网络出版时间:2021-4-2217:07:00 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20210422.1412.026.html
白杨素通过PI3K/AKT信号通路抑制LPS诱导的软骨细胞自噬
杨 阳1,何 宇2,史于传2,舒见威3,虞 乐3,胡 伟1
(安徽医科大学第二附属医院1.药物临床试验研究中心、2.妇产科,3.麻醉与围术期
医学安徽省普通高校重点实验室,安徽合肥 2
30601)doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.05.013
文献标志码:A文章编号:1001-1978(2021)05-0662-07中国图书分类号:R 332;R285 5;R329 24;R392;R684 3;R977 6
摘要:目的 探索白杨素对脂多糖诱导的大鼠软骨细胞骨关节炎模型中对软骨细胞自噬的作用及其机制。方法 提取10只SPF级SD大鼠关节软骨正常细胞进行体外分离培养,通过LPS诱导大鼠
软骨细胞自噬。实验分为空白对照组、LPS组、白杨素(CHR)组和LPS+CHR组;CCK 8法检测各分组细胞的活性、Rhodamine123检测各组细胞中线粒体膜电位、DCFH DA检测各组细胞的活性氧,Westernblot法检测各组细胞中PI3K、AKT、p PI3K、p AKT、Beclin 1及LC3Ⅱ的蛋白表达。结果 白杨素对LPS诱导的软骨细胞自噬具有抑制作用,且当白杨素浓度为10mmol·L-1
时抑制自噬作用最为显著;白杨素能够抑制LPS所致LPS诱导的软骨细胞的活性氧(ROS)的增加;白杨素抑制了细胞受损后线粒体膜电位的降低;同时白杨素抑制Beclin 1、LC3Ⅱ蛋白的表达,抑制PI3K和AKT的磷酸化。结论 白杨素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调自噬蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ的表达抑制自噬,进而保护软骨细胞。
关键词:白杨素;软骨细胞;脂多糖;自噬;ROS;PI3K/AKT
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
收稿日期:2021-01-15,修回日期:2021-03-03基金项目:国家自然科学基金资助项目(No82071591)
作者简介:杨 阳(1993-),男,硕士生,研究方向:中药药理学,E
mail
:yyang_2008316@126.com;胡 伟(1976-),男,博士,教授,硕士生导师,研究方向:中药药理学,通讯作者,E mail:aydphd2001@163.com
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性疾病,被认为2020年致残的4个主要因素之一,并
影响着全世界四分之一的中、老年人群[1]
。OA临
床上主要症状为关节疼痛、僵硬甚至残疾,其病理为进行性关节软骨降解、骨赘形成、软骨下骨重建和滑
膜炎症[2]。OA的发病机制是多因素和复杂的,受
维持关节损伤发展的信号级联反应激活的影响,在OA疾病的发展中,已经牵涉到活性氧(ROS)和相
关信号通路的改变[3]
。尽管长期以来首先将其归
类为一种主要是非炎症性的关节疾病,其研究重点是生物力学方面和磨损和撕裂的不平衡,但是最新
的免疫学的研究有助于改善对该疾病的解释[4]。
缴费工资脂多糖(
lipopolysaccharide,LPS)也称为内毒素,是革兰氏阴性菌的外膜成分,在组成性产生的外膜小泡中释放,小泡中也含有蛋白质。脂多糖在L929细胞
核和巨噬细胞中诱导自噬[
5],在Xue等[6]
伊索寓言读书笔记的研究中发现抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进骨关节炎大鼠关节软骨细胞自噬并且减轻了炎症反应。也有研究表明抑制PI3K/Akt信号通路可以改善骨关节
炎的进展[7]
。
白杨素(
chrysin,CHR)属于植物类黄酮化合物,它广泛存在于蜂胶、蜂蜜、百香果中,甚至存在于蘑菇和其他植物来源中,抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒的活性,同时已被广泛用于各种退行性疾病的治疗,
