ＲＡＧＥｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｒａｎｄｏｍｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅｗａｓｍａｒｋｅｄｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｕｒａｔｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｌｏｎｇｅｄａｎｄｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｙｏｆＩＣａ，Ｌ，Ｉｔｏ，ＩｋｕｒａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎｓＣａｖ１ ２，Ｋｖ４ ３ａｎｄＫｖ１ ５ｍａｒｋｅｄｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎａｔｒｉａｌｍｙｏｃｙｔｅｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅＡＧＥａｎｄＲＡＧＥｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ 关于长江的古诗>离职证明
Ｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｔｒｉａｌｍｙｏｃｙｔｅｓｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｌｏｎｇｅｄｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｙｏｆＩＣａ，Ｌ，Ｉｔｏ，Ｉｋｕｒａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｅｃｒｅａｓｅ；ＡＧＥｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｅ ｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆＨＬ １ａｔｒｉａｌｍｙｏｃｙｔｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ；ＳＴＺ；ｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ；ｅ ｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ；ａｔｒｉａｌｍｙｏｃｙｔｅｓ；ＡＧＥ
网络出版时间：２０２０－１２－１７１３：３９ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０２０１２１５．１１２０．０３２．ｈｔｍｌ
白藜芦醇通过线粒体调控血吸虫感染小鼠Ｍ１／Ｍ２极化
周慧慧，吕年银，佟书娟，史丽云，张伟伟
（南京中医药大学病原与免疫学教研室，江苏南京 ２１００２３）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０１．０１６
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０１－００９８－０９中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３２２．４７；Ｒ３２９．２４；Ｒ３９２ １２；Ｒ５３２ ２１
摘要：目的 探讨白藜芦醇对血吸虫病巨噬细胞极化的作用及机制。方法 ４５只血吸虫感染小鼠３周后，随机分３组，Ａ组感染组，Ｂ组白藜芦醇治疗组，Ｃ组吡喹酮治疗组，另取１
５只小鼠为健康对照Ｄ组。感染第９周，流式细胞术检测肝脏Ｍ１、Ｍ２，ＡＴＰ试剂盒检测肝脏巨噬细胞ＡＴＰ，实时定量ＰＣＲ检测Ｍ１和Ｍ２相关因子、ｍｔＤＮＡ。采用虫卵可溶性抗原（ＳＥ
Ａ）刺激ＲＡＷ２６４．７，再给予白藜芦醇处理，检测Ｍ１、Ｍ２比例，细胞上清中Ｍ１和Ｍ２相关因子，ＰＧＣ １α，ｍｔＤ ＮＡ和ＡＴＰ。结果 Ｂ组Ｍ１比例高于Ａ组（Ｐ＜０ ０１），Ｍ２比例低于Ａ组（Ｐ＜０ ０５），肝脏巨噬细胞Ｍ２相关因子、ＰＧＣ １α、ｍｔＤＮＡ、ＡＴＰ、基础耗氧率均低于Ａ组（Ｐ＜０ ０５），Ｍ１相关因子高于Ａ组（Ｐ＜０ ０５）。白藜芦醇使ＲＡＷ２６４．７往Ｍ１分化增多（Ｐ＜０ ０１），往Ｍ２分化减少（Ｐ＜０ ０１），Ｍ２相关因子降低（Ｐ＜０ ０５），ｍｔＤＮＡ、ＰＧＣ １α、ＡＴＰ、基础耗氧率降低（Ｐ＜０ ０５），Ｍ１相关因子增高（Ｐ＜０ ０５）。结论 白藜芦醇通过抑制巨噬细胞线粒体数量和功能促进其往Ｍ１分化，抑制其往Ｍ２分化。
关键词：日本血吸虫；白藜芦醇；Ｍ１；Ｍ２；线粒体；ＰＧＣ １α开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
