菌藻互利共生关系以及可生物降解材料对其影响
李旻昊
（同济大学环境科学与工程学院，上海115014）
摘要：铜绿微囊藻-施氏假单胞菌之间存在着互利共生的关系，这种光养-异养微生物体系形成了一种营养循环’铜绿微囊藻以光合产物的形式产生和泄露有机物质，帮助异养生物生长’这种光养-异养微生物体系有助于能量和物质在食物链以至于水生食物网中传递％维持水体生态系统平衡’轻度富营养化水体中，水体微生物无法在与藻类争夺氮磷等营养元素中获得优势，藻类依然成为生物链中的优势环节，大量的能量与物质在此环节停止流动，导致水华的爆发’PHAs作为一种缓释碳源不仅可以为异养卫生提供容易利用的小分子有机化合物提高异养微生物的增殖速率和最大细胞密度%还能对异养微生物进行驯化，提高其利用藻细胞产生的难降解有机物的能力，进行反硝化作用%降低水体中的氮元素含量’从而抑制藻类过度生长%维持水生生态系统的稳定’
关键词：互利共生；缓释碳源PHA#抑制藻类
中图分类号:X171文献标识码:A文章编号:1008-011X（1011）05-0175-05
Muthalism of Bacteia and Algae and the Effect of Biodegradable Ma：eriais on It
Li Minhao
(Tongji University%Shanghai115014,China)
Abstract:The mutualism between Microcystis aeruginosa and Pudomonas stutzero make great conWiXuUon to98000X0the baeanceotwateeecosystem.Thisphototeophicheteeoteophicmiceobiaesystem toemsanuteientcycee.Miceocystisaeeuginosa peoducesand eeeeasoeganicma t eein thetoem otphotosyntheticpeoducts,which heepsheteeoteophicgeowth.Thisphototeophic heteeoteophicmiceobiaesystem conteibutestotheteansteeoteneegyand mateeiaein thetood chain and eeen in theaquatictood web.In eighteyeuteophicwatee,miceooeganismscan notcompetewith aegaetoenuteientssuch asniteogen and phosphoeus.Aegaeis sti e thedominanteink in thebioeogicaechain.A eaegeamountoteneegyand mateeiaestop teowingin thiink,eeadingtothe outbeeak o twate eb eooms.As a sustained-ee eea ca ebon souece,PHAscan notoneypeoeideeasytousma e moeecueaeoeganic compoundstoe heteeoteophic miceooeganism,impeoee the peoeiteeation eate and mayimum ce e density otheteeoteophic miceooeganisms,butaesodomesticateheteeoteophicmiceooeganisms,impeoeetheieabieitytoutieieeeeteactoeyoeganicma t ee peoduced byaegaece s,conductdeniteitication,and eeducetheniteogen contentin watee.Soastoe
esteain theoeeegeowth ot aegaeand maintain thestabieityotaquaticecosystem.
