第十八章 圆环病毒科的反向遗传学
第一节 圆环病毒的基本特征
一、病毒的分类
根据国际病毒分类委员会(ICVT)第8次国际病毒分类报告，可将圆环病毒科(Circoviridae)分为两个属：圆环病毒属(Circovirus)和圆圈病毒属(Gyrovirus)。其中，圆环病毒属主要包括猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)1型和2型、鸽圆环病毒(Pigeon circovirus，PiCV)、鹅圆环病毒(Goo circovirus，GoCV)、鹦鹉喙羽病病毒(Psittacine beak and feather dia virus，PBFDV)、金丝雀圆环病毒(Canary circovirus，CaCV)、牛圆环病毒(Bovine circovirus，BoCV)和鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)等；而圆圈病毒属目前只有鸡传染性贫血病毒(Chicken anaemia virus，cIAV)一个成员。曾列在圆环病毒科之内的输血性肝炎病毒(没有办法的成语Transfusion-transmitted virus，TTV)，现已更名为细环病毒(Torque teno virus，TTV)，暂列为未定科的指环病毒属(Anello virus)，该属包括细小环病毒(Torque teno mini virus，TTMV)[1]。
二、病毒的颗粒结构
圆环病毒颗粒一般呈球形或六角形(图18-1)，无包膜，大小为12～27nm。基因组为单分环状的单股DNA，大小小于2.5kb。其可读框(ORF)由正义或双义链编码，病毒衣壳呈正二十面体，是目前已知的最小的动物病毒。以CIAV为例，其粒子平均直径为23～25nm，电镜下呈球形或六面体形。核衣壳由32个结构亚单位组成，分子质量约50kDa，基因组长2139个核苷酸，包括3个部分或完全重叠的可读框。病毒复制、转录和翻译的过程均在感染细胞中，单链DNA先以滚环方式复制成双链复制中间体，再以其中一条链为模板转录成一条非剪接多顺反子mRNA，其上含有3个部分重叠的基因，每个基因都有各自的起始和终止密码子，翻译3种蛋白质，分别称为VPl、VP2和VP3。
图18-1猪圆环病毒的病毒颗粒及结构模式图
第二节 圆环病毒基因组的结构特征及其表达产物
一、基因组的结构特征
PCV的基因组为单股、环状、双向DNA，病毒DNA及其在宿主细胞内复制的中间产物均能指导病毒蛋白合成，编码7个潜在的可读框，目前已明确了2个主要的ORF。研究发现，病毒基因组由2个头头相对排列的ORF和其间的基因间隔区组成，其中，较大的经病毒正向DNA转录，为Rep基因，编码病毒复制酶相关蛋白；较小的ORF经病毒DNA互补链转录并翻译出病毒的衣壳蛋白(Cap)。PCV-2 ORF3的编码产物也已得到鉴定，主要介导圆环病毒诱导的细胞凋亡，但对病毒的复制却是非必需的。PCV最小的DNA复制起始区位于第728～838位碱基，包含基因间隔区及Rep基因和Cap基因的不同翻译起始元件。复制起始区形成一个茎一环结构。其中，PCV-1的环由12个碱基组成，PCV-2的环由10个碱基组成，二者存在共同的8核苷酸序列(AGTATTAC)，该保守基序也存在于其他圆环病毒的基因组内。环的侧翼序列为含有11个碱基的倒置重复序列，形成回文结构。茎一环右臂存在4个保守的6核苷酸序列，即CGGCAG(H1、H2、H3和H4)。其中，H1与H2相连、H3与H4相连，二者间隔5个核苷酸。
