作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(4): 791 800 zwxb.chinacrops/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@caas
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14062
大豆突变体ygl2黄绿叶基因的精细定位
王好让1,**张勇2,**于春淼1,3董全中2李微微2胡凯凤2
张明明2薛红2杨梦平2宋继玲2王磊2杨兴勇2邱丽娟1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081;
2 黑龙江省农业科学院克山分院, 黑龙江齐齐哈尔 161606; 3东北农业大学农学院,椿萱并茂
黑龙江哈尔滨 150030
摘要: 叶片是大豆进行光合碳同化的主要器官, 其颜色与光能的捕获力和转化效率有关, 也与大豆的产量密切相
关。因此, 大豆叶色相关基因的挖掘对从光合碳同化途径解析大豆产量问题具有重要意义。黄绿叶是区别
于大豆普
通绿色叶片的突变类型, 是研究大豆叶色相关基因的重要遗传材料。本研究发现了一个黄绿叶突变体ygl2 (yel-
low-green leaf 2), 该突变体是由大豆品系GL11自然突变而来, 其黄绿叶表型可以稳定遗传。与绿叶野生型GL11相
比较, 突变体ygl2叶片中叶绿素含量极显著降低, 株高、百粒重、蛋白含量均存在显著差异。利用GL11和ygl2构
建分离群体, 遗传分析表明, ygl2的黄绿叶表型受1对隐性核基因控制, 利用分离群体将黄绿叶基因ygl2定位于2号
染色体末端SSR标记02_104到02_107之间, 区间物理距离为56.1 kb, 包含9个基因。本研究结果为大豆黄绿叶基
因图位克隆及分子标记辅助育种奠定了基础。
关键词：大豆; 黄绿叶突变体; 遗传分析; 精细定位
Fine mapping of yellow-green leaf gene (ygl2) in soybean (Glycine max L.)
WANG Hao-Rang1,**, ZHANG Yong2,**, YU Chun-Miao1,3, DONG Quan-Zhong2, LI Wei-Wei2,
HU Kai-Feng2, ZHANG Ming-Ming2, XUE Hong2, YANG Meng-Ping2, SONG Ji-Ling2, WANG Lei2,
YANG Xing-Yong2, and QIU Li-Juan1,*
1 Institute of Crop Sciences, Chine Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2 Keshan Branch of Heilongjiang Academy of Agri-
cultural Sciences, Qiqihar 161606, Heilongjiang, China; 3 College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang,
China
Abstract: Leaf is the main organ of photosynthetic carbon assimilation in soybean, and its color is not only related to the trapping
power and conversion efficiency of light energy, but also cloly related to the yield of soybean. Ther
efore, the mining of soybean
leaf color-related genes is of great significance to analyze the yield of soybean from the pathway of photosynthetic carbon assimi-
lation. Yellow-green leaf is a mutation type different from common green leaves of soybean, and it is an important genetic mate-
rial to explore the genes related to leaf color of soybean. In this study, we found a yellow-green leaf mutant ygl2 (yellow-green
leaf 2), which was naturally mutated from soybean strain GL11, and its yellow-green leaf phenotype could be stably inherited.
Compared with the green leaf wild type GL11, the leaf chlorophyll content of mutant ygl2 decread significantly, and there were
significant differences in plant height, 100-grain weight, and protein content. The gregated population was constructed by GL11
and ygl2. Genetic analysis showed that the yellow-green leaf phenotype of ygl2 was controlled by a pair of recessive nuclear genes.
The yellow-green leaf gene ygl2 was located between SSR markers 02_104 and 02_107 at the end of chromosome 2 using the
isolated population, with an interval physical distance of 56.1 kb, and contained nine genes. The results laid a solid foundation
for map-bad cloning and molecular marker-assisted breeding of yellow and green leaf genes in soybean.
Keywords: soybean; yellow-green leaf mutant; genetic analysis; fine mapping
本研究由国家自然科学基金项目(31630056)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(S2021ZD02)资助。
The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31630056) and the Central Public-intreest Scientific Institu-
tion Basal Rearch Fund (S2021ZD02).