Key words：mutua/sm；sustained-—Oa carbon source；inhibition of alaae
当前，随着我国经济的发展，高污染产业依旧不断增长，水污染问题非常严峻。据2019年中国环境状况公报显示,2019年,112个重要湖泊（水库）中，I类水质的湖泊（水库）8个，占7.1%；2类28个，占25.0%；0类38个，占33N%；N类23个，占20.5%；V类6个，占5.4%；劣V类9个，占8常％。主要污染指标为总磷、化学需氧量和高猛酸盐指数。108个监测营养状态的湖泊（水库）中，贫营养的10个，中营养的73个，轻度富营养的20个，中度富营养的5个。因此，控制水体富营养化仍然是当前国内水环境治理领域的重要问题。
近年来，大量的研究表明富营养化增加了许多水体中蓝藻水华爆发的频率和强度，这种趋势是不容忽略的，其对生物多样性造成负面影响，威胁水生生物食物网的功能，还会影响水体作为饮用水、景观用水和娱乐用水等功能。
我国的水华蓝藻以微囊藻最为常见，危害最大。微囊藻具有一系列的生理生化机制，使得它在富营养水体中容易暴发性的生长，形成水华。最主要的是由于微囊藻成群体生长，许多细胞密集在一起，外包一个共同的胶质鞘膜。胶质鞘膜内多个微囊藻细胞形成一起稳定的结构，可以帮助微囊藻避免受到强光照的辐射伤害，以及抵御其它不良环境因素的影响。另一方面，群体生长使得微囊藻逃脱了浮游
动物的扑食作用。还有一些研究表明，微囊藻在温度、光照、营养盐和生活史策略方面具有生长优势。微囊藻由于本身的机制使得其在夏天的富营养水体中容易大量暴发生长，造成严重的水体生态灾难，而且大多微囊藻产生致肝癌毒素，给公众健康带来巨大危害。
在频繁暴发蓝藻水华的水体中，藻类通过光合作用固定有机物，在周围环境中最多可以释放大约25%有机物。细菌通过不同代谢途径参与将水体中藻类分泌有机物的转化，但不同藻类分泌有机物存在特异性，因此藻类类群可以导致微生物类群的改变，同时不同微生物分泌物也存在特异性，这也将改变藻类群落结构。藻类及其附着细菌的相互作用可以归纳为正相作作，细菌通过菌-作影响水华暴发。细菌能为藻体新陈代谢提供必要的物质如铁、维生素B12和生长因子，对藻体的生长产生促进作用；同时细菌可分些质抑制体胞囊形成，分质
将藻类进行溶解，对藻类的生长产生抑制作用。
1实验材料及方法
1-1实验材料
1.1.1菌种及菌剂
本研究采用施氏假单胞菌[1]（Pudomonas stutzeri）作为研究对象一直。PPuieri由Van Niel和Alien
于1952年明确定义了它的表型特征并为其命名，可以从自然界存在的反硝化细菌中分离鉴定，由于特定的代谢特性（例如反硝化，芳族化合物的降解和固氮等）受到了特别的关注。
实验用菌种（CICC10428）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种活化后接种至LB培养基，于30＜、160r/min环
收稿日期：2020—2-17
作者简介：李旻昊，研究方向：环境微生物。
SHANDONGCHEMICALINDUSTRY
-276-2021年第50卷
境下培养。
实验藻种为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa%FACHB 918)，来购于中国科学院淡水藻种库，与日本国立环境研究所交换所得。
藻种经活化后，接种于BG11培养基，于25<，光照强度2000d，光暗比12h：12h条件下在人工气候培养箱中预培养15d备用。
1.1.2培养基成分
培养基A：经过高温灭菌处理的富营养化淡水200mL。
培养基B：其他条件不变，在培养基A中加入2g PHAs o
培养基C：其他条件不变，在培养基A中加入2g CHCOONa。
经高温灭菌富营养化淡水水质指标见表1。
表1经高温灭菌富营养化淡水水质
序号指标浓度
1透明度/cm150
2COD/(mg/L)16.00
3氨氮/(mg/L)003
4TN/(mg/L) 5.11
5TP/(mg/L)005
6DO/(mg/L)704
本研究所用PHAs为PHBV颗粒(PHB-cc-HV)，1% hydmxyvalera—content，购自宁波天安生物科技有限公司。物理性质如下：圆柱形，直径约3mm左右，高度约3mm左右，表面积约14.13cm2/g，干重约0.03—粒。相对分子质量Mn= 680000g-mol-，单体组成为84.6%3-HB和15.4%4-HB(由核磁共振1H NMR测得)，分散性Mw/Mn= 1.96(由GPC测得)。