CIAV的全基因组包括3个部分或完全重叠的ORF，分别编码三种蛋白：VPl、VP2和VP3。此外，CIAV基因组还含有潜在的启动子一增强子元件和一个poly(A)信号。Meehan等[2]的研究结果表明，CIAV的启动子-增强子元件位于转录起始点上游，开始于TATA盒，TATA盒上游有spl的结合位点，再往上游是4个或5个(根据不同毒株而不同)长21bp的重复序列，这些重复序列之间有一个126bp的插入序列，可能参与CIAV的感染和DNA的转录过程。
二、基因组的表达产物及其功能
(英语表语一)PCV基因组的表达产物
Rep蛋白，由PCV最大的可读框ORFl编码，分子质量为35.6kDa (PCV-1)或35.8kDa (PCV-2)，由312aa (PCV-1)或314aa (PCV-2)组成。PCV-1的Rep蛋白仅有一个糖基化位点，位于第20～22位氨基酸；PCV-2的Rep则含有3个糖基化位点，分别位于第23～25位，第256～258位及第286～288位氨基酸。Rep蛋白具有与典型滚环复制(RCR)相关的3个保守基序年度规划怎么写Ⅰ(FTLNN)、Ⅱ (HLQG)、Ⅲ (YCSK)以及结合dNTP的P环(P-loop)结构，这些结构对于维持Rep蛋白的功能至关重要，突变或缺失这些元件均会影响病毒的复制。
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Mankertz等[3]发现，PCV-1与复制有关的蛋白质有两个，即Rep和Rep′，分别对应1250nt和750nt的RNA。前者由ORFl(819～1757bp)编码，含有939个碱基，后者位于ORFl内(819～1175bp，1559～1706bp)，长505个核苷酸。ORFl的第1176～1558位碱基则为非编码区，在mRNA转录后加工过程中，经过剪接作用被切除，使两段序列形成一个完整的可读框而被翻译成Rep′蛋白。Steinfeldt等的研究结果表明，Rep和Rep′ 在PCV-1的复制过程中是相互作用、缺一不可的。Rep转录起点位于第766位碱基(±10bp)。第766～774位碱基(5′-TAGTATTAC-3′ )高度保守，可形成一个茎二环结构为PCV-1的复制起点。与复制起点相邻的第785～813位碱基含有一个重复序列：CGGCAGCGG／TCAG。Rep和Rep′ 即结合在复制型病毒基因组的复制起点和重复序列处，起始病毒的复制。
PCV-1 回乡偶书的古诗rep基因的启动子(Prep)已被定位，位于PCV-l基因组第640～796位核苷酸，是基因间隔区(intergenic region)。rep基因上游，与PCV-1的复制区有部分重叠，含有两个可能的细胞因子反应元件。Rep蛋白的表达可以抑制prep启动子的活性，这种负调控作用是通过Rep蛋白与H1／H2结合来实现的；而Rep′ 蛋白及ORF2编码蛋白(Cap)的存在对该启动子无影响。如将Rep蛋白中与RCR相关的基序Ⅱ，P环突变及从N端缺失一半的可读框，均会使Rep蛋白的负调控作用丧失。但令人惊讶的是，将与RCR相关的基序Ⅰ突变，从FTLNN突
变为LTLKN，Rep蛋白仍保留对Prep启动子的抑制活性，Mankertz等[4]以PCV-1感染性核酸转染PKl5细胞，对rep，rep′ 两种RNA转录物的比例进行测定，发现在感染的早期(12h)两者比例相当，但24～36h时rep′ 转录物比例明显增加，随后48～96h时rep′ 逐步下降，这可能说明两种rep转录物在病毒复制过程中进行着精细的调控，以利于病毒的繁殖复制。
Cap蛋白，为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，由ORF2编码，含有233个氨基酸。Cap蛋白只有一个糖基化位点。多肽扫描结果显示，PCV-1与PCV-2的Cap蛋白存在共同的抗原决定簇，但血清学实验却显示，两种血清型的Cap蛋白没有抗原交叉性，即PCV-2的Cap蛋白抗体(或抗原)不能与PCV-1Cap蛋白(或抗体)发生反应，这可能是因为该抗原决定簇被整个Cap蛋白掩盖了。此外，PCV-2 Cap蛋白上还存在3个特异性抗原位点(65～87aa，113～139aa及193～207aa)。