收稿日期：２０２０－０８－１７，修回日期：２０２０－１０－２０基金项目：江苏省自然科学基金青年项目（ＢＫ２０１７１０６９）
作者简介：周慧慧（１９９６－），女，硕士，研究方向：中医药抗感染与免
疫机理，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｈ２０１８＠１６３．ｃｏｍ；
张伟伟（１９８７－），女，博士，讲师，研究方向：中医药抗感染与免疫机理，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ａｌｌｉｅｎ２４２＠１２６．ｃｏｍ
血吸虫病迄今仍然在全球广泛流行并且严重危害人类健康和生活。已经明确血吸虫感染最严重的病理变化是虫卵沉积肝脏形成的虫卵肉芽肿并继发
张晨璐
纤维化［１］
。研究已经证明，巨噬细胞在血吸虫病肝
脏病理过程中发挥关键调节作用，巨噬细胞感染早期向经典激活的巨噬细胞（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖａｔｅｄｍａｃ ｒｏｐｈａｇｅ，Ｍ１）转化，高表达ｉＮＯＳ、ＣＤ１６／３２，分泌促炎因子ＩＬ １２、ＴＮＦ α，促进Ｔｈ１应答，从而抑制肝脏肉芽肿的形成发展；虫卵抗原ＳＥＡ诱导替代激活的巨噬细胞（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙａｃｔｉｖａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，Ｍ２）产生，通过高表达精氨酸酶 １（Ａｒｇ１）、ＣＤ２０６，分泌抑炎因子ＩＬ １０、ＴＧＦ β
，促进Ｔｈ２应答从而成为促进肝脏炎性肉芽肿及纤维化的关键因素［２－４］。因此，调控
柳暗花明的反义词血吸虫肝脏病理进程中巨噬细胞从Ｍ１ Ｍ２表型的平衡可以成为开发治疗血吸虫病药物的新策略。
白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）是一种非黄酮多酚类化合物，研究发现，白藜芦醇具有多种生物活性如抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等，近期有课题组发现其也对多种免疫细胞具有调控作用。比如，白藜芦醇对肝脏缺血／再灌注损伤的保护是通过调节巨噬细胞
糯米子糕极化发挥作用的［５］。白藜芦醇促进巨噬细胞Ｍ２极
化并缓解小鼠急性痛风性关节炎。本课题组前期研究发现白藜芦醇可以调控Ｔｈ１／Ｔｈ２应答抑制血吸虫病的肝脏纤维化，提示白藜芦醇可能在血吸虫感
染中通过调控巨噬细胞Ｍ１／Ｍ２极化进而影响Ｔｈ１／Ｔｈ２应答发挥抑制肝脏病理的作用，但还未有研
究［６］。许多学者发现，巨噬细胞极化与细胞代谢存
在着密切联系，而其中线粒体发挥了至关重要的作
用［７－９］，如研究发现抑制小鼠巨噬细胞诱导型一氧
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８９·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）：９８～１０６
化氮合酶可以阻碍ＬＰＳ＋ＩＦＮ γ诱导的线粒体呼吸功能下降，改善代谢，促进巨噬细胞从表型Ｍ１往Ｍ２型极化。在Ｍ２型的肿瘤相关巨噬细胞中的代谢特征表现为线粒体通过氧化磷酸化（ＯＸＰＨＯＳ）合成ＡＴＰ为Ｍ２极化供能，且过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子１α（ＰＧＣ １α）高表达，能够促进线粒体生物合成，增强ＯＸＰＨＯＳ过程产生更多的ＡＴＰ［１０］。基于上述的研究背景，本研究拟采用白藜芦醇灌胃日本血吸虫感染小鼠，探讨白藜芦醇对Ｍ１／Ｍ２极化的影响及相应代谢学机制，为白藜芦醇治疗血吸虫病提供更多的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验动物与阳性钉螺 采用于南京大学模式动物研究所的清洁级６－９周龄的雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠６０只（温度：２０℃；湿度：４０％；笼内密度：４；自由获得水和食物），经南京中医药大学科学考察委员会批准，按照ＮＩＨ《实验动物护理与使用指南》进行动物实验。日本血吸虫感染性钉螺购自南京市疾病预防控制中心。
１．２ 试剂 白藜芦醇（纯度为９８％以上，批号ＫＡ０８０ＣＡ１４）购自上海源叶生物技术有限公司。吡喹酮购自南京制药厂有限公司（批号２００９１２０２）。流式抗体大鼠抗小鼠Ｆ４／８
