网络出版时间：２０２１－５－２８１０：５３ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０５２７．１４５８．０１８．ｈｔｍｌ
芍药苷 ６′ Ｏ苯磺酸酯调节ＧＲＫ２对ＣＩＡ大鼠巨噬细胞ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的影响
斯 梦，张春梅，姜 玲，魏 伟
（安徽医科大学临床药理研究所、抗炎免疫药物教育部重点实验室、抗炎免疫药物安徽协同创新中心，安徽合肥 ２３００３２）收稿日期：２０２１－０２－２１，修回日期：２０２１－０３－１６基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ８１６７３４４４，８１９７３３３２）
人参果
作者简介：斯 梦（１９９５－），女，硕士生，研究方向：抗炎免疫药理
学，Ｅ ｍａｉｌ：４９４１２７５４５＠ｑｑ．ｃｏｍ；
魏 伟（
１９６０－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：抗炎免疫药理学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｗｅｉ＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；姜 玲（
１９６３－），女，硕士，主任药师，硕士生导师，研究方向：临床药理学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ａｈｓｌｙｙｊｌ＠１２６．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０６．００９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０６－０７８１－１０中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ２８５ ５；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３４５ ５７；Ｒ３９２ １２；Ｒ６８４ ３；Ｒ９７７ ３
摘要：目的 明确芍药苷 ６′ Ｏ苯磺酸酯（代号ＣＰ ２５）调节Ｇ蛋白偶联受体激酶２（Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅ２，ＧＲＫ２）发挥对胶原性关节炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）大鼠巨噬细胞ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的抑制作用。方法 ＳＤ雄性大鼠随机分为４组：正常组、模型组、ＣＰ ２５（５０ｍｇ·
ｋｇ－１·ｄ－１）组、ＭＴＸ（０ ５ｍｇ·ｋｇ－１·３ｄ－１
）组。在造模后连
续２１ｄ灌胃给药。观察检测大鼠整体指标，检测大鼠腹腔巨噬细胞培养上清和外周血血清中ＩＬ ６、ＰＧＥ２的水平、ＣＤ８６／ＣＤ２０６的比值、ＧＲＫ２的胞膜表达及ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共
定位、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３蛋白表达及ｐ ＳＴＡＴ３入核情况。提取正常大鼠腹腔巨噬细胞，体外ＩＬ ６、ＰＧＥ２刺激２４ｈ后，分别检测上述指标。结果 ＣＰ ２５可明显改善大鼠关节肿胀和全身炎症情况，降低大鼠腹腔巨噬细胞培养上清和外周血中ＩＬ ６和ＰＧＥ２的水平，ＣＰ ２５明显降低巨噬细胞ＣＤ８６／ＣＤ２０６、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３蛋白表达及ＧＲＫ２胞膜表达、ｐ ＳＴＡＴ３入核，增加ＧＲＫ２与ＪＡＫ１的共定位结合率。结论 ＣＰ ２５对ＣＩＡ大鼠发挥治疗作用，其重要作用机制之一是通过调节ＧＲＫ２活性，进而抑制ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路。
关键词：胶原性关节炎；巨噬细胞；ＧＲＫ２；ＪＡＫ１；ＳＴＡＴ３；ＣＰ ２５
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一种全身性、破坏性自身免疫性疾病，以全身免疫功能异常紊乱为特征，局部表现为多关节炎症，大量免疫细
胞浸润，滑膜增生，血管翳生成，会对肌腱、软骨和骨
骼造成不可逆的损害［
１］
。
增生的滑膜组织中存在大量浸润的巨噬细胞，这些巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用可以促进多种促炎细胞因子的分泌，特别是前列腺素Ｅ
２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２，ＰＧＥ２）和白细胞介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ ６）等，巨噬细胞分泌的细胞