Cap蛋白的N端富含碱性氨基酸(如精氨酸)，比较保守，与蛋白质的核内定位有关。Liu等对PCV-2 ORF2基因(cap基因)进行一系列突变表明，Cap蛋白的核内定位与其N端的41个氨基酸密切相关；进一步研究发现，位于12～18位及34～41位的氨基酸对Cap蛋白的核内定位起着决定性的作用[5]。
PCV-2的ORF2基因表达蛋白质可以组装成病毒衣壳样颗粒，此特征与许多无囊膜病毒，如多瘤病毒(PAV)、细小病毒(PPV)和戊型肝炎病毒(CHEV)相似。
ORF3蛋白，是一种新发现的PCV-2的蛋白质。利用反向遗传学技术敲除其编码基因，发现该蛋白质的缺失并不能影响病毒在小鼠体内的有效复制，但病毒的致病力减弱，不能在小鼠体内产生任何明显的显微病变。此外，小鼠的外周血液淋巴细胞(PBLC)中的CD4十、CD8一和CD4+CD8+T细胞亚群数量明显减少，证明ORF3蛋白可能是通过其在体内诱导细胞凋亡的活性直接参与病毒的致病过程。进一步研究揭示，ORF3是通过活化的胱门蛋白酶-8和胱门蛋白酶-3途径参与细胞的凋亡过程。而另据研究发现，ORF3蛋白诱导细胞凋亡，主要是通过特异性地与pPirh2(for p53-induced protein with a RING-H2 domain)，即E3泛素连接酶结合，并抑制pPirh2的稳定性，从而增加肿瘤抑制因子p53的表达，最终引起细胞凋亡[6]。
(二)CIAV基因组的编码产物
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CIAV基因组单链有完全重叠的3个可读框(ORF)，分别编码衣壳蛋白VPl、相关蛋白VP2和细胞凋亡因子VP3蛋白，这3个蛋白质均可在CIAV感染的细胞中确切地表达(图18-2)。
节水器具图18-2 CIAV的核酸转录和翻译示意图
→、 分别代表起始和终止密码子
VPl是纯化的CIAV游离病毒粒子表面唯一的衣壳蛋白，分子质量大小为50kDa。Todd等研究发现，VPl的N端含有一个氨基酸拖迹----组蛋白的前体，主要由精氨酸组成，能够与DNA链牢固地结合在一起，起保护DNA的作用。研究发现VPl在各种CIAV分离株中存在较大差异。Farkas等[7]证明CIAV TK-5803分离株的核苷酸序列与其他CIAV分离株存在差异。这些差异导致了编码蛋白质氨基酸的改变，其中在VP3蛋白后半部分(C端)有6个位置的氨基酸发生改变，VP2的C端1／4部分有4个位置的氨基酸发生改变，而在VPl中有17个
氨基酸发生改变。这一结果显示，VP3的N端半部分和VP2的N端3／4部分是非常保守的，这种保守性对维持其功能可能是至关重要的；而VPl的氨基酸变异较大，这可能是由于VPl是衣壳蛋白，其变异可以导致不同的CIAV分离株之间VPl的抗原性发生改变。
VP2为辅助性蛋白，位于感染细胞核内包涵体中，游离的CIAV病毒粒子中未发现明显VP2蛋白的存在，但在病毒感染细胞中却表达了VP2，分子质量大小为24kDa。表明其在CIAV的核酸复制和病毒装配过程中可能起着重要作用。Noteborn等[8]研究发现，在杆状病毒昆虫细胞表达系统中，单独VPl或VP2的表达产物或其简单混合物不能刺激鸡产生中和抗体，而用VPl与VP2共同表达的重组病毒表达产物免疫鸡则可诱导中和抗体产生。表明VP2参与了CIAV中和抗原表位的组成，并且可能是VPl和VP2共同组建了CIAV中和性抗原位点。但其详细特性及其与宿主的相互作用有待进一步研究。