０ ＦＩＴＣ（批号４２８１１２３）、大鼠抗小鼠ＣＤ１６／３２ ＰＥ（批号４３１２２９８）、大鼠抗小鼠ＣＤ２０６ ＰＥ（批号２００５２０２）、大鼠抗小鼠ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ（批号１９４７１９８），均购自ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。ＡＴＰＡｓｓａｙＫｉｔ（批号０４０２１９１９０９１８）购自上海碧云天生物技术有限公司。线粒体ＤＮＡ检测试剂盒（批号１５７０５２０１４），购自Ａｂｃａｍ公司。小鼠ＴＮＦ α（批号１９０１ ２）、ＩＬ １２ｐ４０（批号Ｅ２０６０ １８１０ １）、ＩＬ １０（批号Ｅ２１００ １７１０ １）、ＴＧＦ βＥＬＩＳＡ（批号Ｅ２７１０ １９１０ １）检测试剂盒，购自达科为生物技术股份有限公司。小鼠Ａｒｇ１的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，购自武汉菲恩生物技术有限公司。小鼠ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ４０、ＩＬ １０、ＴＧＦ β和ＰＧＣ １α的引物，购自上海英骏生物技术有限公司。小鼠ｉＮＯＳ检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所（批号０５５５４１）。ＴＲＩｚｏｌＴＭ，购自上海英骏生物技术有限公司，逆转录试剂盒，购自Ｆｅｒｍａｎｔａｓ公司（批号００７９１０１６），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ，购自Ｒｏｃｈｅ公司，ｓｅａｈｏｒｓｅ检测用抑制剂，购自ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。
１．３ 仪器 ＣＯ
小珊迪２
培养箱（ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ公司）；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪（ＢＤ公司）；超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）；低温离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；７５００型实时定量ＰＣＲ仪（美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司）；酶标分析仪（美国Ｂｉｏ Ｔｅｋ公司）；ｓｅａｈｏｒｓｅＸＦｅ９６分析仪（美国ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
１．４ 感染模型的建立和分组 取６～９周龄雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠４５只，每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（１２±２）条。自感染３周后，血吸虫感染小鼠随机分为３组，每组１５只。小鼠设４组：感染组小鼠为Ａ组，白藜芦醇灌胃治疗的小鼠为Ｂ组，从感染第６周连续３周灌胃白藜芦醇２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１，灌胃吡喹酮治疗的小鼠为Ｃ组，从感染后第３、６周分别灌胃吡喹酮５００ｍｇ··ｋｇ－１·ｄ－１×３ｄ，另取正常健康小鼠１５只为Ｄ组，为健康对照组，白藜芦醇和吡喹酮的剂量参照已发表文献［６］。
１．５ 体外ＳＥＡ刺激和分组 取对数生长期的ＲＡＷ２６４ ７，用完全ＤＭＥＭ培养基将细胞浓度都调至５×１０５·ｍＬ－１，接种于６孔培养板；加入ＰＢＳ为ＰＢＳ处理组，加入终浓度２０ｍｇ·Ｌ－１的ＳＥＡ为ＳＥＡ处理组，加入终浓度２０ｍｇ·Ｌ－１的ＳＥＡ和终浓度为２０ｍｇ·Ｌ－１的白藜芦醇为白藜芦醇处理组，加入终浓度２０ｍｇ·Ｌ－１的ＳＥＡ和终浓度为１００ｍｇ·Ｌ－１的吡喹酮为吡喹酮处理组，共培养７２ｈ后收集细胞和培养上清。
１．６ 肝脏巨噬细胞的提取 摘取感染９周小鼠的肝脏，用ＰＢＳ缓冲液洗２遍，剪碎，放入研磨仪中研磨５ｍｉｎ，收集细胞悬液于１５ｍＬ离心管中，２０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃，离心，１０ｍｉｎ，弃去上清，加入５ｍＬ红细胞裂解液，冰上静置后离心，取上清，再重复离心２次，均取上清。将上清２０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心，１０ｍｉｎ，弃掉上清，用３ｍＬ４０％ｐｅｒｃｏｌｌ重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液缓慢地铺陈到３ｍＬ８０％的ｐｅｒ ｃｏｌｌ上，以２０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃，梯度离心２０ｍｉｎ，取中间相液体。２０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心１０ｍｉｎ，去上清。用１０ｍＬ完全ＤＭＥＭ重悬细胞沉淀，放入１０ｃｍ的培养皿中贴壁２ｈ，洗去不贴壁的细胞，得到的贴壁细胞即为肝脏巨噬细胞。