因子在关节炎的发病过程中扮演重要角色［２］
。根
更年期吃什么好
据表型和分泌的因子，目前巨噬细胞被分为Ｍ１型和Ｍ２型巨噬细胞，正常生理情况下Ｍ１型与Ｍ２型处于动态平衡中。Ｍ１型巨噬细胞通常被视为是促炎型巨噬细胞，产生各种促炎细胞因子和趋化因子，
Ｍ２巨噬细胞则被视为是抗炎型巨噬细胞［３］。
ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的激活可以促进巨噬细胞分
泌ＰＧＥ２、ＩＬ ６等炎性因子［４］在许多免疫介导疾病
的发病机制中发挥了关键作用，而ＩＬ ６也可以激活ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路。Ｇ蛋白偶联受体激酶２（Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅ２，ＧＲＫ２）是一种重要的炎症免疫反应的调节蛋白，ＧＲＫ２的表达和活性的失衡在ＲＡ的发生发展中起着重要作用，课题组以往研究表明，
ＰＧＥ２不断刺激下，腹腔巨噬细胞中ＥＰ４受体过度脱敏，ＧＲＫ２发生膜转位，与ＥＰ４受体共表达增加，ｃＡＭＰ和ｐ ＣＲＥＢ表达减少，ＰＧＥ２ ＥＰ４ ｃＡＭＰ ＣＲＥＢ信号通路的异常介导ＣＩＡ小鼠巨噬细胞向Ｍ１型极化，导致炎性细胞因子的产生，增
强炎性细胞浸润和破坏软骨和骨骼［５］。芍药苷
（
ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ，Ｐａｅ）已普遍用于治疗自身免疫性疾病，但由于Ｐａｅ的渗透性较差，需要较长时间才能发挥作用，为了改善这一特性，将Ｐａｅ酯化后，得到了具有较好的脂溶性和生物利用度的化学结构修饰产物ＣＰ ２５，ＣＰ ２５在佐剂性关节炎（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＡＡ）和胶原性关节炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄａｒ ｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）大鼠和小鼠的体内直接发挥改善炎症的作用，已证实其主要是通过抑制ＣＲＫ２转膜，进而影
响多种信号通路［６－８］，课题组研究已发现ＣＰ ２５可
降低人外周血单核细胞ｐ
ＪＡＫ１、ｐ ＳＴＡＴ３的蛋白表达［９］。然而，在巨噬细胞中ＧＲＫ２与ＪＡＫ１ ＳＴＡＴ３
信号的关系及ＣＰ ２５的调控作用尚不清楚。本研究
·１
８７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）：７８１－９０
旨在探讨在实验性关节炎中，ＩＬ ６、ＰＧＥ２影响下的巨噬细胞ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３与ＧＲＫ２之间是否存在联系，ＣＰ ２５是否通过调节ＧＲＫ２进而发挥抑制巨噬细胞ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３的作用。
１ 材料与方法
中国童话１．１ 材料
１．１．１ 动物 ＳＰＦ级ＳＤ雄性大鼠３４只，６周龄，（１８０－２００）ｇ，购自北京维通利华有限责任公司。饲养于安徽医科大学临床药理研究所ＳＰＦ动物实验室，给予动物自由饮水与摄食，饲养环境温度（２０－２５）℃，湿度４０％－７０％，光照１２ｈ。
１．１．２ 试剂 Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ ＣＩＡＩＩ型胶原（２００１１，美国ｃｈｏｎｄｒｅｘ公司）；完全弗氏佐剂（Ｆ５８８１，美国Ｓｉｇ ｍａ公司）；ＤＭＥＭ培养液（１２１０００４６，美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司）；胎牛血清（１６０００ ０４４，以色列Ｂｉｏｌｎｄ公司）；ＣＰ ２５（安徽医科大学临床药理研究所）；托法替布（ＨＹ４０３５４Ａ，美国ＭＣＥ公司）；ＰＧＥ２、ＩＬ ６（３６３２４６４、５００ Ｐ７３，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ生物公司）；鼠抗ＧＲＫ２抗体、ＰＥ标记的ａｎｔｉ ｒａｔＣＤ２０６抗体（ｓｃ １３１４３、ｓｃ ３７６１０８，美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司）；兔抗ＪＡＫ１（ａｂ１３３６６６，英国Ａｂｃａｍ公司）；ｐ ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ３（ＡＦ２０１２、ＡＦ６２９４，美国Ａｆｆｉｎｉｔｙ公司）、ｐ ＳＴＡＴ３抗体（９１４５，美国ＣＳＴ公司）；ＡＰＣ标记的ａｎｔｉ ｒａｔＣＤ６８抗体、ＦＩＴＣ标记的ａｎｔｉ ｒａｔＣＤ８６抗体（１３０ １０３ ３６４、１３０ １０９ １２９，德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）；大鼠ＰＧＥ２、ＩＬ ６ＥＬＩＳＡ试剂盒（ｍｌ００３０３６、ｍｌ０６４２９２，上海酶联生物科技有限公司）。
