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环球中医药2021年9月第14卷第9期 Global Traditional Chine Medicine,September 2021,Vol.14,No.9
㊃基础研究㊃
基金项目：国家自然科学基金(81560755)；广西中医药大学引进博士科研启动基金(2018BS021)；广西研究生教育创新计划(YCSY20190031)
作者单位:530001 南宁，广西中医药大学药学院[韦薇(硕士研究生)㊁郑伟灏(硕士研究生)]，中药学教研室(覃骊兰㊁李莉)
作者简介：韦薇(1994-)，女,2018级在读硕士研究生㊂研究方向：中药验方药效实验及临床应用研究㊂E⁃mail:
通信作者：李莉(1980-)，女，博士，主治医师㊂研究方向：中医药调节糖脂代谢紊乱及过敏性疾病的治疗与
研究㊂E⁃mail:
基于PI3K /Akt /mTOR 信号通路探讨玉屏风散对肥大细胞脱颗粒的影响
卜算子咏梅拼音
韦薇 覃骊兰 李莉 郑伟灏
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【摘要】 目的 探讨玉屏风散及其有效组分抑制肥大细胞活化脱颗粒的过程是否与PI3K /
百香果柠檬蜂蜜Akt /mTOR 信号通路相关㊂方法 在体外用细胞计数CCK⁃8(cell counting kit⁃8)方法观察玉屏风散对P815肥大细胞是否有抑制其存活性的作用；用胰蛋白酶(1μg /mL)刺激P815肥大细胞的方法建立肥大细胞脱颗粒模型，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中β⁃氨基己糖苷酶(β⁃hexosaminida,β⁃Hex)㊁组胺㊁白细胞介素(interleukin,IL)⁃4㊁IL⁃13㊁血小板激活因子(platelet
activating factor,PAF)等相关细胞因子释放浓度变化；蛋白质印迹法(Western blot)检测相关蛋白磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶(phosphatidylinositol 3⁃kinas,PI3K)㊁蛋白激酶B (protein kina B,PKB /Akt)㊁哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及其磷酸化水平的表达；实时荧光定量PCR(real⁃time quantitative PCR,qRT⁃PCR)检测PI3K㊁Akt㊁mTOR 在mRNA 水平上的表达量变化㊂结果 玉屏风散浓度为25μg /mL 以下时对细胞活性无明显抑制作用，在浓度为12.5μg /mL㊁25μg /mL 时玉屏风散能有效抑制β⁃Hex㊁组胺的释放及IL⁃4㊁IL⁃13㊁PAF 的分泌(P <0.05);Western blot 结果显示玉屏风散有一定抑制PI3K㊁Akt㊁mTOR 的磷酸化作用(P <0.05);qRT⁃PCR 结果显示其能降低PI3K㊁Akt㊁mTOR 的表达(P <0.05)㊂结论 玉屏风散对肥大细胞脱颗粒活化的抑制作用可能是通过
抑制PI3K /Akt /mTOR 信号通路实现的㊂
【关键词】 玉屏风散; 肥大细胞; 脱颗粒活化; PI3K /Akt /mTOR 信号通路; 过敏性疾病; β⁃氨基己糖苷酶; 白细胞介素; 血小板激活因子
乡间的暑假生活【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2021.09.005Study on the effect of Yupingfeng powder on mast cell degranulation bad on PI 3K /Akt /mTOR pathway
江苏省如皋市WEI Wei ,QIN Lilan ,LI Li ,ZHENG Weihao
Guangxi University of Traditional Chine Medicine ,Nanning 530001,China Corresponding author :LI Li ,E⁃mail :
【Abstract 】 Objective To investigate whether the mechanism of Yupingfeng powder and its effective components inhibiting the activation and degranulation of mast cells is related to PI3K /Akt /mTOR signaling pathway.Methods CCK⁃8method was ud to obrve whether Yupingfeng powder can inhibit the viability of P815mast cells in vitro.Mast cell degranulation model was established by stimulating P815mast cells with trypsin (1μg /mL),and the supernatant of cells was collected.ELISA method was ud to
detect the changes of the relea concentration of β⁃hexosaminida(β⁃Hex),histamine,interleukin(IL)⁃
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4,IL⁃13,platelet activating factor(PAF)and other related cytokines in cell supernatant;Western blot was
ud to detect the expression of related proteins phosphatidylinositol⁃3⁃kina(PI3K),protein kina B
(PKB/Akt),mammalian target of rapamycin(mTOR)and its phosphorylation levels;real⁃time fluorescent quantitative PCR(qRT⁃PCR)was ud to detect the changes of PI3K,Akt,mTOR,and mRNA levels.
