生命科学
Chine Bulletin of Life Sciences
第19卷 第3期2007年6月
Vol. 19, No. 3
Jun., 2007
收稿日期：2006-11-09；修回日期：2007-02-06基金项目：科技部国际合作重点项目(2004DFA05000)
作者简介：孙浩华(1983－)，男，硕士研究生；陈集双(1962－)，男，教授，博士生导师，*通讯作者，E-mail:chenjs@zist.edu
文章编号 ：1004-0374(2007)03-0338-08
大豆花叶病毒研究进展
孙浩华，薛 峰，陈集双*
(浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018)
摘 要：大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是在世界范围内广泛分布并普遍发生的病毒病害之一，导致大豆严重减产和种质衰退。这引起了国内外许多学者的科研兴趣，研究内容涉及SM V 株系
划分与发生分布、传播流行方式、寄主上的症状和影响因素、基因组结构组成及各基因功能、植物生理生化抗性、大豆SMV 抗性遗传育种等各方面。本文综述了近年来国内外SMV 的科研方向和进展，旨在为进一步的研究提供依据。
关键词：大豆花叶病毒；寄主症状；基因组结构；基因组功能；生化抗性；遗传育种中图分类号：S432.41; S565.103.2 文献标识码：A
Advances in study on Soybean mosaic virus (SMV)
SUN Haohua, XUE Feng, CHEN Jishuang*
(Institute of Bioengineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)
Abstract: Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most prevalent and important plant viral pathoge
ns and pathogenic on some soybean [Glycine max (L.)Merr.] crops or cultivars worldwide. Infection by SMV may result in vere yield loss and strain quality reduction. Due to outbreaks of SMV dia and its destructivity, many scholars have great interest in some fields that broadly involve the classification, distribution and prevalence of SMV strains, viral infection and host symptoms, structure and functions of viral genome, physiological and biochemical resistance of hosts, resistance inheritance and resistant cultivar breeding, and so on. We make a summary of relative study in order to provide foundation for further rearch on SMV and other Potyvirus members.
Key words: Soybean mosaic virus (SMV); host symptoms; structure of genome; functions of genome; biochemical resistance; genetic breeding
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)由Clinton 于1915年在豆科(Leguminosae)大豆(Glycine max (L.) Merr.)中发现，并于1921年由Gardner 和Kendrick 为之命名[1]，在病毒分类学上属于马铃薯Y 病毒属(Potyvirus )，其稀释限点为10-2－10-4，钝化温度为50℃－65℃，体外室温下保存期为1－4d ，4℃下为14－15d 。病毒粒体为弯曲杆状，形态单一，长