1-2分析方法
摇瓶实验中藻类和细菌的计数采用血球计数法，于显微镜40倍径下观察计数；使用无菌水将菌悬液稀释为3个梯度分别计数。使用25=16型血球计数板计数，计算公式：
Ce/s/mL=Nx5x10x稀释倍数/1000
其中N为计数区域中观察到的细胞数量，每个样品计数5次取平均值。
实验水质理化指标检测方法：实验中取自摇瓶反应体系以及自然水体样品首先通过00!m玻璃纤维滤膜过滤后再进行基础指标的检测，包括TN,NH4+,NO3_-N,NO2_-N,DO,pH值以及TOC等指标。
(1)硝酸盐氮、亚硝酸盐氮：将样品在4<12000g条件下离心10mm，取上清液采用离子色谱法测定硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量)2*。
(2)pH值(Dissolved oxygen,DO)：采用电化学探头法测定［3］。
(3)氨氮：采用纳氏试剂分光光度法测定，检出限0.025m—L⑷。
(4)化学需氧量！Chemical oxygen demand,COD)：采用重=酸钾法测定，检出限4mg/L)5*。
(5)总有机碳(Total organic carbon,TOC)：采用燃烧氧化一非分散红外吸收法测定，检出限0.1m—L)6*。
1.C实验方法
1.3.1菌藻协同竞争关系
设置两组摇瓶对照实验，一组为铜绿微囊藻与施氏假单胞菌混合培养，一组为铜绿微囊藻单独培养。
两组实验均使用BG11液体培养基，铜绿微囊藻与施氏假单胞菌的接种浓度均为108mL即，接种量均为1mL。置于光照培养箱中培养，光照强度2000lux，光暗时间比为12h：12h，每天摇晃摇瓶3次每次1
mm以保证摇瓶体系为均相状态。为保证铜绿微囊藻正常生长的同时实验摇瓶不被空气中的杂菌污染使用孔径为00p i的过滤透气封瓶膜封住摇瓶。使用pH 计监控培养液pH值，使用配置好的1mmol/L浓度的NaOH与HCl溶液调节pH值至70。
铜绿囊独，铜绿囊胞菌混合
，胞菌独设3实验。设2
实验实验与铜绿囊独。第一实验铜绿囊独第90d加20mL 施氏假单胞菌菌悬液，浓度为108mL-。第二组对照实验在开始培养的第25d加入经过灭菌的内源呼吸期的铜绿微囊藻培。
每五天使用无菌工作台取样一次，取样量2mL，使用摄影显微镜进行血球计数。使用25=16型血球计数板计数，计算公:
Ce/s/mL=Nx5=10=稀释倍数/1000
其中N为计数区域中观察到的细胞数量，每个样品计数5值。
1.3.2可生物降解材料对菌藻关系的影响
设实验，实验设计5实验：第一实验设菌比1：1，菌浓106 mL-，接种量1mL，使用培养基A(经过高温灭菌处理的富营养化水200mL);
第二组实验设置菌藻接种比1:10，细菌浓度107mL-，藻细胞浓度106mL-，接种量为1mL，使用培养基A(经过高温灭菌处理的富营养化淡水200mL);
第三组实验设置菌藻接种比1:1，菌藻浓度各为107mL-，量1mL，基B(过高灭菌理营化水200mL+2gPHAs);
第四组实验设置菌藻接种比1:1，细菌浓度各为107mL-，接种量1mL使用培养基0(经过高温灭菌处理的富营养化淡水200mL+2g CH3COONa)。
置于光照培养箱中培养，光照强度2000lux，光暗时间比为12h：12h，每天摇晃摇瓶3次每次1mm以保证摇瓶体系为均相状态。为保证铜绿微囊藻正常生长的同时实验摇瓶不被空气中的杂菌污染使用孔径为0R p m的过滤透气封瓶膜封住摇瓶。pH计控pH值，好1mmoeLL浓NaOH与HCe pH值7.1。
2d，血计法检测细菌
化，岛津全自动TOC分析仪测定总氮与TOC数据。
2结果与讨论
2.1菌藻协同竞争关系
独铜绿囊BG11基中理学
与混合培养的表现不同。指数增长期中(第5~25d)，单独培养组和混合培养组在增长速率和最大细胞密度两项数据中都没有表现出明显差异。培养开始35d后两组实验中的铜绿微囊定期，独铜绿囊最大细胞密
