网络出版时间：２０２１－２－２６１１：４０ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０２１０２２５．１５３３．０２０．ｈｔｍｌ
白藜芦醇抑制人肝微粒体代谢色氨酸的研究
吴栋丽１，２，３，汪 静２，３，陈 爽２，３，钟诗龙１
，２，３
（１．南方医科大学药学院，广东广州 ５１０５１５；２．广东省人民医院药学部，广东广州 ５１００８０；３．广东省人民医院
广东省医学科学院，广东省心血管病研究所，广东省冠心病防治研究重点实验室；广东广州５
１００８０）收稿日期：２０２０－１０－１７，修回日期：２０２０－１２－２４
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１８７２９３４，８１６７３５１４）；广
东省重点领域研发计划（Ｎｏ２０１９Ｂ０２０２２９００３）
作者简介：吴栋丽（１９９６－），女，硕士生，研究方向：临床药理，心血
管疾病代谢，
Ｅ ｍａｉｌ：ｗｕｄｌｉ７＠１６３．ｃｏｍ；钟诗龙（１９７３－），男，博士，教授，研究员，博士生导师，研究方向：临床药理、表观遗传药理学、药物代谢研究，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｄｐｈ＿ｚｈｏｎｇｓｌ＠ｇｄ．ｇｏｖ．ｃｎ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０３．０１０
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０３－０３４９－０７中国图书分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ３２２．４７；Ｒ３４１．７；Ｒ９７７．４；Ｒ９７７．３摘要：目的 研究白藜芦醇对人肝微粒体代谢色氨酸生成犬尿氨酸的影响。方法 分别考察孵育时间、
色氨酸浓度、微粒体蛋白浓度，建立体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系；采用高效液相色谱－串联质谱法（ＬＣ ＭＳ／ＭＳ）检测肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸浓度。基于体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系探讨白藜芦醇对色氨酸代谢影响。结果 色氨酸在体外人肝微粒体中最佳孵育时间为９０ｍｉｎ，
色氨酸浓度为８ｍｇ·Ｌ－１，微粒体蛋白浓度为１ｇ·Ｌ－１
；酶反应速率常数Ｋｍ为（９５ ９１±２２ ２９）μｍｏｌ·Ｌ－１，最大反应速率Ｖｍａｘ
为（２１ ３４±２ ５８）μｍｏＬ·ｇ－１·ｍｉｎ－１
。与已知的吲哚胺２，３ 双加氧酶（ＩＤＯ）抑制剂Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ相比，结果显示白藜芦醇也能够抑制人肝微粒体中色氨酸代谢生成犬尿氨酸且具有浓度依赖性。结论 白藜芦醇具有抑制ＩＤＯ活性的作用，表明ＩＤＯ可能是白藜芦醇发挥药理作用的一个潜在靶点，为进一步研究白藜芦醇的药理作用及色氨酸代谢提供重要依据。
关键词：色氨酸；犬尿氨酸；白藜芦醇；肝微粒体；吲哚胺２，３ 双加氧酶；高效液相色谱－串联质谱法
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
白藜芦醇是天然多酚类植物抗毒素，在虎杖、葡萄、花生、桑葚等植物中广泛分布。白藜芦醇以其抗氧化的特性而广为人知，例如清除多种活性氧（ｒｅ ａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）、自由基、活性氮，增强过氧化氢酶等抗氧化防御酶的表达，在维持细胞氧化
还原平衡中具有重要意义［
１－２］
。此外，白藜芦醇还具有抗肿瘤、抗炎、增强内皮细胞一氧化氮合成、抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集等多种生理活
性［３－４］
。
色氨酸（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ＴＲＰ）是人体必需氨基酸，机体主要有３条代谢途径，分别是５ 羟色胺途径，犬
尿氨酸途径及经肠道菌群代谢的吲哚途径［５］。约
９５％的色氨酸经过犬尿氨酸途径代谢，主要代谢产物有犬尿氨酸（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，ＫＹＮ）、犬尿喹啉酸（
ｋｙｎｕｒｅｎｉｃａｃｉｄ，ＫＹＮＡ）、３ 羟基邻氨基苯甲酸（３ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ，３ ＨＡＡ）；该途径可以调控机体循环系统中的色氨酸水平。吲哚胺２，３ 双加氧酶（ｉｎ ｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＩＤＯ）是犬尿氨酸途径的关键酶。犬尿氨酸途径代谢失衡与心血管疾病、免
