环境昆虫学报2021, 43 (1)： 260 -264
Jooroat p Esvimomeotol Entomology
htt p ： 〃hjkcxb. ahjouRaW. net
doi ： 1003969 Lji s n01674 -085802021001028
陈大嵩，黄鸿，吴华，李健雄，戴建青-利用纳米孔测序鉴定菴麻蚕病害[J ]-环境昆虫学报，2021, 43 (1)： 260 -264-
利用纳米孔测序鉴定u 麻蚕病害
陈大嵩，黄 鸿，吴 华，李健雄，戴建青
(广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州510260)
摘要：萬麻蚕Sams pom 为大蚕蛾科樗蚕属的绢丝与食用的非滞育型经济昆虫，且是少数可以室内大量圈养的绢
丝昆虫， 饲养(在 蚕室内大 的生 程
遭受毁灭 害的侵害， 蚕微粒子
病、
、软 等，且随着 对 的不停积累蚕 呈
发严重的趋势， 发以清除。因此，对蚕病的监测是防控蚕病爆发的重要手段之一(掌上纳米孔测序仪MuION 是一款便携式高通量测序平台，便于 实 DNA 测序并对
测。本文通过MuION 测序仪对萬麻蚕病蚕DNA ：
测序，并对未银行卡怎么查余额
DNA 序 分析，探讨了利用MuION 测序仪鉴定萬麻蚕 的 ，对蚕病的监测提供了保障(
关键词：萬麻蚕；MUION ；病原；鉴定 中图分类号：Q965； S433
文献标识码：A
文章编号：1674 -0858 (2021) 01 -0260 -05
Identifying of Samm ricini diat by nanoporr quencing
CHEN Da-Song , HUANG Hong ，LI Jian-Xiong ，DAI Jian-QU/ ( Guangdong Keg LVooPy of Animal
Coneeation and Resou ece Uti ei oation ， GuangdongPubeicLaboeatoeyoeWied AnimaeConeeation and Utilization ，Ins/tuio of Zoology , Guangdong Acxduny of ScWnca ，Guangzhou 510260，China ) Abstract : Samd SSi is a silk produced and edibio non diapau economic inct belonging tn
SWurnii /xe famip. It is ono of tho om silk production incts that cxn bo laryela m/md indoors ，which can beeeaeed in succe s ieegeneeationstheoughouttheyeae.Theeaege-scaeeindooeeeaeingpeoduction oe
S . sWmt may bo ruined by destoc/vv diswsos which includos micmspom dia ， nucW/r polyhedrosis
dia ， and soetotdia.Diaswi a becomeinceasingiouswith thecontinuousaccumuaation oe
pathogens ， and thepathogensbecomemoeedi e i cuattoeemoee.Theeeeoee ， diamonitoeingisthemost important means tn prevent tho dia outbreak. MinlON is a poeVla high -throughput quencing pWPom , which is convenient for pathogen DNA quencing. In this papor ，tho DNA of sick S - ridel was
quenced by MinlON ，and tho unknown pathogen DNA quencos wera attempted tn bo identified- Tho Ovibd/y of using MinlON tn idw/fy tho pathogen was discusd ， which provided a guaranteo far tho
monitoingoesiakwom dia.