到8.3=108mL即，相对的混合培养组铜绿微囊藻达到&2= 108mL-的细胞密度，并未显示出明显差异(图1)。但是在培养开始55d后，单独培养组的藻细胞进入了衰亡期，细胞密度逐渐下降，最终3组单独培养的铜绿微囊藻在第90-100d先后完全死亡。然而与异养微生物施氏假单胞菌混合培养的铜绿微囊藻可以维持约8.0=108mL即细胞密度超过120d 。
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图1铜绿微囊藻与施氏假菌菌使用BG11液体培养基混合培养体系藻细胞浓度1线（Mic—cys/s ce-cufu—）,
铜绿微囊藻使用BG11培基单独培养藻细胞浓度|线
（Miceocystisayenic）
由于缺少营养元素！BG11培养基TOC为25mg/L）单独培胞菌细胞速比混合慢，最大细胞密度（1云=106mL—"也低于混合培养组。在培养液中的营养质完后，单独胞菌在70-80d部死亡。作一，尽管有任何外源碳、能量、维生素和营有机来源，与铜绿微囊藻共同培
胞菌 高的细胞密度（1.8X107mL—），够一直超过120d（2）。明了胞菌与铜绿微囊藻质, 混合胞菌从共关
中间单独曲线胞菌与灭活的铜绿微囊藻培养液（TO/浓度为386mg/L）混合培养浓度曲线
图2混合培养体系和施氏假菌单独培菌浓度变化灭过后铜绿囊胞菌实验组细胞速细胞最大密度介于BG11基
独胞菌实验组与混合实验。施胞菌一定程够铜绿微囊藻衰亡产裂解产物。但是铜绿微囊情况下，胞菌能够从质中大且持益。胞菌从藻细胞产光合产物中获益相比死亡 细胞裂解产难降解有机物中益加持久。
有机质的积累了单独铜绿微囊死亡。铜绿微囊是由于pH值变化、营质缺乏，而是由于有机物质的积累。持实验体系中的有机量测, TOC浓示中DOM（Di s oeeed OeganicMa t ee）量，铜绿微囊产DOM在封闭的实验体系中积累，在85d时达到最高值388m—L，这些DOM对铜绿微囊藻具有潜在的毒性，独铜绿微囊衰亡期，藻细胞大量死亡（图1），如水后大量死亡造成水统崩溃，摇瓶体定趋于崩溃。铜绿微囊藻与胞菌混合实验组则保持稳定，在实验的95d DOM浓保持在66~96m—L之间（图3）。
图3菌藻混合培养体系！ce-culmre）与铜绿微囊藻单独培养体系！MN—cys/s ce-cufu—）DOM浓度（使用TOC浓度表征）20mL衰亡期细胞（TOC浓446m—L）灭菌之后加期的铜绿微囊。铜绿微囊藻明显受到抑制，加快了其衰亡速度（图4）。衰亡期！85d）的藻细胞培养液中加入20mL，浓度为108mL—对期胞菌，铜绿微囊藻停止衰亡，经过
藻细胞培养液中加入灭活的衰亡期铜绿微囊藻培养液
（TOC浓度为446m—L）
1.E+08
1.E+05
1
1.E+06
1.E+07
102030405060708090100110120130140150160
时间/d
图5在铜绿微囊藻单独培养体衰（85d）
的藻培中加入&氏假菌悬浊
游植物是水体系中最常见最丰级生产者⑺，所有初级生产将转化状解性有机物（DOM），成水生食物网的主要碳源源&9*。DOM通认为是由细胞死亡，病毒裂解，体免“有意”漏，例如通过细胞外囊产生，主动外排过程或是膜泄露。从意义上，游植动细菌动态，是有机物质的主要供者）10*。管有示浮游植物如何简有机化合物，如氨基酸或葡萄糖）11—2*，但是这些生物通常不能使用复杂的DOM，因为他们缺乏必要的酶）13—4*，
可能依赖异于养微生物
SHANDONG CHEMICAL UDUSTRY
-278-2021第50
再矿化营养元素。有示水体中细菌时，光够高的细胞密有。在光-统中，通过有机物作为碳源明显受益［15］。
铜绿微囊胞菌形成的光养-异养共生体系相作用是基于养分循环。铜绿微囊藻是摇瓶体系中级生产者，以光合产形式产泄露有机物质，帮
。作换，胞菌（1）免了光合产积累，由于一些原因高浓光合产铜绿微囊有毒性，抑制其。（2）有机物质维持动再矿化光合产中营质，矿化机氮铜绿囊藻再定CO1。
25可生材料对菌藻关系的影响
车辆管理服务菌比为1:1和1：10两实验基A（富营
化淡水）中叶绿素浓有明（图6），营化淡水基中胞菌与铜绿囊形成共关，菌
比影响铜绿微囊速度和最大细胞浓度。
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总