疫抑制、神经系统活动等紧密相关［６－７］。血浆中的
犬尿氨酸被认为是为慢性心力衰竭的生物标志
物［８］。ＫＹＮ／ＴＲＰ比值水平反映ＩＤＯ的活性。
ＫＹＮ／ＴＲＰ比值是冠状动脉疾病患者发生主要不良
冠状动脉事件和全因死亡的预测因子［７］。犬尿氨
酸途径也是先天性和适应性免疫的关键调节因子，其下游代谢物如犬尿氨酸、３ 羟基犬尿氨酸（３ ｈｙｄｒｏｘｙｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，３ ＨＫ）、喹啉酸（ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ，ＱＡ）和吡啶甲酸（ｐｉｃｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ，ＰＡ）都被证实具有
免疫抑制作用［９］。ＫＹＮＡ和ＱＡ被认为是Ｎ 甲基天
冬氨酸受体的拮抗剂和激动剂，二者之间的平衡决定了神经元的兴奋性状态；常与精神分裂症和抑郁
有关［１０］。
白藜芦醇可以上调黑色素瘤细胞中间隙连接蛋白 ４３（ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３，Ｃｘ４３）的表达，并且能抑制ＩＤＯ初中数学竞赛
蛋白的表达［１１］。此外，白藜芦醇能够抑制干扰素 γ
（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ，ＩＦＮ γ）诱导的骨髓树突状细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ＢＭＤＣｓ）中ＩＤＯ的表
达和活性［１２］。由此可见，白藜芦醇发挥抗肿瘤作用
可能与抑制ＩＤＯ有关。而目前暂无白藜芦醇是否影响犬尿氨酸途径代谢相关研究的报道，关于肝微粒体代谢色氨酸的研究也很少。因此，本研究基于体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系，探讨白藜芦
·９
４３·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）：３４９－５５
醇对犬尿氨酸途径代谢的影响；为进一步研究白藜芦醇的药理作用机制及色氨酸代谢提供理论依据。１ 材料与方法
１．１ 仪器 ＬＣ ２０Ａ高效液相色谱仪（Ｓｈｉｍａｄｚｕ），配有电喷雾电离（
ＥＳＩ）源的ＡＰＩ４０００ＱＴｒａｐ三重四极杆质谱仪（ＡＢＳｃｉｅｘ）；Ｍｉｌｌｉ Ｑ纯化系统（ＥＭＤＭｉｌ ｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）；ＤＳＨＺ ３００Ａ水浴锅（江苏太仓市实验设备厂）；ＴｏｌｅｄｏＸＡ２０５分析天平（梅特勒公司）；ＡｌｌｅｇｒａＸ ３０Ｒ台式高速冷冻离心机（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｔ ｌｅｒ
）；Ｖｏｒｔｅｘ ５涡旋振荡器（其林贝尔Ｋｙｌｉｎ ｂｅｌｌ）。１．２ 药物与试剂 色氨酸（ＴＲＰ，９９％，Ｊ＆ＫＳｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ，批号：ＬＡＢ０Ｒ０８）；犬尿氨酸（ＫＹＮ，＞９８％，阿拉丁，批号：Ｃ１９０７１４８）；色氨酸 ｄ５和犬尿氨酸 ｄ４（ＴＲＰ ｄ５，９８％；ＫＹＮ ｄ４，９８％；ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ，批号分别为：２ ＬＸＭ １８７ １；４ ＭＯＺ １６１ ３）；Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ（Ｅｐａ，９８％，萨恩化学技术上海有限公司（安耐吉化学），批号：ＧＡ２５０２６９）；活性炭（１００目粒度，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，批号：ＭＫＢＱ５０５７Ｖ）；白藜芦醇（Ｒｅｓ，＞９９％，梯希爱上海化成工业发展有限公司，批号：ＺＦＢＣＣ ＲＡ）；ＨＰＬＣ级乙腈和甲醇（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，批号分别为：ＪＡ０６７６３０；ＷＸＢＣ９５７７Ｖ）；ＨＰＬＣ级甲酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，批号：７７Ｙ１２１１ＲＳ）；混合人肝微粒体（ＨＬＭ，蛋白质量浓度
为２