*通信作者(Corresponding author): 邱丽娟, E-mail: qiulijuan@caas
**同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 王好让, E-mail:
Received (收稿日期): 2021-04-16; Accepted (接受日期): 2021-07-12; Published online (网络出版日期): 2021-08-06.春水映梨花
URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20210806.1017.002.html
792作物学报第48卷
叶片是植物光合碳同化的主要器官[1], 对植物的生长发育起着至关重要的作用[2]。叶色突变是高等植物中普遍存在且易于识别的表型。根据叶片的突变颜色, 这些突变材料可分为白叶、黄叶、淡黄绿叶、淡绿叶、滞绿叶、白黄叶、白绿叶、紫叶、斑叶、条纹叶、类病斑叶等类型[3]。叶色突变通常会影响植物的光合作用效率, 导致植物生长不良并造成经济损失。
叶色通常由叶绿体中的叶绿素决定[4]。叶绿素是高等植物捕光和驱动反应中心电子传递的主要光合色素, 在光合作用过程中对光能的获取和能量的传递起着重要作用[5]。叶绿素合成是一个多步骤的过程,
需要多种酶的参与[6], 其代谢途径中的任何基因发生变异都可能导致叶绿素代谢紊乱, 进而改变叶绿体中的色素比例, 最终可能会导致植物叶色发生改变。黄叶突变体的一个共同特征是叶绿素总量减少, 从而降低了光合作用效率。在大豆中, 大多数叶色突变体总叶绿素含量下降30%~66%, 致死黄色突变体的叶绿素含量下降幅度更大, 在大豆psbP 突变体中, 叶绿素含量就降低了大约92% [7]。叶片光合作用是植物生长发育和生存的重要过程, 也是农作物产量形成的基础[8]。满足不断增长的全球人口对粮食的需求, 需要提高作物生产力, 通过提高光合作用效率可以获得巨大的收益[9]。
早在20世纪30年代, 叶色突变体相关研究就已经被报道。1933年, 陆地棉芽黄突变体[10]被报道, 由于突变体的叶色的明显变异, 导致了棉花减产, 严重时致使棉花植株死亡, 因这种突变体不利于农作物的生产, 没有引起人们的重视。直到1948年, 利用X射线诱变获得的小球藻失绿突变体wcm60 [11]验证了原卟啉是叶绿素合成的前体, 叶色变异才逐渐开始得到科学家的重视。近几年, 叶色突变体主要应用于光合色素的生物合成、叶绿体发育以及光合作用的调控机制等基础研究[12-13]。在高等植物中, 叶色突变体作为一种易于识别的表型已被广泛地分离出来。近年来, 在拟南芥[14]、烟草[15]、番茄[16]、水稻[17]、小麦[18]、大麦[19]、玉米[20]、大豆[21]等多种植物上发现了叶色突变体。
到目前为止, 在大豆中, 约60个叶色突变体被报道, 其中28个突变体的表型是核遗传, 其余为细胞质遗传[8,21]。这些突变体表现出多种多样的表型, 它们被分为致死型和非致死型2类。y3、y11、y16、y18/y18_1、y18_2、y19、y21、yl_PR350、psbP和CD-5等突变体由于植株过早死亡而被认为是致死
黄叶[8,22-28]。其中叶绿素缺乏突变体y22被认为是有条件致死[26], 因为它在温室中产生种子, 然而, 突变植株在田间开花后不久就会死亡[26]。一些突变体如y6、y8、y10和y13在幼苗时长出黄绿色的叶子, 但在后期产生了越来越多的叶绿素, 在视觉上与正常的绿色植株难以区分[29-30]。在大豆中已知的28个典型的黄叶突变体中, 有16个已被定位到大豆染色体上, 主要分布于第1、2、3、6、10、13、14、15、17号染色体[21], 其中只有6个基因yl1、YL2/G、y11、CD-5、Tic110、psbP被克隆[8,21,23,31]。虽然已报道的黄绿叶基因Tic110也是被定位在2号染色体, 但是不在本研究的定位区间内。
本研究从大豆品系GL11后代中分离出一个黄绿叶突变体ygl2, 利用BSA-Seq和图位克隆相结合的方法, 将控制黄绿叶的基因定位在包含9个候选基因的56.1 kb区间内。本研究为大豆黄绿叶基因克隆、解析光合作用的调控机制和培育高光效大豆品种奠定了基础。
1材料与方法
1.1群体构建及表型调查
黄绿叶突变体ygl2来源于绿叶野生型GL11的自然变异, 经7代的自交筛选, ygl2的黄绿叶表型已稳定遗传。2017年夏, 在黑龙江省克山县以黄绿叶突变体ygl2为母本, 野生型GL11为父本进行杂交获得种子, 同年在海南加代, 获得F1种子; 2018年夏, 在克山种植亲本ygl2和GL11及F2群体, 群体包含567个单株;