宽分别为630－750 nm 和13－19 nm ，在植物寄主细胞中可以形成风轮状内含体。SMV 的蛋白质及RNA 只有一种成分，提纯后的病毒有紫外光吸收，最高峰值为258－263nm ，最低值为240－244nm 。1 SMV 株系划分与发生分布
依据致病性差异，Cho 和Goodman [2]于1979年首次鉴定了SMV 7个株系(G1－G7)，以及后来的
339第3期孙浩华，等：大豆花叶病毒研究进展
G7A、C14两个株系。其后，日本报道了A－E五
个株系。我国学者也对中国SMV株系划分作了研究
报道，但分类结论不统一，例如江苏的S
A －S
H
株
系，湖北的S1－S2 株系，东北的1－3号株系等。Shang等[3]对黄淮区大豆花叶病毒株系组成与分布做了全面的研究，将黄淮地区8省市202个毒株划分为7个株系(y1－y7)。y1及y2为弱毒株系，仅侵染感病品种，主要发生在江苏、山东、河南、河北、安徽五省及北京等地区；y3、y4、y5为中毒株系，分别侵染感病和中抗品种，主要分布在山西省；y6 和y7为强毒株系，除能侵染以上品种外，还能侵染
高抗品种，主要分布在山东、河南、河北三省。陕西省弱毒株系、中毒株系则各占一半。王修强等[4]将黄淮和长江中下游地区SMV划分为SC1—SC8 8个株系群，弱毒株系群SC1和SC3在黄淮及长江中下游地区分布较广，而强毒株系群SC8仅在南京地区发现。
综合考虑地域分布及基因突变等因素，美国、日本等国将全国SMV毒株统一划分，以利于进一步研究；而我国在SMV株系划分上没有统一标准，这会给今后深入研究带来困难。笔者认为，我国各相关研究机构有必要建立合作和交流机制，收集交换SMV毒株及抗原，建立鉴别体系，以达到统一划分全国SMV株系的目的。
2 SMV传播流行方式、影响因素及病状特征SMV初侵来源主要是带毒种子[5]，病毒会存在于种胚与子叶中(花粉携毒)，毒力能保持两年，甚至更久，带毒种子发育成幼苗后，叶、茎都可能带有病毒并表现出相应症状。由于SMV很易接触传染，所以无论发病与否，都可能成为田间再侵染的毒源。
携毒蚜虫也是SMV自然传播的另一个重要因素，能造成病毒再次传播，具有非持久性特征[6-7]。Ren等[8]研究表明，大豆叶片软毛密度与蚜虫传染关系密切。高密度的软毛虽然不能明显的影响病毒传播速度，却会抑制蚜虫的活性，延缓SMV达到最大影响范围的时间。由于高密度软毛大豆品种成熟较晚，故产量较普通大豆要低[9]。Hill等[10]在以前品种(Dowling，Jackson等)的基础上培育筛选出了能抵抗蚜虫的大豆新品种，以减轻病毒的虫媒传染。气温和雨量等因素也影响蚜虫发生，从而间接影响
病毒传播。高温偏旱有利于蚜虫繁殖，而暴雨的冲刷作用则可以减轻蚜虫病害。此外，病害的发生与流行还与豆种抗性、播种时间、播种方式以及染毒豆种脱毒程度等因素有关[11]。
由于受大豆品种、地域、病株环境条件、传播媒介、播种期等诸多因素的影响，SMV在大豆植株上所表现的症状也就非常复杂。廖林[12]在不同环境条件下，采用分期播种，不同发育期接种等方法，将被SMV侵染后的大豆植株病状归纳为以下11种：褐斑种粒、轻型花叶、花叶、黄斑花叶、曲叶、疤斑叶、畸型叶、卷叶、皱缩、矮化畸荚、顶枯致死。此外，植株株高、叶面积、叶绿素、叶茎根干重、单株荚数、分支数等生长指数也有下降，常伴有生长延滞，成熟缓慢等症状。
SMV从宏观病变特征到超微观病变特征[13]，从植株外观表现到其细胞、亚细胞结构变化的逐步深入研究，以及从植株自身出发防止媒介传播的科学探索，都为今后进一步研究SMV开辟了新的思路。此外，作为专性寄生生物，病毒最大的进化瓶颈是寄主生物。SMV的寄主范围相对较小，主要侵染豆科植物，但在其他寄主上也有寄生和适应性进化[14]，其寄主症状往往也具有一定差异。只有在比较了不同寄主上SMV的寄主生物学特征后才能充分了解SMV的侵染机制。
3 SMV基因组及分子检测
SMV基因组为单链正义链RNA，长约104个核苷酸，5'端有共价键结合的基因组蛋白，3'端有一个Poly(A)尾巴。整个基因组按一个ORF翻译，产生一个多聚蛋白，约3 066个氨基酸。该蛋白切割加工
后形成不同功能的成熟蛋白[15] ：P1、H C-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb和CP。翻译起始于基因组第一个AUG密码子，终止于9333位点处的UAA[16](图1)。