０ｇ·Ｌ－１，瑞德肝脏疾病研究上海有限公司，批号：ＶＩＮ）；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ，９５％，上海易恩化学技术有限公司，批号：ＲＨ１０８１６７）；磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化镁（Ｋ２ＨＰＯ４，９９％；ＫＨ２ＰＯ４，９９ ５％；ＭｇＣＩ２，９９％；上海麦克林生化科技有限公司，批号分别为：Ｃ１００８４２２３，Ｃ１００９１９７１，Ｍ２１９１８０２４）；黄素腺嘌呤二核甘酸（ＦＡＤ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，批号：ＳＬＢＳ５１５８）。１．３ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析方法 应用ＡＢＳｃｉｅｘＡＰＩ４０００ＱＴｒａｐ三重四极杆质谱仪，电喷雾电离（ＥＳＩ），正离子源，在多反应检测（ＭＲＭ）模式下扫描。基本的质谱参数：电喷雾电压（ＩＳ）为５５００Ｖ；气帘气压力（ＣＵＲ）２５ｐｓｉ；雾化气压力（ＧＳ１）５０ｐｓｉ；辅助气压力（ＧＳ２）５０ｐｓｉ；离子源温度（ＴＥＭ）５５０℃。ＭＲＭ模式监测反应质荷比（ｍ／ｚ）：２０５ １→１４６ １（ＴＲＰ），２１０ ３→１９２ ２（ＴＲＰ ｄ５），２０９ １→９４ １（ＫＹＮ），１８１ ３→１６４ ０（ＫＹＮ ｄ４），具体质谱参数如Ｔａｂ１所示。
岛津ＬＣ ２０Ａ高效液相色谱仪，色谱柱：ＸＳｅｌｅｃｔＨＳＳＴ３３ ５μ
ｍ（２ １ｍｍ×１００ｍｍ）；流速：０ ３ｍＬ·ｍｉｎ－１
；进样量：３μＬ；柱温：３０℃；分析时间共５
ｍｉｎ；流动相：０ ０１％甲酸水（Ａ）－乙腈（Ｂ），采用梯
度洗脱方式：
０－０ １ｍｉｎ５％Ｂ，０ １－０ ５ｍｉｎ５％－６０％Ｂ，０ ５－２ ８ｍｉｎ６０％Ｂ，２ ８－２ ９ｍｉｎ６０％－５％Ｂ，２ ９－５ ０ｍｉｎ５％Ｂ。
Ｔａｂ１ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｏｎｐａｉｒ，ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
ａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ
ＡｎａｌｙｔｅｓＲＴ（ｍｉｎ）
Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎ（ｍ／ｚ）
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍ／ｚ）
ＤＰ
（Ｖ）ＥＰ
（Ｖ）ＣＥ
flash课件（ｅＶ）ＣＸＰ
（Ｖ）
ＴＲＰ１．１０２０５．１１４６．１６４．６３．５２５．７１０．３ＫＹＮ１．０９２０９．１９４．１６５．７１０．０２０．３５．０ＴＲＰ ｄ５１．０７２１０．３１９２．２４８．０１０．０３６．０５．０ＫＹＮ ｄ４
１．０６
２１３．２
１４０．１
４５．０１０．０２１．５１０．０
色氨酸：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ＴＲＰ；犬尿氨酸：ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，ＫＹＮ；保留时间：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ，ＲＴ；去簇电压：ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＤＰ；入口电压：ｅｎ ｔｒａｎｃｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＥＰ；碰撞能量：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ，ＣＥ；碰撞室出口电压：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｃｅｌｌｅｘｉｔｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＸＰ。
１．４ 溶液制备 精密称取色氨酸和犬尿氨酸适量，
溶于甲醇，得到标准品储备液：色氨酸２ｇ·Ｌ－１
，犬尿氨酸１ｇ·Ｌ－１
。采用上述标准品储备液制备８个
梯度浓度的混合标准品工作液（色氨酸：２００－
４００００μ
ｇ·Ｌ－１，犬尿氨酸：３ ７５－７５０μｇ·Ｌ－１
）。质量控制的样本分别为色氨酸：４００、４０００、２００００
μ
ｇ·Ｌ－１，犬尿氨酸：７ ５、７５、３７５μｇ·Ｌ－１
。精密称取适量的ＴＲＰ ｄ５和ＫＹＮ ｄ４，于甲醇中完全溶解，制成质量浓度均为１ｇ·Ｌ－１的储备液；分别稀释至１０００μｇ·Ｌ－１，５００μｇ·Ｌ－１为混合内标工作液。
所有标准溶液于８０℃保存备用。
称取Ｋ２ＨＰＯ４：１．４２ｇ和ＫＨ２ＰＯ４：０ ２７ｇ均完全溶解于超纯水，调节ｐＨ至７ ４即为磷酸盐缓冲液（ＫＰＩ），于４℃保存。精密称取ＭｇＣＩ２、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ，用超纯水溶解，分别配置成浓度为：６０、４０、１
