• 42 •CHINESE JOURNAL OF FAMILY PLANNING & GYNECOTOKOLOGY Volume 13 Number 4 2021
高楼逃生论著与临床研究
不同来源精子d n a碎片指数、顶体完整性与卵胞浆 内单精子注射技术助孕结局相关性分析
殷晨星，李澎涛，于晓光，邢鹏，王娜，师楠，孟娜娜，王玉真*
基金项目：保定市科技计划项目（项目编号：1951ZF084)
作者单位:〇71〇〇〇河北保定，保定市妇幼保健院生殖医学科
作者简介：殷晨星，毕业于河北大学，硕士研究生，主管检验师，主要研究方向为生殖医学
•通信作者，E-mail:wangyuzhendong@ 163. com
【摘要】目的探讨不同来源精子及其D N A碎片指数（D NA fragm en tatio n in d e x,D F I)和顶体完整性对卵
胞浆内单精子注射技术（intracy to p lasm ic sp e rm in je c tio n，丨C S I)受精和姓娘结局的影响。方
法回顾性分析
2017年5月至2020年5月因男性不育于保定市妇幼保健院行丨C S I的185个新鲜周期，按精子来源分为3组。
A组：诊断为严重少弱精子症的男性患者的射出精液（95个周期）；B组：睾丸取精精子（57个周期）；C组：附睾
取精精子（33个周期）。比较并分析3组精子D N A碎片率（用精子D F I表示）、顶体完整性的差异及对I C S I周
期的2P N率、2P N卵裂率、优胚率和妊娠率的影响。结果3种来源的精子I C S I周期中，B组D N A碎片率显著
低于A组和C组（P<0.05) ;3组间顶体完整性差弄无统计学意义（P>0.05)。A组、B组的2P N率高于C组，
A组的2P N卵裂率、优胚率明显高于B、C组（P<0.05) ;3组妊娠率比较差异无统计学意义（P>0.05)。
结论睾丸、附睾取精与严重少弱精子症患者手淫取精行1C S I的妊娠结局无统计学差异；睾丸精子D F I小于
附睾精子，严重少弱精子症患者手淫精子和睾九精子的受精结局好于附睾精子。
【关键词】严重少弱精子症；D F I；顶体完整性;IC S1
【中图分类号】R698+2【文献标志码】A【文章编号】16744020(2021 )04>042>04
doi：10.3969/j.is s n. 16744020. 2021. 04. 11
Correlation analysis of DNA fragmentation index, acrosome integrity of sperm from different sources and the pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm injection technique
YIN Chenxing，LI Pengtao，YU Xiaoguang，XING Peng，WANG N a，SHI N an，MENG N ana，W ANG Yuzhen’
Department of Reproductive Medicine,Baoding Maternal and Child Health Hospital,Baoding Hebei 071000, P. R. China
*Corresponding author ,E-mai\ ：173843944@qq. c o m
【Abstract】Objective T o explore the effects of D N A fragmentation index (D FI) and acrosome inte
怎样改善睡眠质量grity of sperm from different sources on the fertilization and pregnancy outcome of intracy toplasmic sperm injection (ICSI). Methods A retrospective analysis of 185 fresh cycles of ICSI in Baoding Maternal and Child Health Hospital from M a y2017 to M a y 2020 due to male infertility was divided into 3 groups according to the source of sperm. Group A：ejaculated s e m e n from male patients diagnod with vere oligoasthenospermia (95 cycles) ；G r oup B：sperm from the testis (57 cycles) ；G r oup C：sperm from the epididymis (33 cycles). T h e differences in sperm D N A fragmentation rate (indicated by sperm D F I) , acrosome integrity of 3 groups, and their influence on the 2P N rate, 2P N cleavage rate, excellent e mbryo rate and pregnancy rate of the ICSI cycle were compared and analyzed. Results In the ICSI cycle of sperm from three sources, the D N A fragmentation rate of group B was significantly lower than that of group A and group C
中国计划生育和妇产科2021年第13卷第4期• 43 •
(P<0. 05)；there was no significant difference in acrosome integrity between the three groups (P>0. 05 ). T h e 2P N rate of group A and group B was higher than that of group C. T h e2P N cleavage rate and excellent embryo rate of group A were significantly higher than tho of group B and C(P<0. 05)；there was no statistically significant difference in pregnancy rate between the three groups (P > 0. 05). Conclusion There are no statistically significant differences in pregnancy outcomes of ICSI be
tween testis and epididymal sperm retrieval and masturbation of vere oligoasthenospermia patients；the D FI of testicular sperm i s less than that of epididymal sperm, and the fertilization outcome of masturbated sperm and testicular sperm in patients with vere oligoasthenospermia was better than that of epididymal sperm.