不同Potyvirus成员在基因组大小、编码多聚蛋白大小、序列同源性以及二级结构等方面都存在较大的差异，即便同为SMV，不同的分离物或株系其基因组也略有不同。例如，除整个基因组序列差异外，Potyvirus基因组3'-NTR普遍存在与负链RNA复制起始有关的发卡状二级结构，在SMV基因组中也存在这种结构，但与其他成员无论序列信息还是结构分配都有差异。C h e n等[14]根据Potyviridae家族序列一致性设计了引物S primer，并在有花叶症状的半夏(Pinella ternata)上检测到了Potyvirus属病毒。将其RNA基因组3'末端核苷酸序列(含CP基因)与其他SMV的CP基因核酸序列做同源性比较和分子进化分析后发现该病毒与Potyvirus属有非常近的亲缘关系。另外，该病毒在粒子大小、形态以及引起大豆寄主病变等方面都
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与SMV 相似，也能与SMV 中国分离物抗血清有强烈免疫学反应，充分表明该病毒即为SMV 的某一株系。这是SMV 能侵染天南星科植物的首次报道，并在之后的研究中得到了进一步证实[17]。
由于已经清楚了解了SMV 病毒的基因组组成及结构，所以研究该病毒在不同寄主和相同寄主的不同株系和分离物时，应在血清学检测的基础上[18]，利用全基因组或者部分基因组同源性比较和分子系统学分析方法[19]，系统而准确地对病毒进行鉴定和分类。SMV 的CP 蛋白保守区包括CP 核心区和C 端氨基酸序列，株系间变异较小，往往被当作Potyvirus 属内各种的分子分类依据。但N 端区域变化较大，甚至有种间重组发生，因此就CP 基因高变区设计PCR-RFLP 检测或者进行测序可以在种际水平区分Potyvirus 病毒。在分子和血清学鉴定上，可以采用提纯或经原核表达的SMV 病毒外壳蛋白经SDS-PAGE 分离，免疫后制备抗血清，通过确认Western blot 特异性反应强度以及检测抗血清效价，
结合RACE 和DNA 测序所得到病毒基因组全序列信息，在获得大量Potyvirus 成员基因组全序或CP 蛋白基因序列基础上进行序列比较分析，从而获得区分SMV 与其他Potyvirus 成员的依据。通过分析比较其基因组差异，发现基因重组和重排的进化规律，最终也能在分子生物学水平上掌握病毒进化和侵染的机理。4 SMV 基因组编码的蛋白产物功能
在SMV 基因组编码的蛋白产物功能方面，国内外研究人员作了大量的研究，现结合Potyvirus 属其他成员比较分析得出一些推测性的结论(表1)。4.1 VPg 功能区域 该区域位于基因组5'末端，它
可与宿主成分发生直接或间接的相互作用[20]，同时也是VPg/HC-Pro 和VPg/VPg 间相互作用所必需的成份[21]，控制病毒侵染宿主并积累以及长距离运输[22-23]。相对于3'-NTR 而言，与VPg 相连的5'-NTR 的二级结构并不稳定，前者可在基因组复制合成负链RNA 的过程中与病毒RdRp 相互作用；而后者所包含的帽子结构依赖型调控元件，可以促进基因组翻译的内部启动[24]。
4.2 P1功能区域 P1蛋白是多聚蛋白中最不保守的一个蛋白[25]。作为顺式活性组装因子或调控因子[23]，P1和HC-Pro 、NIa-Pro 都是病毒特异性蛋白酶，在病毒复制、翻译起始及表达产物加工过程中担当重要的工具酶角色，具有顺式激发基因组扩增的活性并协助病毒在植物细胞间的运输。P1重要位点大部分位于其N 端的区域上，而靠近C 端的部分则包含了将P1从多聚蛋白上切下的蛋白酶区，并不受插入外源蛋白基因的影响。P1还会增强HC-Pro 表达水平，辅助HC-Pro 介导抑制RNA 沉默，克服
病毒抗性机制，在决定宿主范围上起了一定作用[25]。4.3 HC-Pro 功能区域 HC-Pro 生物学活性常以蛋白寡聚物(二聚体、四聚体等)形式来实现，协助病毒传播，具有顺式蛋白酶活性[26]。HC-Pro 能结合RNA 并与宿主蛋白相互作用，并且是转录后基因沉默(PTGS)的负调控因子，HC-Pro 区域存在6个病毒传播所必需的位点，与抑制RNA 沉默有关[22-23]。
HC-Pro 也是影响蚜虫传播的关键性蛋白，它会在病毒粒子与蚜虫口器间形成“桥梁”。HC-Pro 二聚体一侧(C 末端)与病毒粒子CP 发生相互作用，另一侧(N 末端
)
与蚜虫口器上颚刺针作用，两者作
图1 SMV 基因组结构和蛋白切割位点