Results At the concentration of12.5μg/mL and25μg/mL,Yupingfeng powder can effectively inhibit
the relea ofβ⁃Hex,histamine and the cretion of IL⁃4,IL⁃13and PAF(P<0.05).Western blot results
showed that Yupingfeng powder could inhibit the phosphorylation of PI3K,Akt and mTOR(P<0.05);
qRT⁃PCR results showed that it can reduce the expression of PI3K,Akt and mTOR(P<0.05).
Conclusion The inhibitory effect of Yupingfeng powder on the degranulation activation of mast cells may
be achieved through inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
【Key words】 Yupingfeng powder; Mast cells; Mechanism of action; PI3K/Akt/mTOR
signaling pathway; Allergic dia; β⁃hexosaminida; Interleukin; Platelet activating factor
过敏性疾病(allergic dia)反复发作且难以根治已经成为全球最受关注的公共卫生问题之一[1]㊂据世界变态反应组织统计，近30年来，过敏性疾病的发生率至少增加了3倍，目前全球总患病率已达22%㊂近年来，特异性生物标志物㊁信号与蛋白相关机制是过敏学科的研究热点[2]㊂肥大细胞是过敏性疾病发病的主要效应细胞，存在于机体的大多数组织如皮肤㊁呼吸道㊁黏膜㊁腹腔中，被抗体激活的肥大细胞脱颗粒后产生的炎性介质与细胞因子会参与多种炎症免疫性疾病如过敏反应㊁哮喘等，所以肥大细胞脱颗粒机制在过敏性疾病的发展进程中起到关键性作用[3⁃7]㊂研究发现调控白细胞介素信号与磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶(phosphatidylinositol3⁃kinas,PI3K)/蛋白激酶B (protein kina B,PKB/Akt)信号通路，与治疗过敏性疾病密切相关[8⁃10]㊂目前，现代医学治疗此病主要以控制疾病症状为主，无
法有效缓解反复发作，而且副作用明显[11]，而中医药治疗过敏性疾病有着独特的优势，疗效显著，且副作用较小㊂现代研究表明玉屏风散在治疗哮喘㊁鼻炎㊁荨麻疹等过敏性疾病都有显著疗效[12⁃14]，且玉屏风散可以显著减轻肥大细胞脱颗粒，可以通过抑制肥大细胞脱颗粒相关作用机制来治疗过敏性疾病[15⁃17]㊂因此，本研究通过建立体外肥大细胞脱颗粒模型，来验证玉屏风散发挥抗过敏反应的作用是否与肥大细胞脱颗粒作用机制和PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路有关㊂
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
玉屏风散浸膏：根据2015版‘中华人民共和国药典(一部)“玉屏风项下提取方法，按3∶1∶1比例取黄芪600g㊁防风200g㊁白术200g，将200g防风予以碎断，加4倍量的水浸泡2小时，蒸馏提取5小时，另收集蒸馏后的水溶液，将蒸馏后的药渣与
600g黄芪㊁200g白术一起煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，过滤，滤液浓缩至适量，加适量乙醇至含醇量70%，搅拌，静置，过滤，滤液加压回收乙醇，加入挥发油及蒸馏后的水溶液，浓搅拌，静置，取上清液，过滤，滤液浓缩得156.611 g浸膏量(1g浸膏含6.3852g生药)，置-20°冰箱保存备用㊂ios应用锁
黄芪㊁防风㊁白术(广西仙茱中药科技有限公司，批号:20190101㊁2019040㊁20190602)；胰酶(武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号:52419);CCK⁃8(新赛美生物科技有限公司，批号:N9091085)；小鼠单抗PI3K(武汉三鹰生物技术有限公司，批号:60225⁃1⁃Ig)，兔多抗p⁃PI3K(Abcam公司，批号: Ab182651)；兔多抗Akt(Bioss公司，批号:Bs⁃0115R);p⁃Akt(Affinity公司，批号:AF0016)；兔多抗mTOR(武汉三鹰生物技术有限公司，批号: 20657⁃1⁃AP);p⁃mTOR(CST公司，批号:5536t);β⁃氨基己糖苷酶(β⁃hexosaminida,β⁃Hex)㊁组胺㊁白细胞介素(interleukin,IL)⁃4㊁IL⁃13㊁血小板激活因子(platelet activating factor,PAF)酶联免疫分析试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号:202004); Trizol(Ambion公司，批号:15596⁃026);HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，批号: BA1054)㊂