１．７ ＡＴＰａｓｓａｙｋｉｔ检测巨噬细胞ＡＴＰ含量 取２×１０６巨噬细胞加入２００μＬ细胞裂解液，用移液器反复吹打，转移至１ ５ｍＬ离心管中，冰上放置３０ｍｉｎ，４℃，１２０００×ｇ，５ｍｉｎ离心，取上清。冰上溶解待用试剂，按照说明书浓度要求配制标准品。以每孔１００μＬＡＴＰ工作液加入检测孔内，室温放置５ｍｉｎ，以消耗掉本底ＡＴＰ，降低背景。在检测孔内加入２０μＬ样品或标准品，混匀，２ｓ后用酶标仪检测ＲＬＵ值。
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１．８ 流式细胞术检测Ｍ１和Ｍ２巨噬细胞比例 在感染第９周，脱颈处死各组小鼠，摘取肝脏剪碎，采用研磨仪制备成单细胞悬液，用完全ＤＭＥＭ培养液将浓度调节至１×１０９·Ｌ－１。取１ｍＬ细胞悬液，１５００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃，离心５ｍｉｎ，加入１００μＬ的ＰＢＳ缓冲液，同时加入抗体ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ（０ ４ｇ·Ｌ－１）和Ｆ４／８０ ＦＩＴＣ（０ ５ｇ·Ｌ－１），对于检测Ｍ１加入ＣＤ１６／３２ ＰＥ（０．１ｇ·Ｌ－１），对于检测Ｍ２加入ＣＤ２０６（０ ２ｇ·Ｌ－１），混匀，置４℃避光孵育３０ｍｉｎ。用ＰＢＳ缓冲液洗２遍后，加入５００μＬ的ＰＢＳ缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司）检测。
１．９ 实时定量ＲＴ ＰＣＲ检测巨噬细胞中的ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ４０、ＩＬ １０、ＴＧＦ β和ＰＧＣ １α的ｍＲＮＡ水平 取各组小鼠２×１０６肝脏巨噬细胞，用ＴＲＩｚｏｌＴＭ提取总ＲＮＡ，按Ｍ ＭＬＶ转录ｃＤＮＡ。ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ
４０、ＩＬ １０、ＴＧＦ β、ＰＧＣ １α的反应体系都为ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，反转录ｃＤＮＡ５μＬ，上游引物１μＬ，下游引物１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３μＬ，总体积２０μＬ。实时荧光定量ＰＣＲ反应条件：９５℃１０ｍｉｎ，４０个循环：６０℃６０ｓ，９５℃１５ｓ，溶解曲线６０－９０℃保证扩增为单一产物。以Ｃｔ值进行结果分析，采用相对量法与内参β ａｃｔｉｎ做比较。计算公式为：２－ΔＣＴ，ΔＣｔ＝Ｃｔｇｅｎｅ－Ｃｔｃｏｎ ｔｒｏｌ。各分子引物如下：
ｉＮＯＳ：Ｆ：５′ ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧ ３′Ｒ：５′ ＧＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧ ３′ Ａｒｇ１：Ｆ：５′ ＴＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＡ ３′
Ｒ：５′ ＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＡ ３′ ＴＮＦ α：Ｆ：５′ ＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＧ ３′
Ｒ：５′ ＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣ ３′
ＩＬ １２：Ｆ：５′ ＴＧＧＡＧＣＡＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡ ３′
Ｒ：５′ ＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴ ３′
ＩＬ １０：Ｆ：５′ ＣＴＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡ ３′Ｒ：５′ ＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ ３′
ＴＧＦ β：Ｆ：５′ ＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴ ３′Ｒ：５′ ＣＡＣＴＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＣＡＴ ３′ ＰＧＣ １α：Ｆ：５′ ＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＧ ３′