Key woelt : Semis ridel ； MinlON ; pathogen ； LidentiLcx/on-
蒐麻蚕SodS SSi ，又叫惠利蚕、木薯蚕，
滞育经济型昆虫。原产于印度东北部的阿萨姆邦，
大蚕
Satumiidao 樗蚕属的
丝与食用的非
带樗蚕Semis eSgS 来(PFglor &
基金项目：广东省省级科技计划(2019B030316018)；广东省科学院科技发展专项(2018GDASCX -0107)
作者简介：陈大嵩，男，1986年生，博士，助理研究员，主要从事昆虫基因组、昆虫化学生态学研究，E - mV ： chenda S ong@ gmail. con^
chends@ giabr. gd- cn
*通讯作者Author Os cowespondence ：戴建青，男，博士，主要从事昆虫化学生态学研究，E - mail ： jqdai@ giabr. gd. cn
Receieed ： 2020 -10 -28；
Accepted ： 2020 -12 -14
1陈大嵩等：利用纳米孔测序鉴定萬麻蚕病害261
Calhoun,2013)。我国自1951年，由中国科学院实验生物研究所朱洗教授引进饲养崑麻蚕。崑麻蚕茧壳奶白色，可用于生产绢纺原料，为全世界仅次于家蚕与柞蚕的第三大绢丝昆虫，其蚕丝质量仅次于家蚕Bomby sori Linnaous并优于柞蚕Aetheree peryyi Gue/n-Menevild(van Beek et at-, 2000)，蚕丝可设计成优良的生物材料与细胞支撑介质(Pal ot st-,2013)，其熟蚕与蛹亦是优质昆虫食品(Longvah et st-,2011)，蚕蛹油脂可提炼优质健康的食用油(王卫飞等，2018)，卵可繁殖多种寄生蜂(莫现会等，2016)。崑麻蚕即可室内饲养亦可放养，除家蚕外，为仅有的几种可以在室内大量圈养的绢丝昆虫。崑麻蚕的寄主植物相较家蚕与柞蚕更广，一般以大戟科的崑麻与木薯做饲料大量饲养，替代寄主包括大戟科的乌柏SapSm bperom(L.)Roxb.、夹竹桃科的鸡蛋花POmeWa sbs、苦木科的臭椿Ajoga PpoPee、马桑科马桑CoOsOo oepsfoss Wall.、芸香科吴茱萸Exodio rotOoso、菊科的蒲公英Terexacym 100/010x1Hand--Maz o.和萬苣Lectoce tOe L-var.angustanalrish-等。以崑麻-崑麻蚕与木薯-崑麻蚕的形式进行栽培-养殖的联合增加了崑麻与木薯的产值，是带动崑麻与木薯种植业的重要因素之一'。
崑麻蚕生产上可能遭受侵害的毁灭性病害包括崑麻蚕微粒子病(刘士贤等，1964；谢伟东, 1989)、脓病(叶育昌，1982；李敏棠等，1985)、软化病等(吴汝章，1987)，甚至同时感染多个疾病。此外，被污染的蚕室、蚕具、蚕卵很易残留病原，且随着累代对病原物的不停积累，蚕病会呈现愈发严重的趋势并且病原物亦愈发难以清除。目前常用的分子生物学检测蚕病病原手段包括PCR、实时荧光qPCR、环介导等温扩增LAMP、巢式PCR等方法(随着高通量测序方法的发展，测序成本的不断降低，高通量检测方法被广泛应用在各种病原的检测中。在各高通量测序平台中，牛津纳米孔公司Oxford Nanoporv的掌上纳米孔测序仪MinlON是一款便携式测序仪，能够直接进行DNA和RNA测序，拥有超长的读长、实时测序、随时终止等特性，被广泛应用在检测多种病原体中(Waewick Dugdaa e.al.，2019；Wongsueawat et st-,2019)。本文通过利用MinlON测序仪对崑麻蚕病蚕组织样品的DNA进行测序，鉴定病蚕感染的病原物，以实现利用高通量测序技术对崑麻蚕疾病进行监控。
1材料与方法
1.1DNA
蚕病取自江苏省南京市蚕农的蚕室，接种于实验室内饲养的崑麻蚕1龄幼虫，接种后至2~ 3龄幼虫集体发病，幼虫脱离寄主、拒食、拉稀，死后呈现发黑、软化等症状，死后蚕体整体用于DNA提取以获得足够量的起始DNA浓度。待测蚕体首先在800孵育5mix以杀灭病原以防交叉污染，每1g蚕体组织放于
10mL CTAB裂解液(2%CTAB,100mM Tfs(pH&0),20mM EDTA, 1.4MNaCl,3%疏基乙醇)中研磨,650水浴2h o待降温至室温，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25：24：1)萃取，震荡10s后离心10mU，取上清液重复上一步再次加入等体积的酚氯仿异戊醇萃取。上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA，颠倒混匀后，离心10mU(弃上清留取DNA沉淀，加入适量70%乙醇清洗DNA，离心5mU后弃上清并用移液器吸干液体，晾干DNA后加入100pL无
