基于代谢组学的黑龙江省不同产地
大豆的代谢产物分析
张丽媛1，代安娜1，于润众2,3，阮长青1，李志江1,4，张东杰1,3,5
（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）（2.黑龙江八一农垦大学电气与信息学院，黑龙江大庆 163319）（3.北大荒现代农业产业技术省级培育协同创新中心，黑龙江大庆 163319） （4.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319）
（5.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319）
摘要：基于气相色谱-质谱法非靶向代谢谱分析，分离和鉴定了来自三个产地（北安龙门、尾山和引龙河）的黑河43号大豆的代谢产物。采用80%甲醇提取大豆样品中代谢产物，N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺进行衍生，HP-5ms柱进行分析，GC-MS进行检测，通过KEGG注释分析差异代谢物的代谢途径，并对代谢机制进行阐述。在样品中共检测到68种代谢产物，分离鉴定出62种代谢产物，包括22种糖类及其衍生物，14种脂肪酸及其衍生物，7种醇类，4种酯类，2种氨基酸和13种中间体，推断出6种未知代谢产物结构，WS-soy样品4种，YLH-soy样品2种。不同产地大豆代谢产物和代谢机制存在差异，带有产地属性。这不仅为寒地大豆品质分析提供理论基础，也为大豆的分类加工或不同产地提取功能性成分提供依据。
关键词：代谢物；大豆；气相色谱-质谱法(GC-MS)；分离；鉴定
文章篇号：1673-9078(2021)06-287-295 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.6.1032 Analysis of Metabolites of Soybeans from Different Producing Origins in Heilongjiang Province Bad on Metabonomics
ZHANG Li-yuan1, DAI An-na1, YU Run-zhong2,3, RUAN Chang-qing1, LI Zhi-jiang1,4, ZHANG Dong-jie1,3,5
(1.College of Food, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)(2.College of Electrical Information, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)(3.Heilongjiang Province Cultivating Collaborative Innovation Center for the Beidahuang Modern Agricultural, Industry Technology, Daqing 163319, China)(4.Heilongjiang Engineering Rearch Center for Coar Cereals Processing and Quality Safety, Daqing 163319, China)(5.Chine National Engineering Rearch Center, Daqing 163319, China) Abstract: Metabolites of Heihe 43 soybeans in three origins (Beian Longmen, Weishan and Yinlong River) were isolated and identified using non-targeted metabolic profiling bad on gas chromatography-mass spectrometry. The metabolites in the soybean samples were extracted by 80% methanol, derivatized with N,O-bis (trim
ethylsilyl) trifluoroacetamide, eluted on an HP-5ms column, detected with GC-MS. The metabolic pathways of the differential metabolites were analyzed by KEGG annotation, the metabolic mechanisms were explored. A total of 68 metabolites were detected in soybean samples, and 62 metabolites were isolated and identified, included 22 carbohydrates and their derivatives, 14 fatty acids and their derivatives, 7 alcohols, 4 esters, and 2 amino acids, and 13 kinds 引文格式：
张丽媛，代安娜，于润众，等.基于代谢组学的黑龙江省不同产地大豆的代谢产物分析[J].现代食品科技,2021,37(6):287-295,+319 ZHANG Li-yuan, DAI An-na, YU Run-zhong, et al. Analysis of metabolites of soybeans from different producing origins in Heilongjiang province bad on metabonomics [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(6): 287-295, +319
收稿日期：2020-11-09
基金项目：黑龙江省应用技术研究与开发计划重大项目（GA18B102）；黑龙江八一农垦大学三横三纵资助项目（ZRCQC201906）；黑龙江省农垦总局重点研发项目（HKKY190407）
作者简介：张丽媛（1981-），女，博士，副教授，研究方向：食品安全与质量溯源，食品分析与检测
通讯作者：阮长青（1969-），男，博士，教授，研究方向：食品化学；张东杰（1966-），男，博士，教授，研究方向：食品安全
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of intermediates, inferring the structure of 6 kinds of unknown metabolites, 4 kinds of WS-soy samples, 2 kinds of YLH-soy samples. Soybean metabolites and metabolic mechanisms were different in different producing areas, and they had the attributes of producing areas. This not only provides a theoretical basis for the quality analysis of soybeans in cold regions, and also provides a basis for soybean classification and processing or extraction of functional components by origin.
