞等（2021）建立了可同时检测牛疱疹病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒单一或混合感染的四重荧光定量PCR；史喜菊等（2021）建立了可用于伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2等3种病毒混合感染检测和鉴别诊断的三重荧光定量PCR；王然等（2021）建立了可快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌的多重荧光定量PCR。【本研究切入点】MrNV和DIV1是罗氏沼虾养殖中危害最严重的传染性病原，但目前主要是采用MrNV和DIV1的单重荧光定量PCR分别进行检测，操作繁琐，耗时费力，因此亟待建立一种能同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR，实现对罗氏沼虾WTD和DIV1D 的快速诊断及科学防控。【拟解决的关键问题】采用TaqMan-MGB探针技术建立能同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR，以提高MrNV和DIV1检测的效率，为WTD和DIV1D的临床诊断及疫情监测提供一种更简便和高效的检测方法。
1材料与方法
1.1试验材料
MrNV、DIV1、白斑综合征病毒（WSSV）、虾肝肠胞虫（EHP）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）阳性材料由广西水生动物疫病监控中心实验室保存提供；无MrNV和DIV1感染的罗氏沼虾由国家级广西南宁罗氏沼虾良种场提供；117份罗氏沼虾样品为2020年采自广西南宁、柳州和百色等地的养殖场。2×F8Fast Long PCR MasterMix、病毒基因组DNA/RNA核酸快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京艾德莱生
物技术有限公司；pGM-T载体、氨苄青霉素、大肠杆菌DH5α感受态细胞及琼脂糖购自天根生化科技（北京）有限公司；T7体外转录试剂盒及DNa I购自Fermentas公司；DL500DNA Marker、Sal I、EASY Dilution（for Real Time PCR）和OneStep PrimeScript TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自宝生物工程（大连）有限公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇等试剂均为国产分析纯。主要仪器设备为安捷伦公司的Mx3005P 荧光定量PCR仪。
1.2MrNV和DIV1二重荧光定量PCR检测方法的建立
1.2.1引物与探针设计及合成MrNV的衣壳蛋白（Capsid protein，CP）基因和DIV1的主衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）基因均为病毒主要功能基因，且其序列含有多个保守区域（Tidona et al.，1998），故选取MrNV的CP基因（MrNV-CP）和DIV1的MCP基因（DIV1-MCP）为检测目标基因。采用Primer Express v3.0分别在MrNV-CP基因（HQ287005）和DIV1-MCP基因（KY681039）的
保守区域设计多组特异性引物和TaqMan-MGB探针，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，MrNV和DIV1探针的5'端分别标记HEX和FAM荧光染料、3'端均标记MGB基团。经预试验测试筛选，各选择一套效果较好的引物及TapMan-MGB探针（表1）用于二重荧光定量PCR检测方法的建立。
1.2.2病毒核酸提取及标准品制备取阳性病料组织按1∶2（w/v）的比例加入生理盐水，匀浆，离心收集200.0μL上清液，按照病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒说明分别提取MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，病毒DNA置于-20℃冰箱保存，病毒RNA置于-70℃冰箱保存。参照黄光华等（2015）的方法，制备重组质粒pGM-T-CP MrNV和pGM-T-MCP DIV1；提取pGM-T-CP MrNV质粒DNA，以Sal I单酶切使质粒线性化后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化；以线性化pGM-T-CP MrNV质粒DNA为模板，T7体外转录试剂盒体外转录获得的RNA为检测MrNV的标准品RNA，
引物/探针Primer/probe MrNV-qF
MrNV-qR
MrNV-qP
DIV1-qF
DIV1-qR
DIV1-qP
引物序列Sequence
5'-CCACCAACAGAACTCAACCAAACT-3'
5'-ACCAACGGCATCAACCTCATT-3'如何提高情商
5'-HEX-TACCCAAGATATCACTGGTTT-MGB-3'
5'-GACAAGATTGATTTCGACCCAG-3'
5'-CAGTCATCACGGGAATACGAT-3'
5'-FAM-CCATAGGCACCGCAAA-MGB-3'
扩增产物长度（bp）Amplification product length
蒲公英的叶子150
97
表1扩增引物及探针序列信息
Table1Information of amplified primer and probe quence
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pGM-T-MCP DIV1质粒DNA则直接作为检测DIV1的标准品DNA。使用核酸蛋白分析仪分别测定MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA的纯度和浓度，并换算成拷贝数：拷贝数（Copies/μL）=6.02×1023×（ng/μL×10-9）÷（RNA长度×340）/（DNA长度×660）；采用10倍梯度稀释，将标准品系列稀释成1.0×101~1.0×108 Copies/μL，-40℃保存备用。
1.2.3二重荧光定量PCR退火温度优化参考各引物的退火温度（Tm），以1.0×108、1.0×105和1.0×101 Copies/μL等3个浓度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA等比混合液为模板，按1℃的梯度在58~ 62℃范围内分别进行二重荧光定量PCR扩增，以获得较低C t值及较高相对荧光强度增加值（ΔRn）时的退火温度最佳。
1.2.4二重荧光定量PCR检测体系优化选择1.0×108、1.0×105和1.0×101Copies/μL等3个不同浓度的标准品RNA/DNA为模板，参考黄国秋等（2017）的方法，先进行单个病毒检测体系优化；再以浓度为1.