因此拥有巨大的经济价值和药用价值[8,9]。有文献
报道,在OA的过程中伴随着软骨细细胞自噬,但白杨素对O
A的治疗作用暂未有文献报道,且白杨素对自噬的作用机制尚未阐明,因此本研究旨在探索白杨素对LPS诱导软骨细胞自噬的作用和机制。1 材料
1.1 药品与主要试剂 白杨素(纯度≥99 8%)(货号:HY 14589):购自MedChemExpress公司;脂多糖(货号:SMB00610):美国Sigma公司;DMEM培养基(货号:10565018):美国Gibco公司;CCK 8(货号:BS350B):北京兰杰柯科技有限公司;活性氧检测试剂盒(货号:S0033S)、RIPA裂解液(货号:P0013C)、SDS PAGE蛋白上样缓冲液(货号:P0015A)、BCA测定蛋白浓度试剂盒(货号:P0012S):上海碧云天生物技术有限公司;β actin一抗(货号:ab8226)
、PI3K一抗(货号:ab191606)、p PI3K一抗(货号:ab182651)、LC3B一抗(货号:ab192890)、Beclin 1一抗(货号:ab210498):购于英国Abcam公司;AKT一抗(货号:AF6261)、p AKT
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266·中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021May;37(5):662-8
一抗(货号:AF0016):购于美国Affinity公司。
1.2 主要仪器 倒置荧光显微镜(日本Olympus);正置荧光显微镜(德国Zeiss);全波长全自动酶标仪(美国Thermo);CO
2
培养箱(美国Thermo)。
2 方法
2.1 大鼠软骨细胞分离、培养和传代 软骨细胞的提取:SPF级健康SD大鼠10只,♂,4周龄,体质量110-130g,购自山东省朋悦实验动物繁育有限公司,合格证号:SCXK(鲁)20190003,大鼠分别饲养于室温18℃-25℃的干燥层流室内,颈椎脱位处死大鼠,将其浸泡于含75%医用酒精中20min。在无菌培养皿中加入含有1%双抗的完全培养基。在无菌条件下将大鼠下肢截取,去除脂肪组织,同时将分离的膝关节留在培养皿上。分离关节软骨,切除关节软骨面和股骨头,获得肱骨头表面软骨。软骨用培养基冲洗3次,然后用眼用剪刀切成1mm3大小。再加入含0 25%EDTA的胰蛋白酶,在37℃孵箱中消化软骨组织,并轻轻摇晃1次。孵育30min后加入新鲜培养基终止消化,后加入0 2%Ⅱ型胶原酶,37℃孵育4h,用200目无菌尼龙网过筛,1800r·min-1离心5min。随后,去掉上清液,加入适量的新鲜培养基制备细胞悬液。细胞接种于25cm2
的培养瓶中,37℃,5%CO
2
一个星期有几天进行原代培养。隔天更换培养基,倒置显微镜观察细胞生长情况。当细胞融合率达到80%时进行传代培养。去掉培养瓶中的培养基,用PBS洗涤细胞2次,加入含0 25%ED TA胰蛋白酶1mL后在显微镜下观察细胞形态。在1800r·min-1离心5min后,去掉上清液,将细胞重新悬浮在新鲜的完全培养基中,使其充分混合。最后,将细胞传代到培养瓶中进行培养。
2.2 分组 实验分为四组,分别为空白对照组、LPS组、白杨素(CHR)组和LPS+CHR组,其中空白对照组仅加入完全培养基,LPS组加入LPS,CHR组加入白杨素,CHR+LPS组加入LPS与白杨素。2.3 大鼠软骨细胞的鉴定
2.3.1 甲苯胺蓝染色 将大鼠第3代关节软骨细胞接种于有盖玻片(4%多聚赖氨酸处理过)的六孔板中,每孔5×104个细胞,24h后观察细胞贴壁情况,并更换培养液,3d更换1次培养液,倒置显微镜下观察并摄片记录。当细胞铺满盖玻片60%-70%时取出盖玻片,用PBS漂洗玻片3次,滴加4%多聚甲醛,在室温下固定1h,再用PBS缓冲液漂洗玻片3次,加入2%甲苯胺蓝染色液室温放置1h,然后用双蒸水漂洗至蓝色基本消失,晾干后用中性树脂封片,倒置显微镜观察收集图像。2.3.2 二型胶原免疫组织化学染色 将大鼠第3代关节软骨细胞接种于有盖玻片(4%多聚赖氨酸处理过)的6孔板中,每孔5×104个细胞,24h后用10%多聚甲醛固定40min,用PBS冲洗3次,每次3min。之后添加50mL0 1%TritonX 100,并用PBS进行漂洗。细胞在室温下用3%H
2
O