１．１．３ 仪器 ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯ多功能酶标仪（ＴＥＣＡＮ公司）；Ｉｍａ
ｇｅＱｕａｎｔ荧光及化学荧光及化学发光成像系统（ＧＥ公司）；ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８激光共聚焦显微镜（Ｌｅｉｃａ公司）；ＢｅｃｋｍａｎＣｙｔｏＦＬＥＸ流式细胞仪（Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸＭａｒｋⅡ成像流式细胞仪（ＭｅｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 大鼠ＣＩＡ模型的建立及给药分组 ＳＤ雄性大鼠适应性饲养１周后，随机分为正常组，其余大鼠于尾根部及右后跖底部分别皮内注射０ １ｍＬ完全弗氏佐剂与鸡Ⅱ型胶原等体积混合、乳化制成的Ⅱ型胶原乳剂，７ｄ后于尾根部加强注射１次，ｄ１７根据大鼠继发侧足爪肿胀情况选出１８只为造模成功的ＣＩＡ大鼠，随机将ＣＩＡ大鼠分为模型组、ＣＰ ２５（５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）组、ＭＴＸ（０ ５ｍｇ·ｋｇ－１·３ｄ－１）组。每组６只，于ｄ１８开始灌胃给药。给药共２１ｄ，结束后处死大鼠。
１．２．２ 大鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养 处死大鼠后，向腹腔中注入１５ｍＬ生理盐水，按摩腹部之后静置３ｍｉｎ，使腹腔巨噬细胞富集，抽出细胞悬液，离心２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ，之后加入１０％高糖ＤＭＥＭ培养基重悬至６孔板，贴壁３ｈ后，弃去上清，用无菌的ＰＢＳ洗涤３遍，贴壁的为纯化后的巨噬细胞，加入１０％高糖ＤＭＥＭ培养基继续培养。１．２．３ 大
鼠整体指标、胸腺、脾脏指数测定 每３ｄ评估与记录大鼠体质量、关节炎指数、足爪肿胀度。关节炎指数按５级评分法评价，０级：无红肿；１级：趾关节红肿；２级：趾关节和足趾肿胀；３级：踝关节以下的足爪肿胀；４级：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。累积四肢的评分，其最大值为１６。足爪肿胀度使用足爪肿胀仪每３ｄ测定３次大鼠继发侧后肢踝关节以下容积，以致炎前后容积差的平均值为肿胀度。称量每只大鼠的体质量，处死大鼠后，取出并称重大鼠的脾脏和胸腺，计算脾脏指数（脾脏重量／体质量）和胸腺指数（胸腺重量／体质量）。１．２．４ ＥＬＩＳＡ法检测大鼠外周血血清和腹腔巨噬细胞培养上清中ＩＬ ６和ＰＧＥ２的含量 收集各组大鼠外周血血清和腹腔巨噬细胞培养上清，采用大鼠ＩＬ ６、ＰＧＥ２ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＩＬ ６、ＰＧＥ２水平。１．２．５ 流式细胞术检测大鼠腹腔巨噬细胞的极化情况 取出各组大鼠原代腹腔巨噬细胞均匀铺于６孔板中，４ｈ后移去培养液（体外实验中取出正常雄性大鼠腹腔巨噬细胞均匀铺于６孔板，４ｈ后换液，加入ＩＬ ６、ＰＧＥ２刺激剂培养２４ｈ），加入预冷的ＰＢＳ，静置１５ｍｉｎ后，轻轻吹打，收集细胞于ＥＰ管中。２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ离心，去除上清液，加入８０μＬ的细胞固定液，避光孵育１０ｍｉｎ。加入６００μＬＰＢＳ后２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ离心，弃去上清。加入８０μＬ的细胞破膜液，避光孵育１０ｍｉｎ。除了空白对照组，其余每个ＥＰ管中加入ＣＤ６８、ＣＤ８６和ＣＤ２０６抗体，室温孵育１ｈ，加入６００μＬＰＢＳ离心２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ，去上清，加入１５０μＬ的ＰＢＳ重悬，过滤网后上机检测。
１．２．６ 成像流式细胞仪检测大鼠腹腔巨噬细胞中ｐ ＳＴＡＴ３的入核情况 同上述１ ２ ５步骤处理细胞后，加入ｐ ＳＴＡＴ３抗体室温孵育１ｈ，加入６００μＬＰＢＳ离心２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ，去上清，加入８０μＬＤＡＰＩ染核５ｍｉｎ，随后加入６００μＬＰＢＳ离心２５００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ，去上清，加入１５０μＬ的ＰＢＳ重悬，过滤网后上机检测。
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１．２．７ 激光共聚焦检测大鼠腹腔巨噬细胞中ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共定位及ＧＲＫ２膜转位情况 取出大鼠腹腔巨噬细胞后均匀铺在２４孔板中，板中放有
·