VPg: Viral protein genomic-linked; P1: Protein 1; HC-pro: Helper component protea; P3: Protein 3; CI: Cylindrical inclusion;NIa: Nuclear inclusion a; NIb: Nuclear inclusion body; CP: Coat protein
长方框：编码多聚蛋白的基因组序列；5'-和3'-网格区：非编码区；基因组中间位于CI 两侧的小网格区：6K 1和6K 2两个蛋白；方框上方数字：各成熟蛋白产物的起始核苷酸位点；方框下的数字和字母：各蛋白产物推测的大小和切割位点。根据黎昊雁等[16]，SMV 杭州分离物，略有改动
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用强弱决定了病毒在蚜虫刺针上的结合力[26-27]。
另外的研究表明，HC-Pro中心区域影响病毒长距离运输，从而HC-Pro蛋白也被认为是SMV长距离运输和控制病毒宿主范围的相关因子[28]，其N端区域与症状感应、基因组扩增、病毒积累、蚜虫传播有关；C端区域与细胞间运动、蛋白酶水解活性和自动催化功能有关[29]。CP和HC-Pro的保守区分别为三组份氨基酸模体(Asp-Ala-Gly，DAG)和富含Cys区域N末端的Lys模体(KITC)。HC-Pro的Lys模体类似CP-N末端DAG中的Gly，HC-Pro中的Lys对SMV辅助成分活性、蚜虫传播和毒力调控起了关键的作用。但是，Urcuqui-Inchima等[30]对HC-Pro的N 末端富含Cys区域进行点突变来检测这些突变对HC-Pro蛋白自身作用的影响，结果显示并无显著影响，说明这个区域不是该蛋白相互作用的关键部位，而只可能在HC-Pro蛋白自身折叠时有重要的结构作用。
卡特尔Lim等[31]利用抑制匀霉素磷酸转移酶基因沉默来增强大豆匀霉素抗性体细胞胚(HR-Ses)的恢复，稳定转基因表达。带有SMV HC-Pro的转基因植物和被SMV侵染的转基因植物中GUS报告蛋白表达量
要比其他转基因植物高。该研究表明HC-Pro抑制DGIs机制的形成(DGIs会导致病毒侵染叶片，使叶片萎黄，如是同类病毒侵染则会产生抗性)[32] ，与病毒系统侵染、症状表现以及作为基因沉默抑制因子抑制RNAi等有关[33]。
4.4 P3区域 P3的C末端与症状表现有关，并且在一些Potyvirus成员中被确认为是无毒决定子[34]，在一定程度上也决定了病毒侵染的宿主范围[35]。4.5 6K1和6K2功能区域 这两个区域分别位于CI区域两侧，各自的N末端都与病毒复制和膜结合有关，通过与膜结合将NIa基因产物锚定在膜上[36]。6K
1
中
心区具体功能未知[37]，6K
2
中心的疏水区可能与膜结合功能和病毒侵染性有关，可以从时间和空间两个方面去调控病毒复制和运输复合物与膜的结合。该蛋白也可以影响复制复合物的形成。这些复合物会与多聚蛋白相互作用，使NIa-Pro易于从位点处切割，从而间接促进病毒侵染。Ｎ末端Val5帮助病毒与内质网结合，锚定复制位点处的复制复合物，对病毒在脉管
表1 SMV基因组功能和蛋白产物
基因组各区域核酸或氨基酸序列特征基因产物功能VPg与宿主成分及多聚蛋白相互作用病毒基因组复制；影响病毒长距离运输
5'-NTR“U C AAC AC AAC AU”，包含帽子结构依赖型基因转录或复制，促进翻译的内部启动；症状表现调控元件
P1“GxSG”，最不保守的蛋白丝氨酸蛋白酶活性；基因产物加工；连接RNA；
寄主抗性；细胞间运动HC-Pro保守基序“CCC, KITC”，N末端富含Cys半胱氨酸蛋白酶；自动催化；蚜虫传播能力；
症状表现；寄主抗性；病毒积累；长距离运输；
转录后基因沉默抑制物P3蛋白高变区加工翻译产物；寄主症状；病毒传播；宿主决定子6K
1
富含疏水氨基酸序列具有膜结合活性；可能与基因组复制有关CI保守的核苷酸结合基序“GAVG SGKST”基因组复制解旋酶作用；细胞膜结合；病毒在
寄主细胞间运动
6K
2
富含疏水氨基酸序列内质网结合因子，具有膜结合活性；参与基因组
复制
NIa-VPg NM Y，具有N LS，富含芳香族氨基酸基因组复制的引物；参与复制型式RNA的切割和
基因组复制；病毒运动NIa-Pro GxCG，His-Asp-Cys组成催化活性区，丝氨酸胰蛋白酶活性，参与成熟多聚蛋白的酶解具有NLS加工
