磷脂与Hsp90相互作用的荧光和红外光谱
张牧焓;张淼;孙冲;王道营;卞欢;吴海虹;诸永志;耿志明;徐为民
【摘 要】To investigate the mechanism underlying the interaction between phosphatidylcholine ( PC) and heat shock protein 90 ( Hsp90) , the fluorescence spectroscopy and infrared spectroscopy were applied to study the changes of in-trinsic fluorescence of Hsp90 and major groups of phosphatidylcholine respectively. The results showed PC was found to have a strong ability to quench the intrinsic fluorescence of Hsp90. It was a static quenching as the result of the formation of PC-Hsp90 complex. The number of binding sites was 0. 92, and bad on Van’ t Hoff equation, the binding of PC to Hsp90 was driven mainly by hydrogen bond and Van der Waals forces. The infrared spectroscopy indicated the binding of Hsp90 and PC took place in the polar headgroup and nonpolar fatty acid side chains of PC, and the structure of PC molecules changed. In conclusion, PC could stably bind with Hsp90.%为研究磷脂酰胆碱( PC)与热休克蛋白90( Hsp90)的相互作用机制,分别采用荧光光谱和红外光谱法研究Hsp90内源荧光的变化和
磷脂主要基团的变化。结果显示:PC对Hsp90内源荧光有较强的猝灭作用,PC对Hsp90的猝灭属于形成复合物产生的静态猝灭,结合位点数为0.92,结合的主要作用力为氢键和范德华力;Hsp90与PC的相互作用发生在磷脂极性头端和非极性侧链上,并使磷脂的结构发生改变。磷脂可以稳定地与Hsp90结合。
河流长度
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2016(032)004
【总页数】5页(P922-926)
【关键词】热休克蛋白90( Hsp90);磷脂酰胆碱;荧光光谱;红外光谱
【作 者】张牧焓;张淼;孙冲;王道营;卞欢;吴海虹;诸永志;耿志明;徐为民
【作者单位】江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014; 南京财经大学,食品科学与工程学院,江苏 南京 210046;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产
新车六年免检如何年审品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014
【正文语种】中 文
【中图分类】延安在哪TS251.5
磷脂主要包括磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)等,是组成动物肌内脂质的主要物质,也是构成细胞膜的重要成分 [1]。磷脂易发生水解和氧化,与肉制品风味和品质的形成密切相关 [2]。因此研究肌内磷脂的生化特性对阐明肉制品品质形成有重要的意义。
热休克蛋白(Hsp)是动物和微生物中广泛存在的一类高度保守蛋白质,也是膜结合蛋白之一。其中Hsp90是热休克蛋白家族的重要成员,在非应激细胞中占胞质蛋白的1%~2%,在应激后表达量更高 [3]。据报道小分子热休克蛋白和热休克蛋白70可以与磷脂紧密结合,并对细胞膜的流动性、渗透性、完整性具有调控作用 [4-7]。Wang等的研究也初步证实了H
sp90可以与磷脂结合并抑制磷脂酶A2对磷脂的水解 [8], 但目前Hsp90与磷脂相互作用的机制还不明确。在肉品科学领域,热休克蛋白已被证实与肌内脂肪含量、汁液损失、嫩度等相关 [9-11],深入研究热休克蛋白与肌内磷脂的关系可以为了解肉制品品质的形成机理提供理论基础。本试验拟采用荧光光谱和红外光谱研究Hsp90与磷脂酰胆碱之间的相互作用,初步揭示Hsp90与磷脂酰胆碱相互作用的机制。
永久和平打一地名1.1 材料与试剂天蝎女和处女座男
磷脂酰胆碱来源于 Avanti Polar Lipids 公司;Hsp90从鸭肉中分离提纯 [8]。
1.2 仪器与设备
970CRT荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司产品),600IR傅里叶红外光谱仪(美国Varian公司产品)。
1.3 方法
1.3.1 磷脂酰胆碱脂质体的制备 称取卵磷脂10 mg,用2 ml乙醚溶解,加0.5 ml 50 mmol/L
Tris-HCl (pH 6.8)缓冲液,旋转蒸发器中旋转蒸发除乙醚,再加缓冲液2 ml,置于超声波发生器中在超声频率28 kHz、功率100 W条件下冰浴乳化30 min,用50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)缓冲液定容至10 ml。