Key words: metabolites; soybean; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); paration; identification
大豆（Glycine max (Linn.)Merr.）最早源自中国，已有5000多年种植历史，种植区主要分布在东北、华北、陕西、四川及长江中下游地区[1]。大豆含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、异黄酮等多种营养物质[2-4]。近年来，国内外对大豆的研究主要包括豆制品、大豆油脂、大豆蛋白质以及生理活性物质等[5-7]。而比较不同地区同种大豆代谢产物的研究较少，主要是不同的品种、育成年份、生长阶段，或加工处理后的代谢物，以及在真菌酸碱胁迫下的次生代谢产物[8-12]。大豆的代谢产物也受不同因素（
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氮、硅及磷含量等）影响[13-15]，其可溶性糖含量与其育成年代也呈显著正相关[16]。
代谢组学是对小分子化合物（分子量1000 u以下），运用色谱、质谱、核磁共振和毛细管电泳等技术进行研究[17,18]。它可被应用在食品造假鉴定、食品产地溯源[19-21]、食品真实属性鉴别、发酵食品有毒代谢产物分析及植物源性食品等方面[22,23]。杨冬爽等基于代谢组学研究野大豆（Glycine soja）的耐盐机理[24]，张圳等利用高效液相色谱法测定了体外大鼠肠道菌液中大豆苷及其代谢物[25]，张玉梅等进行了菜用大豆籽粒代谢物的相关性分析[26]。而非靶向代谢组学则是在有限的相关研究和背景知识的基础上整个代谢组进行系统全面的分析获取大量代谢物的数据，并对其进行处理从而找出差异代谢物的一种研究方法[27]。近年来许多学者利用非靶向代谢组学研究人参治疗脾气虚症、汉麻籽生理活性物质、转基因奶牛的血清和牛奶的代谢产物等[28-30]。
本研究利用气相色谱-质谱法（GC-MS）非靶向代谢谱技术分析了寒地三个不同产区同一品种的大豆代谢产物和代谢途径，分离和鉴定了差异代谢产物，并对其代谢机制进行了探索。这可为寒地大豆品质分析提供理论基础，也为大豆进行分类加工或分产地提取功能性成分提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
xp共享
研究的黑河43号品种大豆来自黑龙江省北安龙门（BALM-soy）、尾山（WS-soy）和引龙河（YLH-soy）三个产地。按照保护范围内具有代表性的抽样原则，采用棋盘抽样法随机抽取来自三个产地的大豆样品。
甲醇、异丙醇和乙腈（色谱级），美国Fisher 技术公司；N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），甲氧胺盐酸盐和吡啶，美国Sigma-Aldrich公司；结构鉴定的标准物质，美国Sigma-Aldrich公司，北京国家药品和生物制品控制研究所；色谱级用水，美国米利波尔公司的Milli-q 水净化系统；其他分析级试剂均来自北京化工厂。
1.2 仪器与设备
GC-MS-QP 2010（配备EI离子源），四极质量分析仪及AOC-20 i自动采样器，日本岛津技术有限公司；HP-5 ms分离柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent有限公司；KQ2200E型超声波清洗机（40 kHz，100 W），昆山超声仪器有限公司；昆山恒温均衡器，昆山恒温均衡器有限公司；MSC-100恒温均衡器，杭州澳盛仪器有限公司；Alpha1-2Ldplus冷冻干燥机，德国CHRIST公司；TGL-16B高速离心机，安亭仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大豆代谢物的提取与衍生化
大豆在液氮作用下粉碎，经100目筛网筛分，保存于-80 ℃，将100.0 mg大豆样品，800 μL 80%甲醇水溶液和10 μL内标（2-氯苯丙氨酸）置于EP 管中。均质化前充分搅拌30 s。从大豆样品中提取极性代谢物组分。为提高提取效率，将含有该混合物的EP管在35 ℃ 80 W超声9.0 min，并剧烈摇动1 min，4 ℃，12,000 r/min离心10.0 min。取200 μL 上清液转移至1.5 mL自动样品瓶，冷冻干燥器中干燥过夜。残余物37 ℃在30 μL（20 mg/mL）甲氧基胺盐酸盐和吡啶中溶解60 min，加入30 μL BSTFA，70 ℃ 60 min衍生化处理后，24 h内分析所得溶液。
1.3.2 GC-MS分析
自动取样器注入1 µL样品液，色谱柱：Agilent J&W Scientific HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；