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
的溶液；Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ（阳性药物）和白藜
芦醇，采用甲醇：ＤＭＳＯ（Ｖ∶Ｖ＝１０∶１）溶解，制成浓
度为４ｍｍｏｌ·Ｌ－１的储备液；上述溶液均于２０℃保
存备用。
１．５ 体外肝微粒体孵育色氨酸代谢 人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系总体积１２０μＬ，包括ＫＰＩ（ｐＨ７ ４）、ＭｇＣＩ２、人肝微粒体、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、色氨酸，如Ｔａｂ２所示。将上述试剂加入反应管中，３７℃孵育９０ｍｉｎ，孵育结束后转移至冰上，加入预冷的乙腈３６０μＬ及４０μＬ混合内标工作液终止反应，充分震
荡涡旋４ｍｉｎ，２０℃静置１０ｍｉｎ，１２０００ｒ·ｍｉｎ－１于
４℃离心２０ｍｉｎ，取上清液进行ＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析。１．６ 色氨酸在人肝微粒体中的酶动力
１．６．１ 最佳孵育时间优化 将Ｔａｂ２中体系各个成分加入反应管中，反应时间分别为：０、３０、６０、９０、
·０
５３·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
１２０、１８０、２７０、３６０ｍｉｎ，各时间点平行３份。每个时间点同时做一组不加色氨酸的对照组Ａ（孵育体系中不包括色氨酸），孵育结束后转移至冰上，之后同１ ５项下操作。绘制时间 犬尿氨酸曲线（犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个时间点的对照组Ａ），选取最佳色氨酸孵育时间。
Ｔａｂ２ Ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓｙｓｔｅｍｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
ｏｎｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ
ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ＴＲＰ８ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＤＰＨ２ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＭｇＣＩ２３ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＨＬＭ１ｇ·Ｌ－１
ＫＰＩ（ｐＨ＝７ ４）１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＦＡＤ５０μｍｏｌ·Ｌ－１
色氨酸：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ＴＲＰ；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：ｎｉｃｏｔｉｎ ａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＤＰＨ；人肝微粒体：ｈｕｍａｎｌｉｖ ｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅ，ＨＬＭ；黄素腺嘌呤二核苷酸：ｆｌａｖｉｎａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＡＤ；磷酸盐缓冲液：ＫＰＩ。
１．６．２ 最佳肝微粒体蛋白浓度优化 将色氨酸标准品工作液加入人肝微粒体孵育色氨酸代谢体
系中，其肝微粒体蛋白浓度分别为０、０ １６７、０ ２５、０ ５０、１ ００、１ ３３、２ ００、４ ００ｇ·Ｌ－１，各个肝微粒体蛋白浓度平行３份，孵育时间为９０ｍｉｎ（优化后的最佳时间）。针对每个肝微粒体蛋白浓度同时做一组不加色氨酸的对照组Ａ，孵育结束后转移至冰上，之后同１ ５项下操作。绘制微粒体蛋白浓度－犬尿氨酸曲线（犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个肝微粒体蛋白浓度的对照组Ａ），选取最佳肝微粒体蛋白浓度。