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时间/d
图6菌藻接种1：1和1：10两实验在培养基A
（富营养化淡水）中的叶绿素浓度
TOC含量的快速增加于空气和水中解的CO1固定光合产物（图7）。两实验中细菌比高的第二组中，TOC浓后期，胞菌利
胞菌 细胞密高一实验速比细胞密实验有高速。胞菌通过与铜绿囊共关光合产是一定，营养化淡水中，胞菌无法高的细胞密度（8）。
驯化胞菌难降解有机物以满足。如营养化水体中一样，藻
一环食中占据了势快速（图6），迅速消耗摇瓶体系中的氮磷元素，很快 了稳定期。
菌比为1：1的实验组总氮浓度整过程中几
（9），胞菌从共生关系中光合产物几有于化过程。1：10比实验氮浓
培养结束时下降到18.6m—L。这表明在轻度富营养化水体中，铜绿微囊光合产物几胞菌用于自，增加接种比例对此影响并不显著。
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图8菌藻接种1：1和1：10两实验在培养基A （营化淡水）施氏假单胞菌度
23
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肥儿丸的功效19
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图9菌藻接种1：1和1：10两实验在培养基A
（富营养化淡水）中总氮浓度
外加PHA作为碳源的实验细胞速最大细胞密度铜外加乙酸钠作为碳源的实验组有明，6 d两细菌速率基，在实验开第6d,PHA 细菌速度超过了乙酸钠作碳源。因PHA颗粒是一碳源，与作大约需要一周水解为PHBV单体，作。两实验中细胞最大密明，胞菌在PHAs作为碳源的体系中最大细胞密 1.06x 107mL—，而以乙酸钠作为碳源的最大细胞密度为1x106mL—（图10）。
1.E+04
廉洁诗句02
1.E+07
1.E+06
1.E+05
46810121416
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图10用培养基B（富营化淡水+PHAs）和培养基C （富营化淡水+）的实验组的藻
按摩技巧
度
夕卜加PHAs的实验细胞了抑制的效果。比于乙酸钠铜绿微囊藻细胞浓11107mL-（16d）,PHAs组的铜绿微囊藻细胞密度为4.2106mL-（图11）。
过16d，外加PHAs的实验氮（TN）浓度由21.2m—L下降到9.C mg/L，较高浓度的施氏假单胞菌在PHAs 的驯化够更加有铜绿微囊藻产难降解有机物，瓶中产生了化，基中得一部分氮元素转化为氮气。乙酸钠作为碳源得实验组总氮（TN）
浓度仅下降到15.3m—L（图12）。
图11使用培养基B（富营养化淡水+PHAs）和
培养基0（富营养化淡水+乙酸钠）的实验组的
施氏假单胞菌细胞密度
(
总
目
祝你新年快乐英文言
时间/d
图12使用培养基B（富营养化淡水+PHAs）和培养基C （营化淡水+）的实验组的总氮浓度
3结论
铜绿囊-胞菌共关，
光养即体系形成了一种营养循环。铜绿微囊藻光合产形式产泄露有机物质，。作换，胞菌！1）免了光合产积累，由于一些原因高浓光合产铜绿微囊有毒性，抑制。（2）有机物质维持动再矿化光合产物中的营质，矿化机氮铜绿微囊藻再定CO1。光-体系有助于能
量质在食于水生食物网中传递，维持水体系统。
如何除铁锈明度与溶解氧情况较好营养化水体中，异从光养-异养共生体系中光合产物基于增殖，光产难降解有机很低，因法实外加碳源的情况化作用，水体氮元素浓度。成中势环节，大量量与物质环节停止流动，水花。
PHAs作为一碳源不仅卫容易利分子有机化合高速最大细
胞密，驯化，高细胞产难降解有机力，化作用，水体中的氮元
素含量。从而抑制过，维持水统定。
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(本文文献格式：李旻昊•菌藻互利共生关系以及可生物降解材其影响[/•山东化工,2021,50(5)：275-279.
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