菌水溶解dna o
coldplay1.2纳米孔测序文库构建
DNA液微分光光度测DNA 量，取2pg DNA溶液加入Ceva/s gDUBE打断管上部，8500OmU离心1mU将DNA溶液离心到下部，颠倒后8500Rmin离心1mU将DNA溶液重新离心到上部，DNA溶液取出1pL加入微量分光光度计测量DNA含量并保证1pg以上的DNA 用于下一步实验。利用末端修复试剂盒(NEBN/t End repair/dA-tailing Modulo,E7546)对打断的DNA进行末端修复，利用磁珠(AMPum XP beads)对DNA文库进行回收，取1pL文库加入微量分光光度计测量DNA含量并保证700ng以上的DNA用于测序。利用末端连接试剂盒(NEB BlunRTA Liga Master MW,M0367)把连接测序试剂盒(1D G8nomic DNA by aigation，SQK LSK108)中的接头连接到DNA上，并用AMPum XP磁珠回收DNA文库，取1pL文库加入微量分光光度计测量DNA含量并保证430ng以上的DNA
262环境昆虫学扌& Journal f EyviroeAec iaS Entomology 43
用于测序。DNA 测序芯片（Flow Cells R. 9. 4. 1） 放入MinlUN 测序仪 电脑，对机器与芯片进质检并保证芯片有800以上的可用 ，从
芯片p/ming poD 孔取出20 - 30 jL 缓冲液以去除
气泡，从priming port 加入800 jL 测序缓冲液 置 5 min 。打开 sampiv poD gL ，再次从 p/ming poD
入200 jL 测序缓冲液，DNA 文库与 测序试
剂盒中的测序珠（LLB ）与缓冲液（RBF ）混合,
一滴一滴加入到sampU poD gL ，关闭sampU poD
与 priming port 。
肩的组词
1.3纳米孔测序与分析
MinlUN 测序仪
48 h ，合并获得fadq 文
件，测序 数据储存在国家基因库生命大数据
可信计算平台（项目编号：CNP0001421，测序编
号：CNR0339720）。 公 酸序列数据库NCBI
载各微抱子、各 、白僵菌、柞蚕
肠球菌基因组，作 序列数据库，利用
minimap2 （ v2. 17）把测序序列比对
柠檬枸杞菊花茶数据
库中，以测测序结果。
2结果与分析
通过MinlUN 测序仪获得2 116 314条DNA 序
列约1.87G 个碱基，最长53 282 bp ，中 数563,
均值884，序列长度大 300 bp 且集中在300 -
1 500 bp 长度（图1 ）。 中，4 476条序列（占总
序列2. 1%。）被minimap2比对到病原数据库 （图2），且与比对
蚕基因组类似，序长
度与比对碱基数量的散点图集中在一片V 字区域,
有线性关系。比对长度
800 pb 的序列中
157条序列比对到家蚕微粒子Noma OomOyds 基因
组，139条序列比对到柞蚕肠球菌Enterococcus
tuyi 基因组（部分比对结果见表1 ），比对长度
300 bp 的序列分别有206和313条序列比对
家蚕微粒
柞蚕肠球菌基因组（图3 ）,
明样品组织已
染两种 。激素的分类
Q O U Q n b Q S
w m s
ft
175000150000125000
10000075000
5000025000
0500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
序列长度 Sequence length
图1 MinlON 测序序列长度分布图Fig. 1 Disdibuhon of the quence lenghs obthned
by Mini U N
s i t
J
芯皆占報确糧蚩te
0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000
序列长度 Sequence length
0 5000 10000 15000 20000 25000序列长度 Sequence length
30000图2序列比对结果散点图Fig. 2 Scatter plot of mapping result
注：A 图，序列与蒐麻蚕基因组比对结果；B l ，序列与病原数据库比对结果。Note ： A , mapping results to genome ；
B , mapping results to pathogen
databa.