1.2 细胞株与分组
小鼠肥大细胞瘤P815购自中国科学院干细胞库，编号:SCSP⁃516㊂细胞状态为部分悬浮㊁部分贴壁生长㊂使用高糖伯克改良伊格尔培养基
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(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)培养基，含10%胎牛血清(fetal bovine rum,FBS),1%双
抗㊂培养于37℃㊁5%CO2培养箱中，待细胞密度达到80%~90%时，调整相应的细胞数量进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验㊂将P815细胞随机分为4组：空白组㊁模型组㊁玉屏风散高剂量组㊁玉屏风散低剂量组㊂
1.3 仪器设备
细胞恒温培养箱(美国Thermo公司)；生物安全柜(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯科技公司);Epoch2T型吸收光酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)；全自动细胞计数仪(伯乐生命医学产品有限公司)；离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)㊂
1.4 CCK⁃8测定P815细胞存活率
将玉屏风散浸膏用不含血清高糖DMEM培养基按稀释为1.5625μg/mL㊁3.125μg/mL㊁6.25μg/mL㊁12.5μg/mL㊁25μg/mL㊁50μg/mL㊁100μg/mL7个浓度梯度，置于4℃冰箱保存㊂取对数生长期的P815细胞，用DMEM培养液(无血清)按1×105/mL 密度接种于96孔板，每孔100μL㊂设置空白组(培养基)㊁对照组(细胞㊁培养基)㊁给药组(细胞㊁培养基㊁玉屏风散)，每组设置5个复孔㊂饥饿处理24小时使其同步化后，吸走每孔内原培养液，给药组分别加入100μL含终浓度(1.5625μg/mL㊁3.125μg/mL㊁6.25μg/mL㊁12.5μg/mL㊁25μg/mL㊁50μg/mL㊁100μg/mL)的玉屏风散DMEN培养液，空白组㊁对照组加入等体积无药DMEM培养液，置于恒温培养箱继续孵育㊂24小时后，吸走各孔内培养液，每孔加
入含10%CCK⁃8的培养液,37℃,5%CO2继续孵育1.5小时，利用酶标仪测定各孔在波长450nm处的吸光度(optical delnsity,OD)值，重复3次[18⁃19]㊂计算各浓度组细胞存活率，细胞存活率%=(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100%㊂
1.5 酶联免疫吸附法检测β⁃Hex㊁组胺等炎性因子水平
取对数生长期的P815细胞计数，用无血清培养基稀释成5×105/mL密度的单细胞悬液，接种到6孔板上，设置空白组㊁模型组㊁玉屏风散高剂量组(25μg/mL)㊁玉屏风散低剂量组(12.5μg/mL)，每组设置3个复孔，每孔2mL，置37℃,5%CO2细胞培养箱中，培养24小时㊂待细胞至80%融合度，于细胞空白组加入等体积DMEM培养液；细胞模型组用等体积DMEM培养液代替受试药物，玉屏风散高㊁低剂量组分别加入不同浓度的药物，继续培养在37℃,5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中，在药物作用6小时后，模型组㊁玉屏风散高剂量组与玉屏风散低剂量组加入500μL胰蛋白酶(终浓度1μg/mL)刺激，空白组加入等体积的磷酸缓冲盐溶液
(phosphate buffer saline,PBS)，分别收集刺激l小时后的细胞上清液与细胞，上清液用来检测β⁃氨基己糖苷酶(β⁃hexosaminida,β⁃Hex)㊁组胺㊁IL⁃4㊁IL⁃13㊁PAF等细胞因子的分泌情况，孔板壁上的细胞用于后续提取蛋白[20]㊂细胞上清液严格按照酶联免疫分析试剂盒操作步骤，记录各细胞因子吸光度值㊂
1.6 Western blot法检测PI3K㊁Akt㊁mTOR蛋白及其磷酸化的表达
将1.5步骤收集到的6孔板细胞，使用PIPA裂解液进行裂解提取蛋白，蛋白定量变性后，各蛋白以上样量40μg使用SDS⁃PAGE凝胶进行电泳分离，电转至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶封闭,1%的BSA封闭磷酸化蛋白，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2小时，采用凝胶成像系统拍照，用IPP对灰度值进行分析，使用GAPDH作为内参㊂