2
孵育10min,用PBS进行洗涤3次。去除PBS缓冲液后,加入50mL5%封闭液室温孵育30min,向玻片中加入50mL一抗(1∶200),并在4℃下孵育过夜,然后用PBS清洗3次,每次3min。加入50mL的二抗室温孵育30min,用PBS洗涤。加入100mL新制备的二氨基联苯胺(DAB)溶液进行显微镜观察。盖玻片用自来水轻轻冲洗,细胞样本用苏木精复染1min,用自来水冲洗,盖玻片置于分级酒精中脱水。干燥的盖玻片用二甲苯透明处理,并用中性树脂粘合,将制备好的样品用倒置显微镜观察收集图像。2.4 白杨素剂量的筛选 传代至第二代的软骨细胞在96孔板(每孔5×104个细胞)中培养24h,加入LPS(100μg·L-1),然后继续在不同浓度的白杨素(0、5、10、20、40、80mmol·L-1)中分别培养24h、48h。在规定的时间,用PBS清洗细胞,每孔添加100μLDMEM,将10μL的CCK 8溶液加入每个孔中,并在37℃培养箱中培养1h。然后使用全自动酶标仪检测,激发波长450nm,重复3次以上实验。2.5 活性氧ROS的检测 取对数生长期的细胞,以2×106个·L-1的密度接种于6孔板,分别设置空白组(未处理)、模型组(LPS处理)、加药组(CHR)、实验组(LPS+CHR),预孵育LPS2h,CHR处理24h,按照1∶1000的比例使用无血清培养基稀释DCFH DA荧光探针,使DCFH DA的终浓度为10mmol·L-1,每孔加入2mL稀释的DCFH DA探针培养基,37℃细胞培养箱孵育细胞20min后,弃去培养液,使用无血清DEME培养基清洗3次,充分洗涤细胞以除去未进入细胞的游离探针;于488nm激发波长处使用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光水平,并摄片。
电动车选购2.6 Rhodamine123线粒体膜电位检测 取对数生长期的细胞,以2×106个·L-1的密度接种于6孔板,分别设置空白组(未处理)、模型组(LPS处理)、加药组(CHR)、实验组(LPS+CHR),LPS预处理2h,CHR处理48h,按照1∶1000的比例向每孔中加入1μL的Rhodamine123染料原液,使Rhodamine123的终浓度为1mmol·L-1,37℃细胞培养箱孵育细胞30min后,弃尽培养基,使用PBS洗涤3次,充分冲洗以除去多余染液,于488nm激发波长处使
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用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光水平,并摄片。2.7 Westernblot 取对数生长期的细胞以2×106L-1的密度接种于6孔板,分别设置空白组(未处理)、模型组(LPS处理)、加药组(CHR)、实验组(LPS+CHR);继续培育24h后,每孔加入150μL蛋白裂解液(购自中国Beyotime)及蛋白酶抑制剂
PMSF裂解30min,加入150μL2×SDS上样缓冲液,干式恒温器于100℃10min,使用4%浓缩胶,12%分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳,转膜至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭3h,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1h,TBST清洗3次,3min/次,使用Tanonimagingsystem进行成像。
2.8 统计学方法 结果以珋x±s表示。采用Graph padPrism6作图,采用SPSS20 0进行统计学分析,两样本之间比较采用t检验,多组间比较用One wayANOVA法进行显著性检验。
3 结果
3.1 正常软骨细胞形态 倒置相差显微镜下观察正常软骨细胞的形态,新分离的软骨细胞悬浮在液体培养基中呈圆形,原代大鼠关节软骨细胞培养24h,细胞呈椭圆形或梭形,贴壁生长,细胞膜完整光滑,折射率好(Fig1A);原代培养大鼠关节软骨细胞培养8d,细胞呈长梭形、不规则