同年在海南加代, 种植亲本ygl2和GL11及F3群体, 群体包含1440个单株。田间种植行长3 m, 行距0.45 m, 株距0.1 m。在成熟期参照《大豆种质资源描述规范和数据标准》[32]考察亲本及群体植株株高、主茎节数、单株粒数、单株粒重、百粒重等性状; 用近红外光谱仪MPA测定大豆籽粒蛋白和脂肪含量。
1.2光合色素含量的测定
在田间第4个三小叶展开时(V4期), 分别随机取10株长势一致的黄绿叶亲本ygl2和绿叶亲本GL11的第3个三出复叶的中间叶片。每个材料设置3个重复, 每个重复从相同的植株上取0.2 g新鲜叶片, 放入5 mL的95%乙醇溶液中, 于4℃避光浸泡48 h至叶片完全脱色, 最终获得叶绿素和胡萝卜素提取液。用紫外分光光度计UV-1800测量提取液在
第4期王好让等: 大豆突变体ygl2黄绿叶基因的精细定位 793
波长470 nm、649 nm和665 nm下的吸光值, 每个样品测量3次。叶绿素a的浓度(mg L–1) = 13.95× A665-6.88×A649, 叶绿素b的浓度(mg L–1) = 24.96× A649-7.32×A665, 胡萝卜素的浓度(mg L–1) = (1000× A470-2.05×C a-114.8×C b)/245, 光合色素含量 =色素浓度×提取液体积×稀释倍数/样品鲜重, 式中, A665、A649和A470为吸光值, C a和C b分别为叶绿素a 和叶绿素b的浓度。
1.3 DNA的提取
以CTAB法提取亲本、F2单株及F3单株叶片DNA。取大约100 mg大豆新鲜叶片置于2.0 mL离心管中并向管中加入1颗5 mm钢珠, 在液氮中迅速冷冻后放入高通量组织研磨机中打样20 s, 于通风橱下向每管中加入800 μL CTAB溶液并震荡混匀, 65℃烘箱中处理1 h, 每20 min颠倒混匀1次; 冷却至室温后加入800 μL DNA提取液, 颠倒混匀, 4℃, 12,000⨯g离心10 min; 吸取650 μL上清至2.0 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿混匀, 4, 12,000
℃⨯g离心10 min; 吸取600 μL上清液至1.5 mL离心管中, 加入等体积的异丙醇, 在-20℃冰箱中冷冻30 min, 4, 12,000
℃⨯g离心10 min, 弃上清。用75%无水乙醇洗涤2次, 4, 12,000
℃⨯g离心10 min, 弃上清, 置于超净台中风干15 min。加入100 μL ddH2O溶解DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量, 使用NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度计检测DNA浓度, -20℃保存。
1.4混池测序及数据分析
采用BSA (Bulked Segregate Analysis)法构建不同叶色的混合池, 从ygl2×GL11的567个F2单株中选取黄绿叶突变单株和正常绿叶单株各30株, 用打孔器剪取等质量的叶片混合, 提取混样基因组DNA, 构建黄绿叶池和绿叶池。将亲本与2个叶色池DNA 进行重测序, 亲本和2个叶色池的测序深度分别为10×和30×, 参考基因组为Wm82.a2.v1[33]。
在分析重测序数据之前, 先要对SNP数据进行筛选, 筛选标准如下: 首先, 筛选出单个基因型的位点; 其次, 筛选出测序读取支持度大于4的位点; 再次, 筛选出2个叶色池之间不同基因型的位点和黄绿叶池基因来自于黄绿叶突变体ygl2的位点; 最终得到高质量、高可信度的SNP位点。机械设备管理制度
欧式距离(Euclidean Distance, ED)
算法, 是利用
重测序数据筛选2个性状池之间存在显著差异的标
记, 然后评估与性状相关联区间的方法[34]。理论上,
通过BSA法构建的2个叶色池, 除叶色性状相关位
点外, 其他位点几乎一致, 因此, 其他性状位点的
ED值应趋向于0。ED方法的计算公式如下所示: ED=
式中, Amut和Awt分别表示碱基A在黄绿叶池和绿
叶池中的频率; Cmut和Cwt为碱基C在黄绿叶池和
绿叶池中的频率; Gmut和Gwt为碱基G在黄绿叶池
和绿叶池中的频率; Tmut和Twt为碱基T在黄绿叶
池和绿叶池中的频率。
1.5黄绿叶相关基因定位
从大豆数据库(soyba/)中选择864个
均匀分布在大豆20条染色体上的SSR标记[35]。利用
上述SSR标记鉴定亲本基因型, 筛选出亲本间具有
多态性的标记并进一步鉴定2个叶色池的基因型,
得到与黄绿叶性状连锁的标记。从ygl2×GL11的F2
群体中选择叶色突变性状的植株(133株), 应用目标
我与祖国共成长
基因的连锁标记对突变基因进行定位。根据基因定