１．６．３ 色氨酸在体外人肝微粒体中的酶动力参数 取不同浓度的色氨酸标准品工作液，加入肝微粒体蛋白浓度为１ｇ·Ｌ－１（经过优化的肝微粒体蛋白浓度）的孵育体系中，使得色氨酸的最终浓度分别为：０、２、４、６、８、１０、１６、２０、４０ｍｇ·Ｌ－１，孵育９０ｍｉｎ，各个色氨酸浓度平行３份。同时做一组不加色氨酸的对照组Ａ，孵育结束后转移至冰上，之后同１ ５项下操作。绘制色氨酸浓度 犬尿氨酸酶动力学曲线（犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个色氨酸浓度的对照组Ａ），计算酶动力学参数。
１．７ 白藜芦醇对人肝微粒体代谢色氨酸的影响 将低、中、高３个浓度的Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ（阳性对照组）和白藜芦醇标准品（实验组）工作液，分别加入上述已优化的人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中，使得药物的终浓度为：２ ５、２０、５０μｍｏｌ·Ｌ－１，各个浓度平行３份。同时孵育对照组Ｂ（人肝微粒体孵育色氨酸体系）和对照组Ｃ（药物溶剂组）。孵育结束后
转移至冰上，之后同１ ５项下操作，分析犬尿氨酸生成量的变化。
１．８ 数据处理 实验所得数据采用ＳＰＳＳ２０ ０（ＩＢＭＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）软件进行分析，采用ＡＮＯＶＡ方法分析各组间差异。根据人肝微粒体的蛋白浓度和酶促反应时间计算酶促反应代谢物的生成速率；利用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ ０４软件，采用米氏方程Ｖ＝（Ｖ
ｍａｘ
摩羯男
×Ｓ）／（Ｋ
ｍ
＋Ｓ）进行非线性拟合，得
到色氨酸在人肝微粒体的动力学参数Ｖ
ｍａｘ
和Ｋ
ｍ
。
２ 结果
２．１ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ方法学
２．１．１ 方法专属性和线性 结果显示色氨酸、犬尿氨酸的保留时间分别为１ １０、１ ０９ｍｉｎ，峰型良好（Ｆｉｇ１）。在活性炭吸附已灭活的微粒体孵育体系中加入８个不同梯度浓度的混合标准品工作液，按照上述１ ５项的处理方法，进样分析得到峰面积。用最小二乘法进行相关与回归分析，待分析物的浓度为Ｘ轴，峰面积与内标的比值为Ｙ轴。结果表明色氨酸（２００－４００００μｇ·Ｌ－１），犬尿氨酸（３ ７５－７５０μｇ·Ｌ－１）线性关系良好（ｒ≥０ ９９）。２．１．２ 精密度和准确度 连续３ｄ检测最低定量限、低、中、高不同浓度的质控样本。结果显示色氨酸和犬尿氨酸日内精密度的ＲＳＤ分别为：３ ２６％－６ ２９％，３ ５８％－１４ ５２％；日间精密度的ＲＳＤ分别在６ ４０％－１６ ７３％，４ ４４％－１８ ０４％之间。肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸精密度的ＲＳＤ均在１５％以内，最低定量下限的精密度的ＲＳＤ在２０％范围内。最低定量限、低、中、高不同浓度的色氨酸和犬尿氨酸准确度的ＲＥ均在１５％以内。均符合生物样本检测要求（Ｔａｂ３）。
２．１．３ 基质效应、回收率和稳定性 该分析方法中测定肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸的基质效应分别在（８７ ３４±５ ５２）％－（９３ ９１±２ ６１）％，（８６ ３０±３ ２７）％－
（９２ ３０±３ ８５）％之间，均在１５％以内；因此样品制备分析方法对待测物质是有效的（Ｔａｂ３）。色氨酸和犬尿氨酸的回收率在（６４ ８３±５ ０３）％－（８０ ２１±３ ６７）％之间，ＲＳＤ均小于１５％（Ｔａｂ３）。考察肝微粒体孵育体系中低、高两个浓度的色氨酸和犬尿氨酸质控样品在室温、进样器放置４ｈ，２４ｈ反复冻融３次，以及８０℃放置１５和３０ｄ的稳定性。结果显示肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸在不同条件下测得浓度偏差均在１５％以内，说明样本在检测过程中稳定性良好（Ｔａｂ４）。
映的读音·
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
Ｆｉｇ１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ
（Ａ１）ＴＲＰ；（Ａ２）ＴＲＰｉｎｂｌａｎｋｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ；（Ｂ１）ＫＹＮ；（Ｂ２）ＫＹＮｉｎｂｌａｎｋｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ；（Ｃ）Ｂｌａｎｋｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ．
Ｔａｂ３ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｃｙ，ｒｅｃｏｖｅｒｙａｎｄｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ