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）
无菌细胞爬片，培养４ｈ后，固定封闭处理细胞，孵育ＪＡＫ１、ＧＲＫ２抗体４℃过夜，ＰＢＳ洗
３ｍｉｎ×３次，吸干ＰＢＳ，加入荧光二抗，３７℃避光孵育１ｈ，ＰＢＳ洗３ｍｉｎ×３次，加入少量ＤＡＰＩ染核５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３ｍｉｎ×３次，挑片，滴上防荧光淬灭剂，将玻片正面倒置放在载玻片上，用指甲油固定住，随后使用激光共聚焦荧光显微镜拍摄。
１．２．８ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测大鼠腹腔巨噬细胞中ＪＡＫ１、ｐ ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ３、ｐ ＳＴＡＴ３的表达和ＧＲＫ２的膜表达 分离培养大鼠腹腔巨噬细胞２４ｈ后，收集细胞，提取蛋白。配制１０％的ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶，上样，电泳，转膜，封闭，孵育ＪＡＫ１、ｐ ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ３、ｐ ＳＴＡＴ３、ＧＲＫ２抗体４℃过夜，洗去一抗，孵育二抗３７℃２ｈ，洗去二抗，随后采用化学发光成像系统成像。
成长英语１．２．９ 统计学分析 采用ＳＰＳＳ２３ ０软件分析处理数据，符合正态分布的计量资料采用珋ｘ±ｓ表示，采用单因素方差分析（Ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ）。
２ 结果２．１ ＣＰ ２５对ＣＩＡ大鼠全身情况的影响 课题组前期研究表明，ＣＰ ２５对小鼠ＣＩＡ和大鼠ＡＡ治疗作用有明显量效关系［１０－１１］，且在５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１疗效明显，因此，在本研究中我们给予ＣＩＡ大鼠ＣＰ ２５（５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）连续２１ｄ进行整体效果观察实验。与正常组相比，模型组大鼠体重明显降低（Ｐ＜０ ０５），与模型组相比，ＣＰ ２５与ＭＴＸ给药组大鼠体重明显升高（Ｐ＜０ ０５）（Ｆｉｇ１Ａ）。造模后大鼠关节炎指数逐步
上升，于ｄ２７达到高峰；与模型组相比，从ｄ３０开始，ＣＰ ２５、ＭＴＸ组大鼠关节炎指数明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ１Ｂ）。造模后，除正常组外，各组大鼠足爪肿胀度逐步上升，于ｄ２７达到高峰；与正常组相比，模型组大鼠足爪肿胀度明显升高（Ｐ＜０ ０１）；与模型组相比，ＣＰ ２５、ＭＴＸ组大鼠足爪肿胀度降低（Ｐ＜０ ０５）（Ｆｉｇ１Ｃ）；与正常组相比，模型组大鼠胸腺、脾脏明显肿大，指数升高（Ｐ＜０ ０５），与模型组相比，ＣＰ ２５、ＭＴＸ组胸腺、脾脏指数降低（Ｐ＜０ ０５）（Ｆｉｇ１Ｄ）。上述结果进一步提示，ＣＰ ２５对ＣＩＡ
大鼠有明显治疗效果。
２．２ ＣＰ ２５对ＣＩＡ大鼠外周血血清和腹腔巨噬细胞上清中ＩＬ ６和ＰＧＥ２含量的影响 与正常组相比，模型组大鼠外周血血清和腹腔巨噬细胞上清中ＩＬ ６、ＰＧＥ２含量明显升高（Ｐ＜０ ０１）。与模型组相比，ＣＰ ２５组明显降低腹腔巨噬细胞上清中ＩＬ ６、ＰＧＥ２含量及外周血血清中ＰＧＥ２含量（Ｐ＜０ ０５）。ＭＴＸ组明显降低外周血血清和腹腔巨噬细胞上清中ＩＬ ６、ＰＧＥ２含量（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ２）
。
Ｆｉｇ２ ＬｅｖｅｌｓｏｆＩＬ ６ａｎｄＰＧＥ２ｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＥＬＩＳＡｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍａｎｄｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：ＬｅｖｅｌｓｏｆＩＬ ６ｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＥＬＩＳＡｉｎｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｎｄｐｅ ｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍ；Ｂ：ＬｅｖｅｌｓｏｆＰＧＥ２ｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＥＬＩＳＡｉｎｃｅｌｌｓｕ ｐｅｒｎａｔａｎｔａｎｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＮｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