0×105Copies/μL的2种标准品等比混合液为模板，进行二重荧光定量PCR检测体系优化，以确定最佳的引物和探针浓度。
1.2.5标准曲线建立及敏感性试验取2.0μL的10倍梯度系列稀释MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比混合液（1.0×101~1.0×108Copies/μL）为模板，以优化后的二重荧光定量PCR进行扩增，每个梯度设3个平行；参考韦信贤等（2020）的方法建立标准曲线和标准方程，并判断方法的敏感性。
1.2.6特异性试验运用优化后的二重荧光定量PCR对MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸进行检测，观察有无出现扩增曲线及C t值，评价方法的特异性。
1.2.7重复性试验以1.0×107、1.0×106和1.0×105 Copies/μL等3个梯度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比混合液为模板，分别在第1d、第7d和第14d进行重复试验，每个梯度设3个平行；计算组内及组间C t值的变异系数（CV），评价标准品和二重荧光定量PCR的稳定性。
1.3二重荧光定量PCR临床应用
取300mg临床样品按1.2.2的方法提取病毒核酸，分别用二重荧光定量PCR和套式PCR（DB45/T 942—2013和SC/T7237—2020）对117份罗氏沼虾临床样品进行MrNV和DIV1检测，比较2种方法检测结果的吻合度，评价二重荧光定量PCR对临床样品检测的可靠性和实用性。2结果与分析
2.1标准品制备及鉴定结果
分别以MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA 为模板进行PCR扩增，均可获得相应的目的片段（图1）。PCR产物经回收纯化后克隆至pGM-T载体上，经PCR筛选、测序鉴定和BLAST同源比对，证实目的片段已正确插入pGM-T载体，表明重组质粒pGM-T-CP MrNV和pGM-T-MCP DIV1构建成功。分别提取阳性克隆质粒，其中以pGM-T-CP MrNV质粒线性化DNA为模板体外转录获得的RNA浓度为7.6ng/μL，换算成拷贝数为4.3×109Copies/μL，OD260/OD280为1.93，符合标准品的要求；pGM-T-MCP DIV1质粒的DNA浓度为113ng/μL，换算成拷贝数为3.2×1010Copies/μL，OD260/ OD280为1.86，也可作为试验标准品。
2.2二重荧光定量PCR反应条件优化结果
对二重荧光定量PCR的退火温度、引物和探针使用终浓度进行优化，最终确定反应体系20.0μL：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II0.4μL，Ex Taq HS（5U/μL）0.4μL，MrNV上、下游引物MrNV-qF/MrNV-qR（10μmol/L）各0.8μL和探针MrNV-qP（5μmol/L）1.2μL，DIV1上、下游引物DIV1-qF/DIV1-qR（10μmol/L）及探针DIV1-qP（5μmol/L）各0.8μL，ROX Refe-rence Dye II（50×）0.4μL，核酸模板2.0μL，灭菌DEPC水补足至20.0μL。以健康无MrNV和DIV1感染罗氏沼虾肝胰腺组织提取的核酸为阴性对照，以灭菌DEPC水为空白对照。按照试剂盒说
明进行扩增操作，其中，反转录程序：42℃5min，95℃10s；图1MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的PCR扩增电泳结果Fig.1PCR amplification of MrNV-CP gene and DIV1-MCP gene
M：DL500DNA Marker；1~2：MrNV-CP基因；3~4：DIV1-MCP基因；NC：阴性对照
M：DL500DNA Marker；1-2：MrNV-CP gene；3-4：DIV1-MCP gene；NC：Negative
control
500bp
400bp
300bp
500bp
150bp
100bp
50bp
M12NC34NC
黄玉英等：罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
53卷
南方农业学报·1478·
荧光定量PCR 扩增程序：95℃5s ，60℃45s ，进行40个循环。
2.3二重荧光定量PCR 标准曲线