王子鱼ｉｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ｎ＝６）
相思泪如雨
Ａｎａｌｙｔｅｓ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／μｇ·Ｌ－１
Ｍｅａｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／μｇ·Ｌ－１）
Ｉｎｔｅｒ ｄａｙｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
（ＲＳＤ，％）
Ｉｎｔｒａ ｄａｙｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
（ＲＳＤ，％）
ＡｃｃｕｒａｃｙＲＥ
（％）
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
（％，珋ｘ±ｓ）
Ｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔ
（％，珋ｘ±ｓ）ＴＲＰ２００２０４．３３６．２９１６．７３２．１７
４００４３１．１７４．１４８．５５７．７９８０．２１±３．６７８７．３４±５．５２
新疆大盘鸡的做法４０００４５３９．４４５．０２８．０６１３．４９６９．９２±６．４９９３．９１±２．６１
２００００２０３７７．７８３．２６６．４０１．８９７２．７７±３．９９８９．８６±２．３１ＫＹＮ３．７５０４．０８１４．５２１８．０４８．７３
７．５００７．５７１２．２３９．１１０．９１７９．２６±１１．０２９０．１３±７．６１
７５．０００７６．８５６．２５７．７４２．４７６５．９３±６．２２９２．３０±３．８５
３７５．０００３８２．３３３．５８４．４４１．９６６４．８３±５．０３８６．３０±３．２７ 色氨酸：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ＴＲＰ；犬尿氨酸：ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，ＫＹＮ。
Ｔａｂ４ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅｉｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
Ａｎａｌｙｔｅｓ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／ｍｇ·Ｌ－１
ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，４ｈ
ＲＥ％
Ｔｈｒｅｅｆｒｅｅｚｅ ｔｈａｗｃｙｃｌｅｓ
ＲＥ％
ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ，４ｈ
ＲＥ％
－８０℃，１５ｄ
ＲＥ％
第十二届全运会
－８０℃，３０ｄ
ＲＥ％ＴＲＰ４００．００４３０．６７７．６７４５２．１７１３．０４４３６．１７９．０４４３９．１７９．７９４４６．１７１１．５４２００００．００１８８７７．７８－５．６１２１１６６．６７５．８３１９２６６．６７－３．６７２０２３３．３３１．１７２０８７７．７８４．
３９ＫＹＮ７．５０７．７０２．６９７．７８３．７１８．１７８．８７７．８７４．８７７．８９５．２２３７５．００３７８．６７０．９８３９０．００４．００４１７．６７１１．３８４１３．５６１０．２８３８０．１１１．３６ 色氨酸：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ＴＲＰ；犬尿氨酸：ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，ＫＹＮ。
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２
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
Ｆｉｇ２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｍｉｃｒｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅｂｙ
ｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓａｎｄｅｎｚｙｍｅｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