【Key words】vere oligoasthenospermia;D F I； acrosome integrity；ICSI
辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART)近年来得到了很快发展。Palermo等[1]1992年首次报道了卵胞裝内单精子注射技术（intracy toplasmic sperm injection,ICSI)，在一定程度上解决了因男性因素导致的不育。随着显微外科技术的不断发展,Toumaye等;2|1994年报道了使用睾丸精子抽吸术（testicular sperm aspiration, TESA)或经皮附辜精子抽吸术（percutaneous epidydimal sperm aspiration,PESA)取出的精子行ICSI，这些技术使梗P且性无精子症患者获得自己的遗传学后代成为可能。梗阻性无精子症是指由于输精管道的梗阻或者缺如使精子的运输发生障碍，精子不能随精液排出体外。梗阻性无精子症约占男性不育的1%，在无精子症中的发生率约为42% ~48%[3^0
精子的发生是在睾丸、附睾内进行，完成了成熟和修饰过程，在时间和空间上非常严格，即不同来源的精子在畸形率、DNA碎片率、顶体完整性、成熟度等方面具有差异[5]。关于不同来源的精子对IC SI的受精结局和妊娠结局是否有影响，有很大争议。本文通过回顾性分析不同来源精子ICSI的受精和妊
娠结局，旨在探讨不同来源精子及其DNA碎片率和顶体完整性对ICSI受精和妊娠结局的影响，从而对临床工作提供依据。
1资料与方法
1.1研究对象与分组
回顾性分析2017年5月至2020年5月于保定市妇幼保健院生殖医学科接受治疗的185个ICSI新鲜周期，按精子来源分为3组。A组：诊断为严重少弱精子症的男性患者的射出精液（95个周期）；B组：睾丸取精精子(57个周期）；C组：附睾取精精子(33个周期）。纳人标准:①均为男方不育行ICSI，女方经检查无不孕因素，年龄矣35岁；②女方体质量指数（body mass index,BMI) 18~25 kg/m2;③血清卵泡刺激素（follicule-stimulating hormone,FSH) <10 mlU/mL;④双方没有染色体异常及Y染色体无精子因子（azoospermia factor,AZF)微缺失；
⑤梗阻性无精子症的诊断：至少3次体外排出精液经离心后显微镜检均未发现精子，诊断性手术取精可见成熟精子;⑥非圆头精子症患者。
1.2研究方法
1. 2. 1PESA和TESA方法 TESA主要采用局部麻醉结合睾丸穿刺活检获取睾丸组织，置人含1m L体外
操作液（G-mops Plus,Vitrolife)的培养皿中，用1m L注射器针头将曲细精管切碎，倒置显微镜（x400)下，观察是否有精子。PESA采用常规精索局部麻醉结合注射器抽吸法获取附睾液，置人含1mL体外操作液的培养皿中，倒置显微镜（x400)下，观察有无精子。若有精子，取精术结束，将培养液置人丨5 m L离心管中，300 g/m in离心，去上清，留0.2 mL沉淀，重复再洗一次，常温备用。
1-2.2 促排卵方案 女方促排卵方案均为黄体期促
性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone analogue，GnRH-a)长方案：黄体中期（排卵后的5~7d,—般为月经的第19 ~23 d)，给予短效GnRH-a (0. 1mg/d或0.05 mg/d，皮下注射）垂体降调节，降调节时间约14 ~ 16 d。降调节完毕后，测定体内性激素，B超检查双侧卵巢窦卵泡数及大小。开始启动促性腺激素（gonadotropin,Gn)，当至少有2 ~3个优势卵泡直径达18 mm，并参考黄体生成素（luteinizing hormone,LH)、雌二醇（estradiol，E2)、孕嗣（progesterone，P)，停用 GnRH-a、促排卵药，当晚肌注人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG)5 000 ~ 10 000 IU，注射 hCG 36 h后取卵。
1.2.3精子D N A碎片指数的检测 采用精子染色质
扩散试验。精子D N A碎片指数（D N A fra g m e n ta tio n i n d e x, DFI)是较稳定的指标，DFI > 25%被认为是异常值。x400倍显微镜下观察，根据光晕与精子头部横径的比例，光晕宽度大于精子头横径