1.7 实时荧光定量PCR法检测PI3K㊁Akt㊁mTOR 蛋白表达量
收集1.5收集到的细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR(real⁃time quantitative PCR, qRT⁃PCR)实验检测各组细胞的PI3K㊁Akt㊁mTOR在mRNA水平上的表达，引物序列如表1㊂相对表达量运用2-ΔΔCt法计算㊂
表1 引物序列
基因名称引物Sequence(5′to3′)PCR Products
GAPDH Forward ATGGGTGTGAACCACGAGA
Rever CAGGGATGATGTTCTGGGCA229bp
PI3K Forward ACCTGGACTTAGAGTGTGCC
Rever TCAGCAGTGTCTCGGAGTTT217bp
Akt Forward CTGCCCTTCTACAACCAGGA
Rever CATACACATCCTGCCACACG214bp
mTOR Forward CGCTACTGTGTCTTGGCATC最大飞机
Rever GGTTCATGCTGCTTAGTCGG154bp
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1.8 统计学处理
采用SPSS21.0软件分析，数据均为计量资料，用均数±标准差(x±s)表示，除PI3K蛋白表达结果呈偏态分布外，其余各组均符合正态性分布㊂多重比较时，偏态分布数据(PI3K蛋白表达结果)使用秩和检验法检验，符合正态性分布且方差齐的数据
(IL⁃4㊁β⁃Hex㊁组胺㊁PAF㊁Akt㊁mTOR㊁p⁃PI3K等)使用LSD法检验，符合正态分布但方差不齐的数据(CCK8㊁IL⁃13)使用Dunnett T3法检验,P<0.05时认为差异有统计学意义㊂
2 结果
2.1 玉屏风散对P815细胞存活率的影响
对比其他组，玉屏风散在25μg/mL浓度以下时,P815细胞存活率达到80%以上，无明显抑制作用,50μg/mL浓度以上存活率低于80%,50μg/mL 与100μg/mL浓度两组对比其他5组有显著差异，差异有统计学意义(P<0.01)㊂如图
1㊂
图1 不同浓度玉屏风散对P815细胞存活率比较2.2 玉屏风散对β⁃Hex㊁组胺等炎性因子水平的影响
胰酶刺激P815肥大细胞脱颗粒后，对比空白组，模型组细胞上清液中的β⁃Hex㊁组胺㊁IL⁃4㊁
IL⁃13㊁PAF浓度都有显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)；对比模型组，玉屏风散高剂量组与玉屏风散低剂量组的β⁃Hex㊁组胺㊁IL⁃4㊁IL⁃13㊁PAF浓度显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)㊂如表2㊂2.3 玉屏风散对PI3K㊁Akt㊁mTOR及其磷酸化蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组㊁玉屏风散高剂量组和玉屏风散低剂量组PI3K㊁Akt㊁mTOR表达变化都无明显差异(P>0.05)磷酸化后的p⁃PI3K㊁p⁃Akt㊁p⁃mTOR表达变化有显著差异，且差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，玉屏风散高剂量组p⁃PI3K㊁p⁃Akt㊁p⁃mTOR表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，玉屏风散低剂量组p⁃PI3K无明显变化,p⁃Akt㊁p⁃mTOR表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)㊂如表3㊁图2㊂
2.4 玉屏风散对PI3K㊁Akt㊁mTOR蛋白表达量的影响
胰酶刺激P815肥大细胞活化脱颗粒后，与空白组比较，模型组PI3K㊁Akt㊁mTOR基因的相对表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，玉屏风散高剂量组与玉屏风散低剂量组PI3K㊁Akt㊁mTOR基因的相对表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)㊂如表4㊂
表2 玉屏风散对各炎性因子浓度的影响(x±s,n=3)
组别β⁃Hex(ng/mL)组胺(ng/mL)IL⁃4(pg/mL)IL⁃13(pg/mL)PAF(ng/mL)空白组52.49±0.890.07±0.06105.64±1.6781.63±1.0339.30±0.29模型组86.56±0.46a 2.74±0.06a401.20±1.33a156.20±1.31a76.42±1.15a
玉屏风散高剂量组68.41±0.24b0.64±0.02b242.09±5.71b96.49±4.40b47.42±3.00b 玉屏风散低剂量组75.42±0.43b0.81±0.02b257.42±3.83b106.20±0.29b57.72±0.70b 注：与空白组比较,a P<0.01；与模型组比较,b P<0.01㊂