Ａ：Ｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅｉｎｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅ；Ｂ：Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ；Ｃ：ＫｉｎｅｔｉｃｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｏｂｔａｉｎｅｄＫｍ＝（９５ ９１±２２ ２９）μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｖｍａｘ＝（２１ ３４±２ ５８）μｍｏＬ·ｇ－１·ｍｉｎ－１
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Ｆｉｇ３ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌａｎｄｅｐａｃａｄｏｓｔａｉｎｈｉｂｉｔｅｄｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｓｏｍａｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｏｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ
Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎｔｒｏｌＣ（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）；＃Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎｔｒｏｌＢ．
２．２ 色氨酸体外代谢孵育最佳时间 色氨酸与人肝微粒体在３７℃孵育不同时间（０－３６０）ｍｉｎ，考察代谢物犬尿氨酸的生成量和孵育时间的关系。结果如Ｆｉｇ２Ａ所示，在０－１２０ｍｉｎ内犬尿氨酸的生成量随时间呈增长趋势。１２０ｍｉｎ后犬尿氨酸的生成量逐渐趋于缓和。因此，最终选择９０ｍｉｎ为最佳孵育时间。２．３ 色氨酸体外代谢孵育的最佳肝微粒体蛋白浓度 人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中肝微粒体蛋白终浓度在０－４ｇ·Ｌ－１范围内，考察代谢物犬尿氨酸的生成量和肝微粒体蛋白浓度的关系。如Ｆｉｇ２Ｂ所示，犬尿氨酸的生成量与肝微粒体蛋白浓度在（０－１ ３３）ｇ·Ｌ－１范围内呈线性关系，随后犬尿氨酸生成量逐渐趋于缓和。因此，蛋白浓度在（０－１ ３３）ｇ·Ｌ－１范围内犬尿氨酸的生成速率最快，选择该范围内的肝微粒体蛋白浓度为最佳浓度。２．４ 色氨酸在肝微粒体中的酶动力学参数 色氨酸在体外人肝微粒体中代谢生成犬尿氨酸，酶反应速率常数Ｋ
ｍ
为（９５ ９１±２２ ２９）μｍｏｌ·Ｌ－１，最大
反应速率Ｖ
ｍａｘ
为（２１ ３４±２ ５８）μｍｏｌ·ｇ－１·ｍｉｎ－１；酶动力学曲线如Ｆｉｇ２Ｃ所示。２．５ 白藜芦醇以浓度依赖性抑制ＩＤＯ活性 在体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系分别加入低、中、高不同浓度的白藜芦醇和Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ。Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ是已报道的ＩＤＯ抑制剂，在本次研究做作为阳性药物达到阳性对照目的；加入肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中发现犬尿氨酸生成减少，并且具有浓度依赖性（Ｆｉｇ３Ａ）。肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中加入白藜芦醇也能够抑制犬尿氨酸的生成；并且随着白藜芦醇浓度增加，犬尿氨酸的生产量随之减少；２０μｍｏｌ·Ｌ－１和５０μｍｏｌ·Ｌ－１与对照组Ｂ和Ｃ比较均具有统计学差异（Ｆｉｇ３Ｂ）。这表明白藜芦醇能够以浓度依赖性抑制ＩＤＯ的活性，减少犬尿氨酸的生成。
３ 讨论
本研究创建体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系及采用ＬＣ ＭＳ／ＭＳ方法检测肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸。结果显示白藜芦醇通过抑制ＩＤＯ的活性减少犬尿氨酸的生成，其抑制能力的
强弱呈现浓度依赖性。利用ＬＣ ＭＳ／ＭＳ方法检测肝微粒体孵育体系中的色氨酸和犬尿氨酸水平，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、样本分析过程中待测
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