1/3，表示精子D N A完整无碎片；光晕宽度小于精子头横径1/3，表示精子D N A有断裂为碎片现象。精子D N A碎片率>25%视为异常。
1.2.4精子顶体完整性检测 采用豌豆凝集素荧光标记法（fluorescein iso t hiocyanate conjugated pisum sativum agglutinin,FITC-PSA)，根据精子头部焚光的部位和形态来判断顶体完整性。精子远离颈部的头部约1/2以上荧光染色明亮且均匀，说明顶体完整；精子仅在赤道带出现荧光带，或顶体区没有荧光染色，说明已发生顶体反应；除上述两类精子外的所有精子为顶体异常精子。将精子顶体完整性<90%，视为顶体异常。
由于这3组来源的精子数量都比较少，所以取ICSI 操作之后，将剩余含有精子的培养液离心，取精子沉淀，进行实验操作，至少计数精子1〇〇条。
1.3相关分析指标
受精率=正常受精卵数/M n卵数X 100% ；卵裂率=卵裂胚胎数/正常受精卵数X 100%；优胚率=优胚数/2PN卵裂数x 100% ；临床妊娠率=妊娠周期数/移
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植周期数xlOO%。移植14d后，检验血p-hCG，了解是否妊娠,6周后B超示可见孕囊确诊为临床妊娠。
1.4统计学方法
采用SPSS 21. 0软件进行统计学分析，计量资料以
表示，若满足正态分布及方差齐性，则采用单因素方差分析.若不符合正态分布，则采用非参数检验进行比较。计数资料采用R x C表资料的采用Y检验，P<〇.〇5为差异有统计学意义。
2结果
2.1 3组患者一般情况比较
共纳人185个新鲜移植丨CS1周期。女方平均(29. 1 ±2.8)岁，女方基础FSH平均值为（8. 1 ±0. 9)mIU/niL; 3组在女方年龄、男方年龄、基础F SH水平、获卵数、移植胚胎数等方面比较，差异均无统计学意义（P>〇.05)，详见表1。
2.2 3组精子DNA碎片指数、顶体完整性和助孕结局比较
B组D FI明显低于A组和C组，差异有统计学意义(P<0.05);3组顶体完整性比较差异无统计学意义(P>0.
05)。A组、B组的2PN率髙于C组，A组的2PN 卵裂率、优胚率明显高于B、C组，差异有统计学意义(P<0.05);3组妊娠率比较差异无统计学意义（P> 0.05)。详见表2。
3讨论
不孕不育中约50%是男性因素[6]，其中主要包括严重少精子症、弱精子症及梗阻和非梗阻性无精子症等。在ART中，ICSI是治疗男性不育的一个重要有效手段。梗阻性无精子症患者可以通过PESA/TESA来获取附睾/睾丸精子。而不同来源的精子对ICS1后胚胎的发育和妊娠结局一直是临床工作者和胚胎学家关心的问题。解决这个问题需要追溯到精子的发生和精子相关分析。精子发生场所为睾丸的曲细精管，精子在睾丸形成过程中，经过了脱除细胞质和质膜重构等对受精至关重要的过程。精子膜重构决定了透明质酸酶和透明带受体的形成[7]。精子进人附睾后，在附睾内进一步成熟，获得一些功能，主要包括：精子的运动能力和受精能力等[8]。因此不同来源精子在功能相关方面可能存在差异，比如精子DFI和顶体完整性方面。
不同来源的精子对ICSI后胚胎发育和妊娠结局的影响争议不断，有学者认为睾丸精子的受精率、优胚率比附睾精子低，但附睾精子、睾丸精子及射出精子经过ICSI治疗后妊娠结局并无统计学差异有学者研究结果为睾丸精子组2PN受精率、卵裂率明显低于手淫精子组与附睾精子组，附睾精子组临床妊娠结局优于射精组及睾丸精子组，建议首选附睾取精["]。还有学者研究认为对于梗阻性无精子症患者，
睾丸精子和附睾精子行ICSI后可达到相似的妊娠结局，临床上可结合患者情况选择不同的取精方式[12]。而近期有一部分学者研究结果则证实睾丸精子较射出精子可获得更高的胚胎着床率、临床妊娠率和活产率[13]。最新研究认为睾丸精子组可移植胚胎明显高于附睾精子组，但治疗结局无差异[1<]。
本文研究结果显示睾丸精子组的D FI显著低于重度少弱精子症患者手淫精子组（以下称“手淫精子组”）和附睾精子组。经过ICSI治疗后，手淫精子组和睾丸精子组的2PN率显著高于附睾精子组，差异有统计学意义，这与多数学者的结果不尽一致。
睾丸精子中有一些物质避免精子过度成熟:15]；精子DNA损伤多发生于睾丸后阶段，精子在附睾体中存留时间较长，导致精子活力下降，老化死亡精子较多，活性氧过多损伤精子DNA[IW7]。再加之梗阻性无精子症患者精子长时间在附睾中淤积阻滞，不利于附睾精子的成熟发育，而且梗阻性无精子症多为炎症引起的梗阻，附睾内炎性物质及氧化应激容易导致精子损伤，因此理论上睾丸精子DNA损伤要小于附睾与精液中的精子，