Ｒ：５′ ＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣ ３′１．１０ ＥＬＩＳＡ检测ＲＡＷ２６４ ７培养上清中ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ４０、ＩＬ １０、ＴＧＦ β的表达水平 将体外经ＳＥＡ刺激的不同处理组细胞和培养上清收集于１５ｍＬ离心管中，１５００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心５ｍｉｎ，吸取上清，采用酶联免疫吸附试验检测上述细胞因子的水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。
１．１１ ｓｅａｈｏｒｓｅ检测细胞耗氧量 将收集的不同组的巨噬细细胞以０ ２×１０４／孔接种于９６孔ｓｅａｈｏｒｓｅ检测专用细胞培养板，每行培养板留一个孔，仅含有培养基，不含细胞，作为阴性对照。将含有校准溶液（２００μＬ／孔）的测试板以及含有注射器端口和探针的板放置在３７℃的无二氧化碳培养箱中过夜。ｄ２去掉细胞培养板中的培养基，用ｓｅａｈｏｒｓｅ分析缓冲液（２００μＬ／孔）替换，并置于无二氧化碳培养箱中至少０ ５ｈ。然后将抑制剂（寡霉素、
ＦＣＣＰ、抗霉素Ａ和鱼藤酮）添加到喷油器板。该板和测试板一起在ｓｅａｈｏｒｓｅＸＦｅ９６分析仪上运行以进行校准。完成后，将测试板替换为检测专用细胞培养板，并在ｓｅａ ｈｏｒｓｅＸＦｅ９６细胞能量代谢分析仪上运行。
１．１２ 统计分析 数据结果用ＳＰＳＳ１５ ０软件进行统计分析，并用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６ ０软件制作统计图。多组间比较宜于用方差分析，两两比较用ＳＮＫ法。
２ 结果
２．１ 不同处理组小鼠肝脏中Ｍ１和Ｍ２的比例 在日本血吸虫感染第９周，检测小鼠肝脏巨噬细胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋）中Ｍ１（ＣＤ１６／３２＋）和Ｍ２（ＣＤ２０６＋）的比例发现，如Ｆｉｇ１所示，比较健康对照组小鼠，感染组、白藜芦醇治疗组、吡喹酮治疗组的Ｍ１比例都明显增高（Ｐ＜０ ０５），感染组、白藜芦醇治疗组、吡喹酮治疗组的Ｍ２比例也显著增高（Ｐ＜０ ０１）。但是比较感染组，白藜芦醇治疗组的Ｍ１比例显著增高（Ｐ＜０ ０１），Ｍ２比例明显降低（Ｐ＜０ ０５），而吡喹酮治疗组的Ｍ１比例都显著低于感染组（Ｐ＜０ ０５），Ｍ２比例没有差异（Ｐ＞０ ０５）。白藜芦醇治疗组的Ｍ１比例高于吡喹酮治疗组（Ｐ＜０ ０１），而Ｍ２比例明显低于吡喹酮治疗组（Ｐ＜０ ０５）。
２．２ 不同处理组肝脏巨噬细胞中ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮ α、ＩＬ １２ｐ４０、ＩＬ １０、Ｔ
ＧＦ β的ｍＲＮＡ水平 进一步确证白藜芦醇对巨噬细胞极化的影响，检测了血吸虫感染９周各组Ｍ１和Ｍ２相关因子的表达水平。如Ｆｉｇ２所示，与健康对照组比较，感染组、白藜芦醇治疗组、吡喹酮治疗组小鼠的肝脏中ｉＮＯＳ、Ａｒｇ１、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ４０、ＩＬ １０、ＴＧＦ β的ｍＲＮＡ表达水平都增高（Ｐ＜０ ０５），并且感染组和吡喹酮治疗组的Ｍ１相关因子ｉＮＯＳ、ＴＮＦ α、ＩＬ １２ｐ４０的表达都低于白藜芦醇治疗组，感染组和吡喹酮组的Ｍ２相关因子Ａｒｇ１、ＩＬ １０、ＴＧＦ β的ｍＲＮＡ表达水平高于白藜芦醇组（Ｐ＜０ ０５）。而感染组的ｉＮＯＳ、ＴＮＦ α、ＩＬ
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元宵节为什么要吃元宵
Ｆｉｇ１ ＰｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆＭ１ａｎｄＭ２ｃｅｌｌｓｉｎｌｉｖｅｒｏｆｍｉｃｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１５）
Ａ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆＭ１ｃｅｌｌｓ；Ｂ：ＰｅｒｃｅｎｔｓｏｆＭ１ｃｅｌｌｓ；Ｃ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆＭ２ｃｅｌｌｓ；Ｄ：ＰｅｒｃｅｎｔｓｏｆＭ２ｃｅｌｌｓ． Ｐ＜０ ０１５， Ｐ＜０ ０１ｖｓ
ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓｉｎｆｅｃｔｅｄｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０ ０５，△△Ｐ＜０ ０１ｖｓｐｒａｚｉｑｕａｎｔｅｌｇｒｏｕ
ｐ