位结果, 从ygl2×GL11的F2群体中选择目标基因染
色体区段为杂合的单株, 自交后构建残余杂合系群
体(1440株), 从中筛选交换单株, 对目标基因进行精
细定位。PCR反应体系(10 μL): DNA (50 ng μL–1) 2.0
μL, 10× Taq buffer 2.0 μL, SSR引物(2 μmol μL–1) 1.5
头围测量方法
μL, dNTPs (10 mmol μL–1) 1.5 μL, Easy Taq酶(全式
金生物科技有限公司) 0.2 μL, 无菌水2.8 μL。PCR
反应程序: 95℃预变性5 min; 95℃变性2 min, 55℃退
火30 s, 72℃延伸30 s, 34个扩增循环; 72℃延伸5 min;
4℃保存。扩增产物中加入2 μL 6× Loading buffer,
95℃水浴处理5 min, 迅速置于冰水混合物中, 完全
冷却后-4℃保存备用。通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶
对PCR扩增产物进行基因型鉴定。
1.6候选基因预测
根据定位区间物理位置查询SoyBa (
www.soyba/)获得基因注释。使用Phytozome
v12.1获得的定位区间内基因的表达模式, 使用
TBtools生成热图。
1.7荧光定量PCR分析
用于荧光定量的引物其长度一般在50~250 bp。
采用TaKaRa公司SYBR试剂盒(Power SYBR Green
PCR Master Mix)进行荧光定量PCR试验。利用ABI
PRISM 7300荧光定量PCR仪对内参及候选基因进
行qRT-PCR扩增, 设置3次重复。PCR反应体系为:
5 μL稀释25倍的cDNA稀释液, 2 μL基因特异性引
794
作 物 学 报 第48卷
物(2 μmol μL –1), 0.4 μL ROX 校正液, 2.6 μL ddH 2O, 10 μL SYBR Premix Ex Taq (RR420A, TaKaRa)。qRT-PCR 扩增程序如下: 95℃预变性5 min; 95℃变性15 s, 60℃退火延伸1 min, 72 31 s, ℃循环40次; 60℃恒定升温至95, ℃获取溶解曲线。使用GmActin 作为内参基因(F: 5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCAT C-3'; R: 5'-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'), 计算候选基因相对表达水平。计算公式为
Rn=2[Ct(内参基因)-Ct(候选基因)]。
幼儿园一日常规
2 结果与分析
2.1 突变体ygl2的表型特征及主要农艺性状
田间种植情况下, 野生型GL11在正常成熟期前叶片均呈绿色, 而突变体ygl2在整个生育期均表现为黄绿色(图1)。成熟期时调查叶色突变体ygl2和野生型GL11的主要农艺性状(图2)发现, 突变体和
野生型在节数和脂肪含量2个性状方面没有显著差异; 而在株高、熟期、百粒重、蛋白含量等农艺性状存在显著差异, 其中, 黄绿叶突变体的株高(91.3 cm)较野生型(63.8 cm)高43.1%, 百粒重(30.8 g)较野生型(22.7 g)增加35.7%, 蛋白质(42.7%)较野生型(37.6%)增加 5.1%, 单株粒数(64粒)较野生型(89.3粒)减少28.3%, 单株粒重(17.2 g)较野生型(22.8 g)降低24.6%。表明叶色变异对株高及产量产生显著影响。
2.2 黄绿叶突变体的叶绿素含量
ygl2在苗期总叶绿素含量为1.15 mg g –1 FW, 比野生型降低28.7%; 叶绿素a 含量为0.85 mg g –1 FW, 比野生型降低19.8%; 叶绿素b 含量为0.3 mg g –1 FW, 比野生型降低28.6%; 类胡萝卜素含量为0.19 mg g –1 FW, 与野生型没有差异, 叶绿素a /叶绿素b 的值, 与野生型相比显著升高(图3), 表明叶色突变的原因是叶绿素含量的下降。
图1 突变体ygl2与野生型GL11表型 Fig. 1 Phenotypes of ygl2 mutant and wild type GL11
A: 突变体ygl2和野生型GL11苗期植株表型; B: 突变体ygl2和野生型GL11鼓粒期叶片表型。标尺为4 cm 。
A: edling phenotype of mutant ygl2 and wild type GL11; B: leaf phenotype of mutant ygl2 and wild type GL11 at grain filling stage. Bar: 4 cm.