表13组患者一般资料比较（E±0
组别周期数（个）女方年龄（岁）男方年龄（岁）基础FSH(m IU/m L)获卵数（枚）移植胚胎数（个）A组9529.5±2. 830. 1±2. 88.0 ±0.911.3 ±3.6 1. 8 ±0.4
B组5729. 0±2. 829.0 ±2. 68. 2 ±0.912. 7 ±3.7 1.9±0.3
C组3328.3±2.628. 4 ±2. 68.4±0. 812. 2 ±4. 4 1. 8 ±0.4
f值0. 3980.782 1.457 1.499 1. 189
P值0.67204590. 2360. 2260.307
表2 3组DFI、顶体完整性和助孕结局比较[%(个）]
组别周期数D F I异常顶体完整性异常2P N率2P N卵裂率优胚率妊娠率
A组9532.6(31/95)23.2(22/95)76.8(889/1157)97. 2(864/889)30.6(264/864)48.4(46/95) B组5712.3(7/57)26.3( 15/57)73.7(453/615)94.7(429/453)23. 8(102/429)45.6(26/57) C组3327.3(9/33)24.2(8/33)60.7(212/349)93. 3(168/180)21.4(36/168)45.5(15/33)尤2值8.5680. 19233.6048. 23710.3040. 153
p值0.0140. 9090.0000.0160.0060.927
一样的近义词本文结果也支持这一理论。精子D F I 代表了精子基因
的完整性和表观遗传学水平的正确性，直接影响了精卵 是否能成功进行正常受精。这和本文中的睾丸精子组
2P N 率要高于附睾精子组的结果是一致的。而手淫精 子组也高于附睾精子组，分析原因，可能是射出精子的 成熟度要比附睾精子高。DNA 损伤对后代安全性也有 一定的影响[2〇]，有学者通过应用转基因小鼠-B ig B l u e 这 种公认的突变检测模型研究发现，精子D N A 损伤对子 代遗传及表观遗传的稳定性影响很大[21]。还有学者认 为精子D F I 与复发性流产具有显著相关性，复发性流产 患者配偶D
F I 高于配偶无复发性流产史的生育男性[22]。
精子顶体完整性高除了在精卵自然结合过程中更 有利于精子经过透明带与卵子完成受精反应外，在I C S I 过程中还有利于精子通过发生钙离子激活反应激活卵 子，从而完成受精[23]。目前关于顶体对辅助生殖结局影 响的报道大部分是圆头精子症患者的案例，细胞内钙水 平升高是精卵结合所必需的，然而圆头精子不能或者不 能完全触发细胞内钙增加导致精子结合能力丧失或者 降低[24]。I C S I 可成功治疗圆头精子症，但受精率低，其 原因可能是卵母细胞活化因子降低。本文中人选患者 为非圆头精子症患者，且大多数注射进人卵母细胞的精 子都是具有完整顶体的，排除了精子钙离子对卵子激活 的影响。本研究显示顶体完整性在3组间差异无统计 学意义，经过I C S I 治疗后，手淫精子组和睾丸精子组的
2P N 率显著高于附睾精子组，差异有统计学意义。这说
明，经
I C S I 治疗后，不同来源的非圆头精子对胚胎发育
24小时时间表
的影响不是由顶体完整性这个因素导致的。
本文中手淫精子组的2P N 卵裂率、优胚率明显高于 睾丸精子组、附睾精子组；睾丸精子组与附睾精子组相 比,2P N 卵裂率、优胚率差异都不明显。3组妊娠率比较 差异无统计学意义。虽然手淫精子组2P
N
卵裂率、优胚
率要髙于睾丸精子组和附睾精子组，但最终的妊娠结局 没有受到影响。这也可能跟样本数量有限、女方各种因 素的差异性有关，我们期待今后收集更充分、有效的样 本，做更科学、前瞻性的研究。
综上所述,I C S I 选择不同来源的精子中，睾丸精子 能达到手淫精子相似的胚胎发育和妊娠结局。如果不 能得到手淫精子，由于睾丸精子D N A 损伤要小于附睾 精子，对后代的安全性可能更高；而且睾丸精子的正常 受精率要高于附睾精子，因此可以优先选择睾丸精子行 I C S I 。【参考文献】
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(收稿日期:2020~08-16编辑：向晓莉）
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