２．３ ＣＰ ２５影响ＣＩＡ大鼠腹腔巨噬细胞的极化情况 炎症情况下，巨噬细胞向Ｍ１型极化，为了验证ＣＰ ２５是否通过减少Ｍ１型巨噬细胞，进而缓解炎症，因此采用流式细胞术检测ＣＤ８６／ＣＤ２０６来反映巨噬细胞极化情况。与正常组相比，模型组大鼠腹腔巨噬细胞中ＣＤ８６／ＣＤ２０６明显增多（Ｐ＜０ ０５），与模型组相比，ＣＰ ２５、ＭＴＸ组ＣＤ８６／ＣＤ２０６明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ３），提示ＣＰ ２５、ＭＴＸ可使模型组巨噬细胞向Ｍ２型极化。
２．４ ＣＰ ２５对ＣＩＡ鼠腹腔巨噬细胞中ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路及ＧＲＫ２表达的影响 进一步探讨影响巨噬细胞功能异常的相关机制，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测大鼠腹腔巨噬细胞中ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路上蛋白的变化。与正常组相比，模型组大鼠腹腔巨噬细胞ｐ ＪＡＫ１、ｐ ＳＴＡＴ３表达明显升高（Ｐ＜０ ０５），与模型组相比，ＣＰ ２５组ｐ ＪＡＫ１、ｐ ＳＴＡＴ３表达明显降低（Ｐ＜０ ０５）（Ｆｉｇ４Ａ）。通过激光共聚焦显微镜观察了ＧＲＫ２在腹腔巨噬细胞的表达及ＧＲＫ２与ＪＡＫ１之间共定位情况。与正常组相比，模型组大鼠腹腔巨噬细胞ＧＲＫ２发生明显膜转位。与模型组相比，ＣＰ ２５组ＧＲＫ２膜转位情况减少（Ｆｉｇ４Ｂ）。与正常组相比，模型组大鼠腹腔巨噬细胞中ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共定位结合率明显升高（Ｐ＜０ ０１）、ＧＲＫ２明显向胞膜转移。与模型组相比，ＣＰ ２５组ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共定位结合率明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ５）。通过成像流式细胞术检测大鼠腹腔巨噬细胞中ｐ ＳＴＡＴ３入核情况，与正常组相比，模型组大鼠腹腔巨噬细胞中ｐ ＳＴＡＴ３入核率明显升高（Ｐ＜０ ０１），
与模型组相比，ＣＰ ２５组ｐ ＳＴＡＴ３入核率明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ６）。提示ＧＲＫ２发生膜转位，降低对ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的抑制作用，ＣＰ ２５减少了ＧＲＫ２膜转位，恢复ＧＲＫ２对ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的抑制作用。
２．５ ＣＰ ２５在体外对大鼠腹腔巨噬细胞极化情况的影响 基于上述整体实验结果，发现炎症情况下，ＩＬ ６、ＰＧＥ２明显升高，ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路被激活，ＧＲＫ２发生膜转位，因此将ＩＬ ６（１００μｇ·Ｌ－１）、ＰＧＥ２（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）刺激腹腔巨噬细胞２４ｈ，采用ＣＰ ２５（１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１、１μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和ＪＡＫ抑制剂托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）为给药组，给药２４ｈ，进行体外实验。流式细胞术检测ＣＤ８６／ＣＤ２０６的比例，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组ＣＤ８６／ＣＤ２０６明显升高（Ｐ＜０ ０１）。与ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组相比，ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）组ＣＤ８６／ＣＤ２０６明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ７），提示ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）可使ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后的巨噬细胞向Ｍ２型极化。
２．６ ＣＰ ２５在体外对大鼠腹腔巨噬细胞中ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路及ＧＲＫ２表达的影响 激光共聚
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）