NIb保守基序“GDD”，“GNNSGQ PSTVVDNT”，基因组复制RdRp活性；参与病毒复制；促进酶与具有NLS底物结合；维持核酸结构；症状表现CP保守基序“D A G”，基因组中唯一的结构蛋白病毒基因组核苷酸(病毒粒子) 包装；蚜虫传播；
病毒胞间长距离运输；病毒形成和症状表现；
寄主范围(寄主决定因子) 3'-NTR富含“A U”基因组复制和转录；稳定病毒RN A，防止降解；
与病毒RdRp相互作用；症状表现
根据Riechmann等(1992)，有修订和增补。
342生命科学第19卷中长距离运动起了重要作用 [37]。SMV各蛋白中，只
有6K
1、6K
2
和P3三个蛋白能以序列特异性方式与
RNA结合，同时与宿主细胞RNA相互作用。
4.6 CI功能区域 CI功能产物能促进病毒胞间运输和基因组复制，有助于病毒通过植物脉管系统进行长距离运输。人工构建的CI突变体能形成原生质膜连接结构，却不能与病毒粒子或转运复合物相互作用[38]。定点突变表明，CI中心区域与病毒组装、胞间运输和基因组扩增有关，其N端[含原型超家族Ⅱ型(SF2)螺旋酶区域]与病毒长距离运输和蚜虫传毒有关，C端与病毒长距离运输有关[37]，同时该酶作为一种RNA解旋酶，可使RNA解螺旋，对病毒复制和胞间运输有一定作用。
4.7 NIa功能区域 该区域有两个活性部分，具有内切加工活性和顺式蛋白裂解活性，NIa-VPg在这点上显示了比NIa-Pro更强的功能。NIa-VPg是病毒通过脉管系统运输，系统性侵染植物和与寄主相互作用的非常重要的区域，而NIa-Pro的主要作用就是切割病毒多聚蛋白[24]。Rajamaäki等[22]发现NIa-VPg复合物的VPg区部分氨基酸被替换后可能导致VPg磷酸化连接构象的改变，影响病毒的复制和运输。而VPg中心区域能够影响侵染细胞的病毒的积累水平，控制病毒通过脉管运输系统进入筛管分子(SE)。复合物的NIa区具有双重功能，即蛋白酶活性和序列非特异性dsRNA及宿主DNA降解活性，前者是Asp-46、Cys-151和Asp-81三个位点的作用；后者需要Mg2+存在才起作用[39]。
4.8 NIb功能区域 该区域编码一RNA依赖型RNA 聚合酶(RdRp)，也是所有SMV基因组编码的蛋白中最保守的一个，与病毒复制有重要的关系[24]，其复制酶活性与NIa-Pro的核苷结合能力有关[40]。
4.9 CP蛋白 SMV病毒粒被约2 000个CP单元组装，使病毒RNA衣壳化。该过程中结构蛋白CP形成的结构区域的中心区在与RNA结合中起了重要的作用，同时使RNA的N末端和C末端暴露于病毒粒表面。这间接说明CP与病毒通过脉管进入胞间和长距离运输[22]关系密切。蛋白结构域研究表明，CP蛋白高度保守的三组份氨基酸模体(Asp-Ala-Gly，DAG)会影响病毒组装和蚜虫传播病毒的能力，特别是其N末端区域DAG模体往往决定了SMV 传播效率[26,41]。Steinlage等[42]研究了CP基因翻译对SMV的时间和空间传播影响之后，发现不含CP基因的SMV无论是传染率还是发病率都明显低于含CP基因的SMV。
目前研究更多的是上述蛋白间的相互作用，阐明复制和细胞间转运机理(图2)。植物被病毒侵染后提取出的复合物与HC-Pro和CP有关，但在电镜下观察到HC-Pro可能不与病毒粒子的CP相互作用。尽管HC-Pro被证明与病毒的(蚜)虫媒传播有关，但它和CP互作的生物学意义是病毒在植物体内的长距离运输，而不是(蚜)虫媒传播[43]。HC-Pro 和CP同步突变均会延迟病毒系统运输和限制胞间运输[29]。NIa和NIb相互作用对基因组复制有重要的作用。这一作用会激发VPg区域邻近的聚合酶活性，进而促进RNA合成[44]。Li等[45]通过对NIb中核定位信号1、2(NLS1/NLS2)和保守区GDD模体定点诱变发现，NIb与NIa的相互作用中NIa-Pro起了决定性作用。
一般采用酵母双杂交系统(YTHS)分析SMV多聚蛋白各组分的相互作用[46]，然后引入突变[47]，通过报告基因在寄主水平显示差异[48]。Kang等[46]用酵母双杂交系统，以SMV-G7H为材料，检测到HC-Pro 蛋白之间以及HC-Pro与CP之间有明显的互作效应，HC-Pro/HC-Pro二聚体复合物，以及含
CP
游记开头
女生短发卷发发型
中国人的浪漫
思念家乡的古诗词
活动背景音乐
的
图2 SMV病毒RNA复制的膜结合位点和子代基因组细胞间运输模型
注：根据C a r r in g t o n等[38]，略有修正，E R：内质网；R N P：核蛋白；C W：细胞壁；C I：风轮状内含体