型或树突状,多呈“铺路石状”,分布密集,甚至与可见的屈光性细胞外基质融合成单层,细胞融合率达80%时进行传代培养,传代细胞具有快速生长和良好的基质分泌能力(Fig1B)。第一代软骨细胞甲苯胺蓝染色,显微镜下观察。结果发现,细胞核呈深蓝色,核仁呈蓝紫色,而软骨细胞质和细胞外基质因其异染性而呈褐红色(Fig1C)。同时,对第一代软骨细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,染色结果表明,由于软骨细胞合成分泌的特异性Ⅱ型胶原被染色,细胞质内有大量可见的棕色颗粒,被染成棕色,证明分离的细胞为软骨细胞(Fig1D)。
3.2 CHR对正常软骨细胞活性的影响 白杨素的化学结构如Fig2A所示。采用CCK 8法检测不同剂量的CHR对正常软骨细胞的毒性作用。正常软骨细胞在不同浓度的CHR(0、5、10、20、40、80mmol·L-1)处理12和24h,在处理12h时,CHR各浓度对细胞活力没有明显影响(P>0 05),见Fig2B;在CHR处理24h后,当CHR浓度≥40mmol·L-1时,细胞活力受到明显抑制(P<0 05),而在CHR浓度为(5、10、20mmol·L-1)对细胞活力无抑制作用,见Fig2C
英文备忘录格式
。
Fig1 Chondrocytemorphologiesofnormalratkneecartilage
observedwithamicroscopeand
identificationofchondrocytes(×200)
A:Primaryratarticularchondrocytesculturedfor24h;B:Primaryratarticularchondrocytesculturedfor8d;C:Toluidinebluestainingforratarticularchondrocytesidentification;D:CollagenⅡimmunocyto chemistrystainingforidentificationofratarticularchondrocytes.
3.3 LPS对正常软骨细胞活力的影响 用不同浓度LPS处理大鼠正常软骨细胞24h后,如Fig3所示,当LPS的浓度为50μg·L-1时对软骨细胞的活力无影响,当LPS浓度为100μg·L-1时可以明显降低软骨细胞的活力(P<0 01),且当LPS的浓度不断增大,大鼠软骨细胞的活力不再继续降低,因此,本实验选择用浓度为100μg·L-1的LPS来诱导大鼠软骨细胞损伤模型(Fig3)。
3.4 CHR处理对LPS诱导的大鼠软骨细胞细胞活性的影响 用CCK 8法检测CHR对LPS诱导的软骨细胞损伤模型中细胞活力。软骨细胞分别用未含有或者含有不同浓度CHR的培养基预处理2h后,再用含有LPS的培养基培养24h。由Fig4显示,与空白组比较,LPS刺激细胞后,细胞活力下降,而在CHR预处理的,细胞活力有所恢复,且在浓度为10mmol·L-1的CHR处理24h时细胞对LPS诱导的软骨细胞损伤的增殖能力最强,CHR组(10mmol·L-1)比LPS(100μg·L-1)组的细胞活力明显增加(P<0 01)。因此,我们选择10mmol·L-1的CHR作为后续实验研究受试药物有效使用浓度。3.5 CHR对软骨细胞活性氧(ROS)的影响 本研究采用DCFH DA探针来检测大鼠软骨细胞内活性氧的水平。DCFH DA能够被细胞内的酯酶水解生成DCFH,细胞内活性氧可以氧化DCFH生成有荧光的DCF,通过检测DCF的荧光强度可以反映细胞内的活性氧水平。实验结果(Fig5)表明,经过
快乐保姆·
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Fig2 Effectsofdifferentconcentrationsofchrysinonchondrocytes(珋x±s,n=3)
A:Chemicalstructureofchrysin;B:Cellviabilityofchondrocytestreatedwithchrysinfor12hours;C:Cellviabilityofchondrocytestreatedwith
chrysinfor24hours
; P<0 05,
P<0 01vscontrolgroup
.Fig3 EffectsofdifferentconcentrationsofLPSonviabilityofnormalchondrocytes
(珋x±s,n=3)
P<0 05,
P<0 01vscontrolgroup
.