表3 玉屏风散对PI3K㊁Akt㊁mTOR及其磷酸化蛋白表达的影响(x±s,n=3)组别PI3K p⁃PI3K Akt p⁃Akt mTOR p⁃mTOR 空白组0.66±0.070.12±0.020.72±0.040.11±0.050.62±0.010.09±0.04模型组0.68±0.070.44±0.05a0.74±0.040.45±0.06a0.63±0.070.33±0.06a 玉屏风散高剂量组0.69±0.060.21±0.02c0.73±0.030.22±0.07c0.62±0.020.12±0.05c 玉屏风散低剂量组0.69±0.090.40±0.050.68±0.060.38±0.05b0.59±0.030.24±0.09b 注：与空白组比较,a P<0.01；与模型组比较,b P<0.05,c P<0.01㊂
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注:A空白组;B模型组;C玉屏风散高剂量组;D玉屏风散低剂量组
图2 玉屏风散抑制PI3K㊁Akt㊁mTOR及其磷酸化蛋白的表达情况表4 玉屏风散对PI3K㊁Akt㊁mTOR蛋白
在那里的英文表达量的影响(x±s,n=3)
组别PI3K Akt mTOR
空白组
模型组
玉屏风散高剂量组玉屏风散低剂量组0.98±0.17
3.54±0.33a
1.51±0.26c
2.32±0.26c
0.93±0.06
4.35±0.82a
1.89±0.42c
2.56±0.32c
1.25±0.22
3.46±0.78a
1.73±0.37c
2.37±0.37b
注：与空白组比较,a P<0.01；与模型组比较,b P<0.05,c P<0.01㊂3摇讨论
实验结果表明，玉屏风散可以降低肥大细胞中β⁃Hex㊁组胺㊁IL⁃4㊁IL⁃13㊁PAF炎性因子水平，并对PI3K㊁Akt㊁mTOR蛋白的表达有调节作用，说明了玉
屏风散是通过抑制肥大细胞活化脱颗粒释放炎性因子来减轻过敏反应，其作用机制与PI3K/Akt/ mTOR信号转导通路有关㊂
过敏性疾病在新生儿到老年人的各个年龄阶段都可能会发生，主要包括皮肤过敏反应㊁呼吸道过敏反应㊁消化道过敏反应等㊂过敏反应发病机制主要由免疫球蛋白介导，抗原(Ag)可以通过交联的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E结合肥大细胞上的特异性亲和受体(FcεRI)，激活肥大细胞内部进行一系列磷酸化反应和炎症因子合成，使细胞内钙离子浓度升高，导致肥大细胞脱颗粒化并释放组胺㊁β⁃Hex㊁前列腺素(prostaglandins,PGs)和白三烯(leukot⁃rienes,LTs)㊁PAF等炎性介质;Ag也可以通过交联的IgG结合肥大细胞上的特异性亲和受体(FcγRIII)刺激肥大细胞产生PAF㊂PAF可凝聚和活化血小板使之释放组胺等，增强过敏反应,PAF 和组胺主要通过诱导平滑肌收缩和增加血管通透性引起过敏反应症状[21⁃25]㊂另一种现代研究认为，过敏反应是一种由辅助型T细胞2(T helper2cell, Th2)细胞因子引发的免疫系统失调疾病,Th2细胞主要产生IL⁃4㊁IL⁃5㊁IL⁃6㊁IL⁃10及IL⁃13等细胞因子，介导体液免疫应答[
26]㊂IL⁃4㊁IL⁃13与过敏反应密切相关,IL⁃4㊁IL⁃13可以激活B细胞产生IgE㊂研究表明，哮喘㊁变应性鼻炎发作过程中被活化的免疫细胞会释放IL⁃4㊁IL⁃13等炎性介质，引起支气管收缩㊁血管通透性增加等炎症反应[27]㊂IL⁃4可以启动肥大细胞分化,IL⁃13可促进IL⁃4的作用，两者共同作用，促使并加重炎症的形成与发展㊂因此，抑制这几种炎症性因子是治疗过敏性疾病的有效途径㊂
PI3K/Akt/mTOR信号通路是参与炎症的发生㊁发展的重要信号通路，也是重要的细胞内途径之一㊂PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，能够调节众多细胞内信号级联的激活，以及多种炎症介质功能的发挥，在PI3K下游的直接作用靶点是蛋白激酶Akt，也是最关键的靶酶，负责传递PI3K相关的生物信息㊂PI3K的脂类激酶活性，可以催化Akt磷酸化，磷酸化的Akt从细胞质转移到细胞膜上，通过直接和间接两种途径激活底物mTOR蛋白，调节下游细胞生长㊁增殖和炎症靶基因的表达[28]㊂在靶细胞水平上，通过PI3K可诱导合成内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide syntha,eNOS)，由eNOS催化产生的一氧化氮可加剧过敏反应㊂有研究表明，通过影响PI3K的表达，抑制Akt与mTOR的磷酸化水平，可以减轻炎症反应的发生与发展[29⁃30]㊂
肥大细胞脱颗粒试验是过敏反应模型常用的一种方法㊂彭博[31]在相同刺激条件下比较P815和RBL⁃2H3细胞激活后脱颗粒反应差异，结果发现P815细胞是活化后脱颗粒时间出现更早㊁程度更高