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升温程序：80 ℃，保持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，保持6 min；80 ℃下进行温度平衡6 min，然后再注入下一次样品。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度大于99.999%）作为载气，进样量1.0 μL，不分流进样。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围：50~550 m/z。
软件实施工程师1.3.3 代谢物定性分析与定量分析
定性分析：将获得的大豆代谢物数据与NIST 14数据库进行比较以获得结构信息并分类，并研究大豆样品的差异代谢产物。
定量分析：采用峰面积归一化法进行各大豆样品成分相对含量的计算，每个样品重复3次，取平均值。
1.3.4 代谢机制分析
通过KEGG数据库比较代谢物的代谢途径。利用KEGG代谢途径检索中的富集分析来分析不同品种大豆的代谢机制。在KEGG筛选的差异代谢物中发现了相关的代谢途径，推断不同产地的大豆样品代谢过程的变化。
1.3.5 数据处理
采用Excel软件对GC-MS数据进行统计分析。
2 结果与讨论
2.1 GC-MS结果分析
表1 三个产地大豆样品中的代谢产物
Table 1 Metabolites form soybean samples from three producing areas
碳酸氢钠片说明书
Area/%
序号保留时间化合物名称化合物种类
BALM WS YLH
1 5.06 Boron, trihydro(pyridine)-, (T-4) 中间体- - 0.11
2 5.068 1-Butylpyridinium bromide 中间体- 9.5
3 -
3 5.338 1-Pentanol 醇类- 2.87 -
4 5.482 Formamide 中间体- 2.78 -
5 5.755 Trans-4,5-Epoxynonane 未知物- 2.71 -
6 6.849 Cycloheptanol 醇类- 0.58 -
7 7.091 1,8-Di(4-nitrophenylmethyl) 未知物- 0.78 -
8 7.336 1,2,3-Butanetriol, 醇类0.87 - 0.15
9 8.551 N,N-Dimethyloctylamine 中间体- 1.14 -
10 8.74 Valdetamide 中间体- 0.90 -
11 8.811 Glycerol, 脂肪酸0.63 - -
12 9.281 2-Methyl-4H,6H-thieno 未知物- 1.13 -
13 10.096 Anethole 中间体- 3.59 0.16
14 10.605 1-Hexyne 中间体- 0.72 -
15 10.676 DL-Proline 氨基酸- 5.47 -
16 11.201 Homocysteine 氨基酸0.59 - -
17 11.917 Benzoic acid 脂肪酸- 0.63 -
18 13.354 6-hexadecenoic acid 脂肪酸- 1.33 0.18
19 14.23 D-glucofuranoside 糖类- - 0.12
20 14.395 D-Ribofurano 糖类- - 0.13
21 14.512 D-Tagatofurano, 糖类0.25 - 0.13
22 14.79 Octanoic acid 脂肪酸- 0.46 -
23 14.794 Uridine 中间体- - 0.24
24 14.928 D-Erythro 糖类- - 0.19
25 15.854 1H-2-Benzopyran-3-carboxylic acid 未知物- 0.72 -
26 16.008 Phthalic acid, 脂肪酸- 0.79 -
27 16.454 Butylphosphonic acid 脂肪酸 1.01 - 1.65
阳坊胜利涮羊肉
转下页
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接上页
28 16.928 L-Threo 糖类- - 0.80
29 17.562 D-Tagato 糖类- - 0.60
30 17.604 Myo-Inositol 中间体0.96 - 0.15
31 17.702 D-Psico 糖类0.41 - -
32 17.728 D-Ribo 糖类- - 14.62
33 17.877 D-Arabinopyrano 糖类- - 0.42
34 17.994 3,6,10,13-Tetraoxa-2,14-disilapentadecane 未知物- - 2.31
35 18.038 3,7,11,15,18-Pentaoxa-2,19-disilaeicosane 未知物- - 0.71