Ｆｉｇ２ ＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆｉＮＯＳ，Ａｒｇ１，ＴＮＦ α，ＩＬ １２，ＩＬ １０，ＴＧＦ βｉ
ｎｈｅｐａｔｉｃｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｏｆｍｉｃｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１５）Ａ：ＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆｉＮＯＳ，ＩＬ １２，ＴＮＦ αｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；Ｂ：ＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＡｒｇ１，ＩＬ １０，ＴＧＦ βｉ
ｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ； Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓｉｎｆｅｃｔｅｄｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０ ０５，△△Ｐ＜０ ０１ｖｓｐｒａｚｉｑｕａｎｔｅｌｇｒｏｕｐ
１２ｐ４０的表达都高于吡喹酮组（Ｐ＜０ ０５），两组的Ａｒｇ１、ＩＬ １０、ＴＧＦ β的表达水平没有差异（
Ｐ＞０ ０５）。２．３ 体外不同处理组Ｍ１及其相关因子，Ｍ２及其相关因子的水平 在体外采用不同的处理
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１０１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０
清理手机喇叭灰尘２１Ｊａｎ；３７（１）
ＲＡＷ２６４ ７细胞实验去验证体内结果，如Ｆｉｇ３，４所示，与ＰＢＳ处理组相比较，ＳＥＡ处理组、白藜芦醇处理组、吡喹酮处理组的Ｍ１和Ｍ２的比例都明显增高（Ｐ＜０ ０５）。但是白藜芦醇处理组的Ｍ１的比例显著高于Ｓ
ＥＡ处理组（Ｐ＜０ ０１），相应的ｉＮＯＳ、ＴＮＦ α、ＩＬ １２的分泌水平也高于ＳＥＡ处理组（Ｐ＜０ ０５）。而与ＳＥＡ处理组比较，白藜芦醇处理组的Ｍ２比例下降（Ｐ＜０ ０１），Ａｒｇ１、ＩＬ １０、ＴＧＦ β的分泌水平也明显下调（Ｐ＜０ ０５）。此外，吡喹酮处理组的Ｍ１比例及ｉＮＯＳ、ＴＮＦ α、ＩＬ １２的分泌水平也高于ＰＢＳ组（Ｐ＜０ ０５），但低于白藜芦醇处理组（Ｐ＜０ ０５）。上述的结果提示白藜芦醇可能通过上调Ｍ１，下调Ｍ２分化，进而调控Ｔｈ１／Ｔｈ２抑制血吸虫病肝脏病理。
２．４ 不同处理组肝脏巨噬细胞中线粒体的合成和
功能 研究表明线粒体在巨噬细胞Ｍ１／Ｍ２极化中发挥关键作用，进一步探究白藜芦醇是否通过影响线粒体的合成或者功能调控巨噬细胞极化，检测了感染９周各组小鼠肝脏巨噬细胞中ｍｔＤＮＡ、ＰＧＣ １α的表达水平、ＡＴＰ的产生及基础耗氧率。如Ｆｉｇ５所示，感染组、白藜芦醇治疗组、吡喹酮治疗组的巨噬细胞中ｍｔＤＮＡ、ＰＧＣ １α的ｍＲＮＡ表达水平都高于健康对照组（Ｐ＜０
０５），ＡＴＰ的产生、基础耗氧率也多于健康对照组（Ｐ＜０ ０１）。同时白藜芦醇治疗组的ｍｔＤＮＡ、ＰＧＣ １α的水平低于感染组（Ｐ＜０ ０５），低于吡喹酮治疗组（Ｐ＜０ ０５）。ＡＴＰ的产生、基础耗氧量也明显低于感染组（Ｐ＜０ ０１），低于吡喹酮治疗组（Ｐ＜０ ０１）。提示白藜芦醇可能通过抑制线粒体的合成和功能进而抑制巨噬细胞往Ｍ２极化，促进往Ｍ１
极化。
Ｆｉｇ３ ＰｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆＭ１ａｎｄＭ２ｃｅｌｌｓｉｎｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１５）
Ａ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆＭ１ｃｅｌｌｓ；Ｂ：ＰｅｒｃｅｎｔｓｏｆＭ１ｃｅｌｌｓ；Ｃ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆＭ２ｃｅｌｌｓ；Ｄ：ＰｅｒｃｅｎｔｓｏｆＭ２ｃｅｌｌｓ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎ ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓｉｎｆｅｃｔｅｄｇｒｏｕｐ；△△Ｐ＜０ ０１ｖｓｐｒａｚｉｑｕａｎｔｅｌｇｒｏｕｐ
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２０１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