采用优化后的二重荧光定量PCR 对10倍系列梯度的MrNV 标准品RNA 和DIV1标准品DNA 同梯度等比混合液（1.0×101~1.0×108Copies/μL ）进行扩增，结果（图2）显示，高浓度标准品的扩增曲线呈典型的S 形，低浓度标准品的扩增曲线因扩增未达平台期而呈半S 形，阴性对照和空白对照均未出现扩增曲线。利用Mx3005P 荧光定量PCR 仪自带的软件进行分析，横坐标为起始拷贝数（x ）对数、纵坐标为C t 值（y ）绘制相应的标准曲线（图3），其标准曲线方程分别为：y MrNV =-3.558×lg （x ）+41.85，Eff.（扩增效率）和RSq （相关系数方值）分别为91.0%和0.994；y DIV1=-3.489×lg （x ）+43.53，Eff.和RSq 分别为93.5%和0.994。可见，应用TaqMan-MGB 探针建立的二重荧光定量PCR 对MrNV 标准品RNA 和DIV1标准品DNA 均具有很高的扩增效率，制定的标准曲线线性关系良好，能实现同时定量分析MrNV 和DIV1。
2.4
二重荧光定量PCR 的敏感性
二重荧光定量PCR 的敏感性试验结果表明，MrNV 标准品RNA 模板为100和10Copies/反应时，3个平行试验的C t 值分别为34.00、34.23、34.35和37.15、37.46、37.69；DIV1标准品DNA 模板为100和10Copies/反应时，3个平行试验的C t 值分别为34.95、34.99、35.36和37.25、38.40、38.87，且均获得明显的扩增曲线（图4和图5），说明二重荧光定量PCR 检测MrNV 和DIV1的灵敏度均低至10Cop
ies/反应。但在实际应用中，为保证检测结果的可靠性和准确性，建议以C t 值35.00为界限，当C t 值≤35.00且有扩增曲线，判定为MrNV 或DIV1阳性；C t 值>35.00同时有扩增曲线，需重复检测1次，若结果一致判定为MrNV 或DIV1阳性，重复结果无扩增曲线则判定为MrNV 或DIV1阴性。
2.5二重荧光定量PCR 的特异性
以建立的二重荧光定量PCR 对虾类常见主要病原MrNV 、DIV1、WSSV 、IHHNV 和EHP 的核酸进行检测，结果（图6）显示只有MrNV 和DIV1出现扩增曲
图2MrNV 和DIV1二重荧光定量PCR 扩增曲线
Fig.2Amplification curves of the duplex fluorescent quantita-tive PCR for MrNV and DIV1
图3MrNV 和DIV1二重荧光定量PCR 标准曲线
Fig.3Standard curves of the duplex fluorescent quantitative
PCR for MrNV and DIV1图4二重荧光定量PCR 检测MrNV 的敏感性
战国策齐策Fig.4Sensitivity of the duplex fluorescent quantitative PCR
for MrNV
图5二重荧光定量PCR 检测DIV1的敏感性
Fig.5Sensitivity of the duplex fluorescent quantitative PCR
for DIV1
荧光信号强度F l u o r e s c e n c e s i g n a l i n t e n s i t y
3
2
1
0循环数Cycle
1
10
20304010810710610510410310
2
101
阴性、空白对照Negative ，blank control
40
30
20
10阀值循环数C t
起始模板拷贝数对数lg （Number starting template copies ）
1
2
3
4
5
6
7
8
芥菜的营养价值y MrNV =-3.558×lg （x ）+41.85y DIV1=-3.489×lg （x ）+43.53
循环数Cycle
1
10
203040
荧光信号强度F l u o r e s c e n c e s i g n a l i n t e n s i t y
2
1
0阴性、空白对照Negative ，blank control
108107106105104103
孔圣102
101
循环数Cycle
1
10
203040
荧光信号强度F l u o r e s c e n c e s i g n a l i n t e n s i t y
3
2
1
0阴性、空白对照Negative ，blank control
108107106105104103
102
101
MrNV