1
陈大嵩等：利用纳米孔测序鉴定蒐麻蚕病害263
表1部分序列比对结果
Table 1 Sequencc mapping respltt
比对序
Queeyname 序 长度
Length 比中ID
Target ID 比中
Taege)pa)hogeny
比中序 长度
Target bas
Seq1
9174NZ_KV388085. 1Eotessccps pernyi 5115Seq29307
NZ_KV388085. 1
Eotessccps pernyi 4947
Seq3
8100NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 4890
Seq410818NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 4761Seq5
13820
NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 4378Seq612511NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 4308Seq78540
NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 4207
Seq8
6008NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 3744
Seq914511NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi 3543Seq10
19205
NZ_KV388085.1Eotessccps pernyi
3238Seq111924KB909441.1Noxa bosOyds 982Seq121496KB908947.1Noxa bosOyds 972
Seq13
1579KB909432.1Noxa bosOyds 971Seq142403KB908947.1Noxa bosbyds 970Seq15
2859
KB909441.1Noxa boobyds 970Seq161279KB909441.1Noxa boobyds 966Seq172298KB909432.1Noxa boobyds 964Seq18
布偶剧
2529
KB909441.1Noxa boobyds 964Seq191385KB908947.1Noxa boobyds 962Seq20
4922
KB909432.1
Noxa boobyds
962
注：分别挑选比对到柞蚕肠球菌和微抱子且长度最长的10条序列（Nwe ： Each 10 lo6gest que6ces mappi6g to E. pepyi vd
Q . Combycis were shown.
17500
畧 12500U Q
=loooo
750050002500
朱自清的简介悝坐眾ft
20000
Noma bombycis
Enterococcus p emyi
图3比对到病原基因组且比对长度超过300 bp 的
序列长度分布小提琴图
Fig. 3 VW1U plot of the quence le6gth mapped to patholo/
元旦晚会主持词开场白ge6omes with more than 300 pb mapping length
注：小提琴图宽度代表序列的数量(Note ： Widths of
vio/n plot reprent the quence amount.
3结论与讨论
昆虫组织具有高蛋白质、
的特性，并
且在 染后，坏组织的DNA
,
然 通量测序对DNA 提取的质量有 的要求
并且起始建库的DNA
数量，因此昆虫
DNA 的提取质 定了最终测序结果的优劣。本
研究采用提
液与 萃 数的方式提高
DNA 的提取纯度与数量，为昆虫构建高通量测序
文库提供 （
分
测序 具有高通量、超长读长、可以直
测碱基甲基
饰、无需PCR •积小便于携带等
， 用于动植物
微生物基因组测序、宏基因组测序、RNA 直接
测序、微生
测、DNA 与RNA 甲基 测、
mRNA 的polyA 长度定量等研究（曹影等，2020o
然而，单分 测序的结果具有 的错误
264环境昆虫学扌&Journal f iaS Entomology43
率，是阻碍其应用的关键。目前MinlUN测序仪的单碱基准确率约85%，修正后的一致性序列的准确率可达97%-99%，因此对单分子纳米孔测序的分析具有一定的挑战。在DNA文库构建时，本研究通过DNA低速离心打断管以获取更长的DNA 片段以构建测序文库，有利于增加序列比对的长度以增加可信度。值得注意的是，minimap2的比对长度并未与序列长度成线性关系，可能与minimap2的算法有关，因此本研究选取的置信区间为最低300bp的比对长度，即比对长度超过300bp为可信比对结果。同时，比对数据库中病原物基因组序列的丰富度与病原物种类的选择，会对鉴定结果起关键作用并影响最终鉴定结果(因此，在选择病原物种核酸序列时，应尽可能涵盖所有蚕病病原的基因组序列，降低比对错误与假阳性。本实验选择真菌性病害病原、细菌性病害、微粒子基因组以及所有杆状病毒基因
组序列，尽可能构建全面的病原序列数据库以降低鉴定的误差，并且通过过滤序列本身长度短且比对长度较短的序列，以增加比对结果可靠性。
本研究通MinION测序仪对蚕蚕基因组进行测序，与病原基因组序列库进行比对，无需PCR扩增步骤，降低了假阳性。利用MinlON等高通量测序手段对病蚕、蚕具或蚕室进行检测不仅可以一次性准确的鉴定蚕病，也摒弃了PCR方法可能具备的假阳性现象，而且其不需要模板设计引物，甚至可以鉴定新病原等的特性，可以与PCR鉴定方法形成互补，对蚕病的全面监测提供保障。
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