Ｆｉｇ３ ＴｈｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎＣＩＡｍｏｄｅｌｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
马耳他英文＃
Ｐ＜０ ０５ｖｓＮｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
焦结果显示，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组大鼠腹腔巨噬细胞中ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共定位结合率明显降低（Ｐ＜０ ０１）。与ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组相比，ＣＰ ２５（１０
μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１
）组ＧＲＫ２与ＪＡＫ１共定位结合率明显升高（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ
８
）。提示ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后，巨噬细胞中ＧＲＫ２发生膜转位，与ＪＡＫ１之间相互作用减少。
ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１
）
可抑制ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后的巨噬细胞中ＧＲＫ２发生膜转位，增加与ＪＡＫ１之间的相互作用。Ｗｅｓｔ ｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组ｐ ＪＡＫ１、ｐ ＳＴＡＴ３的表达明显升高（Ｐ＜０ ０１），ＧＲＫ２的膜表达明显升高（Ｐ＜０ ０１），胞质表达明显降低（Ｐ＜０ ０５），与ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组相比，ＣＰ ２５（１０
μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）组ｐ ＪＡＫ１、ｐ ＳＴＡＴ３表达明显降低（Ｐ＜０ ０１），而ＧＲＫ２的膜
表达明显降低（Ｐ＜０ ０１），胞质表达明显升高（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ９）。提示ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后，能明显增加ＧＲＫ２发生膜转位，降低ＧＲＫ２对ＪＡＫ１／
ＳＴＡＴ３信号通路的抑制作用，而激活巨噬细胞上的
ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路。ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１
）可
显著抑制ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后的巨噬细胞中ＧＲＫ２的膜转位。成像流式细胞术结果，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组大鼠腹腔巨噬细胞中ｐ ＳＴＡＴ３入核率明显升高（
Ｐ＜０ ０１）。与ＩＬ ６＋ＰＧＥ２组相比，ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和托法替布（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）组ｐ ＳＴＡＴ３入核率明显降低（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ
电脑的坏处１０）。由上述结果可知，ＩＬ ６联合ＰＧＥ２刺激后，能明显增加Ｇ
ＲＫ２发生膜转位，降低ＧＲＫ２对ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路的抑制作用，激活了巨噬细胞上的
ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３信号通路。而ＣＰ ２５（１０μｍｏｌ·Ｌ－１
）
通过减少ＧＲＫ２膜转位，发挥对ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ３的抑制作用。３ 讨论
目前，已有多项研究表明，ＣＰ ２５具有免疫调节和抗炎作用，可明显改善ＡＡ和ＣＩＡ大小鼠炎症情况，缓解足爪关节肿胀、滑膜增生、骨侵蚀等，已证实其主要是通过抑制ＣＲＫ２转膜，进而影响多种信号
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５８７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｎ；３７（６）