图2 突变体ygl2与野生型GL11的主要农艺性状
Fig. 2 Main agronomic traits of between ygl2 mutant and wild type GL11
误差线表示标准差; *和**分别表示在0.05、0.01水平显著差异。 Error bar indicates standard error (SE); * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
图3 苗期突变体ygl2与野生型GL11叶片中光合色素含量 Fig. 3 Photosynthetic pigment contents in leaves of ygl2 mu-tant and GL11 at edling stage
野生型GL11和突变体ygl2在第4个三小叶展开时(V4期)叶片中光合色素含量及比值。误差线表示标准差; *和**分别表示在0.05、0.01水平显著差异。
The content and ratio of photosynthetic pigments in the leaves of wild type GL11 and mutant ygl2 at the fourth trifoliolate stage (V4 stage). Error bar indicates standard error (SE); * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
第4期学习催眠
王好让等: 大豆突变体ygl2黄绿叶基因的精细定位 795
2.3 黄绿叶突变性状的遗传分析
用野生型GL11与黄绿叶突变体ygl2杂交, F 1
呈现正常绿叶表型; 在F 2群体中出现明显的叶色性状分离。567个F 2单株中, 正常绿叶单株412株, 黄绿叶单株155株。经卡方测验分析(表1)表明, 正常绿叶植株与黄绿叶植株比例符合3∶1的理论分离比(P
>0.05), 表明ygl2的黄绿叶性状受1对隐性核基因控制。
2.4 黄绿叶基因候选区间的鉴定
为定位黄绿叶突变基因, 在ygl2×GL11的F 2代群体中对黄绿叶苗和绿叶苗的叶片进行取样, 分别构建了黄绿叶单株和绿叶单株的DNA 混池, 并将混 池及亲本DNA 进行了BSA 重测序。
在测序数据的综合分析中, 利用2个叶色池之间不同基因型的SNP 位点, 统计2个叶色池中每个碱基的深度, 计算每个位点的ED 值。为消除背景噪音, 对原始ED 值进行乘方处理[34], 本试验以ED5作为关联值, 然后用SNPNUM 方法拟合ED 值。最终得到29,872个高质量、高可信度的SNP 位点。为消除背景噪音, 将所有的位点拟合值的中值加3倍
的标准差作为关联阈值进行分析, 计算得到的关联阈值为3.41。根据关联阈值判定, 在2号染色体上得到1个46,728,549到48,572,200的区域(图4), 总长度为1.84 Mb, 包含453个基因。
2.5 突变基因的分子标记定位
利用随机分布在大豆全基因组中的865个SSR 标记对亲本间多态性筛选, 筛选出51个多态性标记, 占筛选标记总数的 5.9%。用这些多态性标记检测ygl2×GL11 F 2群体的黄绿叶池和绿叶池, 2个叶色池之间仅有2个SSR 标记具出多态性, 分别是02-117和02-122, 均位于2号染色体上, 并且均在ED 关联的区间
内。在这2个连锁标记的两侧选取35个新的SSR 标记进行亲本间多态性的筛选及F 2后代混池中进行连锁标记筛选, 将基因初定位在2号染色体上, 于02-55和02-130标记之间, 大小1.167 Mb, 共包含170个基因。初定位的区间为46,856,818到48,453,942之间, 位于ED 关联区间的内部, 因此初定位得到的区间准确可信。
为进一步验证和缩小定位区间, 利用标记02_55与02_130鉴定了ygl2×GL11的1440个F 3单
表1 突变体ygl2与正常绿色品种杂交F
2的叶色分离
Table 1 Leaf color paration of hybrid F 2 between mutant ygl2 and normal green variety 组合名称 Combination
总株数 Total number of
plants
绿叶植株数 No. of green leaf plants
黄绿叶植株数 No. of yellow-green leaf
plants
期望比 Expected ratio
卡方值 χ2 3:1
P
ygl2×GL11 567 412
155
白色娃娃鱼3:1 1.529 0.199
图4 利用ED 关联方法鉴定黄绿叶基因候选区间
Fig. 4 Identification of candidate regions of yellow green leaf gene by ED association method
横坐标为染色体名称, 彩色的点代表每个SNP 位点的ED 值, 黑色的线为拟合后的ED 值, 红色的虚线代表显著性关联阈值。
The abscissa is the name of the chromosome, the colored dot reprents the ED value of each SNP locus, the black line is the fitted ED value, and the red dotted line reprents the significant correlation threshold.