1.3.2 Hsp90-磷脂脂质体的荧光光谱测定 向浓度为1×10-5 mol/L的Hsp90溶液中依次加入磷脂脂质体,使其终浓度为4.2×10-6 mol/L、8.3×10-6 mol/L、12.5×10-6 mol/L、16.7×10-6 mol/L,在温度为288 K、298 K、308 K下检测Hsp90的荧光发射波长。测定时发射与激发狭缝为10 nm,激发波长285 nm,样品池光径为1 cm。每次测定重复3次。
会议讨论1.3.3 Hsp90-磷脂脂质体的红外光谱测定 在Hsp90溶液中加入磷脂脂质体溶液,蛋白质与磷脂脂质体的摩尔比为1∶12。分别取50 μl脂质体溶液和Hsp90/磷脂复合物滴于玻璃片上,保持脂质体的浓度一致,室温下晾干。以傅里叶变换红外光谱仪在800~4 000 cm-1进行扫描,分辨率4 cm-1,扫描次数32次,每次测定重复3次。谱图由Origin 8.0软件获得。
2.1 磷脂对Hsp90的荧光猝灭方式
风一样的人
Hsp90因含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸残基而具有内源荧光。荧光猝灭是指溶液中猝灭体分子和荧光物质之间发生相互作用使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩短,从而导致荧光强度降低的现象 [12]。本试验固定Hsp90的浓度不变,增加脂质体浓度,观察该反应的荧光变化。图1为磷脂对Hsp90的荧光光谱图。 由图1可以看出,在300~400 nm,随着磷脂浓度的增加,Hsp90的荧光强度逐渐减小,说明磷脂在与Hsp90的作用过程中,对Hsp90的荧光有猝灭作用。
荧光猝灭过程可分为动态猝灭和静态猝灭。而无论是动态猝灭还是静态猝灭,都与温度的变化关系密切。小分子与蛋白质的激发态分子间相互碰撞导致荧光强度猝灭的过程称为动态猝灭。在这个过程中若升高温度,会使分子间有效碰撞程度加剧,猝灭常数增高 [12]。而小分子与蛋白质分子间借助分子间作用力,生成不发光的复合物,导致蛋白质荧光强度降低的过程,称为静态猝灭过程。在这个过程中,升高温度会使复合物的稳定性降低,猝灭常数减小 [12]。所以,一般情况下,可以通过改变温度,观察猝灭常数的变化,确认荧光猝灭的类型。学校共青团组织
本试验测定了不同温度(288 K、298 K、308 K)下磷脂对Hsp90的荧光猝灭情况。首先用Stern-Volmer方程进行描述 [13]:
式中Kq是双分子猝灭过程的速率常数,Ksv为动态猝灭常数,τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命(τ0=10-8 s), [Q]为脂质体的浓度,F0和F分别为未加入和加入脂质体时Hsp90的荧光强度。
根据Stern-Volmer方程,以脂质体浓度为横坐标,F0/F为纵坐标,作Hsp90的荧光猝灭 Stern-Volmer曲线(图2)。
由图2可见,在288 K、298 K、308 K时曲线均呈较好的线性关系,不同温度下的Ksv分别为3.07×105 (mol/L)-1、2.97×105 (mol/L)-1、2.75×105 (mol/L)-1,可见,随着温度的升高,动态猝灭常数呈减小的趋势。荧光猝灭过程Kq分别为3.07×1013 (mol/L)-1·s-1、2.97×1013 (mol/L)-1·s-1、2.75×1013 (mol/L)-1·s-1,皆远大于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭的速率常数2.0×1010 (mol/L)-1·s-1 [14]。所以可以推测,脂质体对Hsp90的猝灭不是由于分子间碰撞引起的动态猝灭,而是形成了复合物而引起的静态猝灭。
2.2 磷脂与Hsp90的结合常数和结合位点数
在静态猝灭中,用Lineweaver-Burk 双倒数方程进行处理,可以进一步确定结合反应的相关参数 [15]。Lineweaver-Burk 双倒数方程为:
式中Ka为Hsp90与脂质体的结合常数,n为结合位点数。以lg(F0-F)/F对lg [Q]作图,作脂质体Hsp90的双倒数曲线(图3)。由图3可以看出,在308 K、298 K、288 K温度下,结合常数Ka分别为1.2×103、1.2×104、1.4×105。可以推断脂质体和Hsp90之间存在较好的结合力。结合位点数为0.92±0.22。
2.3 磷脂与Hsp90结合作用力类型
在热力学中,不同类型反应之间的相互结合作用力不同。一般来说,作用力类型主要有疏水作用力、氢键作用力和范德华力。为判断磷脂和Hsp90之间的作用力类型,可以根据反应前后的热力学焓变(ΔH)和熵变(ΔS)的大小进行计算。若反应ΔH>0、ΔS>0,可以推断相互作用力为疏水作用力;若ΔH<0、ΔS<0,主要作用力为氢键和范德华力;若ΔH<0、ΔS>0,主要作用力为氢键和静电引力 [16]。ΔH和ΔS可以根据范特霍夫方程求出:
式中R是热力学气体常数8.314 J/(mol·K),以lnKa 对1/T作线性图(图4),由直线的斜率和截距计算出ΔH和ΔS,再根据方程ΔG=ΔH-TΔS计算自由能变ΔG,相关参数列于表1中。从表1中可以看出ΔG<0,说明磷脂对Hsp90的反应是自发进行的。其中ΔH<0,ΔS<0,推测Hsp90与磷脂结合的主要作用力为氢键和范德华力。
2.4 磷脂与Hsp90相互作用的红外光谱分析
磷脂酰胆碱(PC)与Hsp90相互作用的红外光谱如图5所示。波数2 850 cm-1、2 920 cm-1、2 945 cm-1附近的吸收峰表示CH2的对称振动以及CH2和CH3的反对称振动,它们反映了碳氢键的排列情况和磷脂相态变化 [17]。如果峰向低波数位移说明CH链的排列有序度升高 [17]。PC的浓度固定,在加入Hsp90后,这些吸收峰发生了位移或消失,推测Hsp90可能影响磷脂脂肪酸链的有序程度。