36 18.29 D-Fructo 糖类0.99 - 3.15
37 18.33 D-Xylo 糖类 1.65 - 2.00
38 18.495 D-Talo 糖类 2.91 - -
39 18.75 D-Allo 糖类0.46 - 1.39
40 18.945 Tetradecanoic acid, ethyl ester 酯类- 2.43 -
41 18.974 Erythritol 醇类0.75 - -
42 19.017 beta-Sorbitol 醇类0.83 - -
43 19.061 Ribitol 醇类0.25 - -
44 19.362 Eicosanoic acid 脂肪酸- 3.85 -
45 19.384 L-Arabitol 醇类 1.25 - -
46 20.761 Pentadecanoic acid 脂肪酸0.22 - -
47 21.147 8,11-Octadecadienoic acid 脂肪酸0.45 - -
48 21.459 6-Octadecenoic acid 脂肪酸 5.14 1.07 -
49 21.577 Methyl stearate 酯类- 2.31 -
50 21.606 13-Teradecenal 中间体 2.98 - -
51 22.383 Octadecanoic acid 脂肪酸0.73 0.93 -
52 22.424 9,12-Octadecadienoic acid 脂肪酸 1.83 - -
53 22.493 9-Octadecadienoic acid 脂肪酸0.74 - -
54 25.292 Sucro 糖类0.61 - -
55 25.632 1,3-dipalmitoylglycerol 酯类0.29 - -
56 25.694 D-Trehalo 糖类0.69 - 0.31
57 26.127 Hexadecanoic acid 脂肪酸- 0.72 -
58 26.878 1,2-O-Isopropylidene-D-glucofurano 糖类39.07 - -
59 27.446 D-Turano 糖类 2.32 - -
60 27.582 D-Galactopyranoside 糖类0.56 - -
61 27.922 2-Monostearin 酯类 2.78 - 0.87
62 28.017 Squalene 中间体 2.60 - -八上语文书人教版
63 28.066 beta-D-Lacto 糖类 1.53 - 0.19
64 28.261 Methyl Galactoside 糖类0.52 - -
65 29.657 Sitosterol 中间体0.25 - -端午赛龙舟
66 28.673 9-Octadecenamide 中间体- 0.65 -
67 30.689 beta-Arabinopyrano 糖类- - 0.42
68 34.987 Mannobio 糖类0.41 - 11.43
注：“-”表示未检测到代谢产物。
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三个产地大豆的GC-MS 总离子流图如图1、2和3所示。
从三个总离子流图可以看出产地不同，品种相同的大豆样品的代谢产物明显存在不同。三个产地的大豆样品中共检测到68种代谢产物（表1）。其中62种化合物经NIST 数据库精确表征，包括22种糖类及其衍生物，14种脂肪酸及其衍生物，7种醇类，4种酯类，2种氨基酸和13种中间体，6种化合物推断出可能结构。BALM-soy 样品中检测到34种代谢物，其中Area>1%的代谢物占总量的65.18%。WS-soy 样品中检测到20种代谢物和4种未知化合物，其中Area>1%的代谢物占总量的40.21%。YLH-soy 样品中检测到23种代谢物和2种未知化合物，其中Area>1%的代谢物占总量的36.55%。
图1 北安龙门大豆总离子流图
Fig.1 Totalion flow diagram of BALM-soy samples 注：(a)：BALM-soy 样品的完整谱图范围，0.0~3
5.0 min ；(b)：BALM-soy 样品的部分谱图范围，16.0~30.0 min 。
图2 尾山大豆总离子流图
烤燕麦饼Fig.2 Total ion flow diagram of WS-soy samples 注：(a)：WS-soy 样品的完整谱图范围，5.0~35.0
min ；(b)：WS-soy 样品的部分谱图范围，5.5~16.5 min ；(c)：WS-soy 样品的部分谱图范围，17.0~28.0 min 。
图3 引龙河大豆总离子流图
Fig.3 Total ion flow diagram of YLH-soy samples 注：(a)：YLH-soy 样品的完整谱图范围，5.0~35.0
min ；
(b)：YLH-soy 样品的部分谱图范围，14.0~28.0 min 。