Fig4 EffectofCHRtreatmentonactivityofratchondrocytesinducedbyLPS(珋x±s,n=3)
Cellviabilityafterco treatmentwithCHRandLPSfor24hours.
P<0 01vscontrolgroup;##
P<0 01vsLPSgroup.
家长评语10条LPS作用24h后,能够引起大鼠软骨细胞内活性氧水平明显提高,CHR处理后可以明显降低LPS诱导引起的活性氧水平。
3.6 CHR对软骨细胞线粒体膜电位的影响 用罗丹明123染色观察线粒体膜电位,
评估软骨细胞状
Fig5 Changesinreactiveoxygenspecieslevelof
chondrocytes(珋x±s,n=3)
P<0 01vscontrolgroup;##
P<0 01vsLPSgroup.Scalebar:
20μm.
态,可以在高膜电位的细胞中观察到绿色荧光。
LPS(100μg·L-1
)预处理,与Control组比较,LPS
组细胞线粒体膜电位明显下降,其线粒体膜电位低
于Control组。CHR处理组可以恢复LPS处理后线粒体膜电位,与LPS组相比表达出更高的荧光强度,线粒体膜电位明显提高(Fig6)。
3.7 白杨素逆转LPS暴露后对自噬相关蛋白Bec lin 1与LC3B的表达 采用Westernblot法检测白
雅鲁藏布大峡谷
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566·中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021May;37(5)
Fig6 Fluorescenceexpressionofmitochondrialmembrane
potentialofcellsunderdifferenttreatmentconditions(珋x±s,n=3) P<0 01vscontrolgroup;#P<0 05vsLPSgroup.Scalebar:20μm.
杨素浓度为10mmol·L-1时软骨细胞的自噬蛋白的表达水平。Fig7结果显示,与空白组相比,模型组Beclin 1、LC3Ⅱ的含量上升(P<0 5);与模型相比,CHR给药可以明显改善组软骨细胞的自噬水平上升的情况,该差异有统计学意义。结果表明,CHR能抑制Beclin 1、LC3Ⅱ自噬蛋白的表达,进而起到抑制自噬的作用。
3.8 白杨素对软骨细胞PI3K/AKT信号通路的影响 采用Westernblot法检测白杨素对PI3K、AKT、p PI3K、p AKT蛋白表达的影响。结果如Fig8所示,各组细胞总PI3K、AKT的蛋白含量差异无显著性(P>0 05),与Control组相比较LPS组的p PI3K、p AKT蛋白含量升高,差异有显著性(P<0 05);LPS+CHR组与LPS组相比,CHR给药可以明显降低p PI3K、p AKT蛋白含量,差异具有统计学意义(P<0 05)。结果表明,CHR能够抑制p PI3K、p AKT蛋白的表达。
4 讨论
骨关节炎致病过程中伴随着关节肿胀、疼痛和活动性丧失,随着中国人口衰老进程的加快,困扰着