网络出版时间：２０２１－４－２２１７：０７：００ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０４２２．１４１２．０２６．ｈｔｍｌ
白杨素通过ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路抑制ＬＰＳ诱导的软骨细胞自噬
杨 阳１，何 宇２，史于传２，舒见威３，虞 乐３，胡 伟１
（安徽医科大学第二附属医院１．药物临床试验研究中心、２．妇产科，３．麻醉与围术期
医学安徽省普通高校重点实验室，安徽合肥 ２
３０６０１）ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０５．０１３
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０５－０６６２－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８５ ５；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３９２；Ｒ６８４ ３；Ｒ９７７ ６
摘要：目的 探索白杨素对脂多糖诱导的大鼠软骨细胞骨关节炎模型中对软骨细胞自噬的作用及其机制。方法 提取１０只ＳＰＦ级ＳＤ大鼠关节软骨正常细胞进行体外分离培养，通过ＬＰＳ诱导大鼠
软骨细胞自噬。实验分为空白对照组、ＬＰＳ组、白杨素（ＣＨＲ）组和ＬＰＳ＋ＣＨＲ组；ＣＣＫ ８法检测各分组细胞的活性、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３检测各组细胞中线粒体膜电位、ＤＣＦＨ ＤＡ检测各组细胞的活性氧，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞中ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ ＰＩ３Ｋ、ｐ ＡＫＴ、Ｂｅｃｌｉｎ １及ＬＣ３Ⅱ的蛋白表达。结果 白杨素对ＬＰＳ诱导的软骨细胞自噬具有抑制作用，且当白杨素浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
时抑制自噬作用最为显著；白杨素能够抑制ＬＰＳ所致ＬＰＳ诱导的软骨细胞的活性氧（ＲＯＳ）的增加；白杨素抑制了细胞受损后线粒体膜电位的降低；同时白杨素抑制Ｂｅｃｌｉｎ １、ＬＣ３Ⅱ蛋白的表达，抑制ＰＩ３Ｋ和ＡＫＴ的磷酸化。结论 白杨素可能通过抑制ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路，下调自噬蛋白Ｂｅｃｌｉｎ １和ＬＣ３Ⅱ的表达抑制自噬，进而保护软骨细胞。
关键词：白杨素；软骨细胞；脂多糖；自噬；ＲＯＳ；ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
收稿日期：２０２１－０１－１５，修回日期：２０２１－０３－０３基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２０７１５９１）
作者简介：杨 阳（１９９３－），男，硕士生，研究方向：中药药理学，Ｅ
ｍａｉｌ
：ｙｙａｎｇ＿２００８３１６＠１２６．ｃｏｍ；胡 伟（１９７６－），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药药理学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ａｙｄｐｈｄ２００１＠１６３．ｃｏｍ
骨关节炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＯＡ）是一种慢性退行性疾病，被认为２０２０年致残的４个主要因素之一，并
影响着全世界四分之一的中、老年人群［１］
。ＯＡ临
床上主要症状为关节疼痛、僵硬甚至残疾，其病理为进行性关节软骨降解、骨赘形成、软骨下骨重建和滑
膜炎症［２］。ＯＡ的发病机制是多因素和复杂的，受
维持关节损伤发展的信号级联反应激活的影响，在ＯＡ疾病的发展中，已经牵涉到活性氧（ＲＯＳ）和相
关信号通路的改变［３］
。尽管长期以来首先将其归
类为一种主要是非炎症性的关节疾病，其研究重点是生物力学方面和磨损和撕裂的不平衡，但是最新
的免疫学的研究有助于改善对该疾病的解释［４］。
缴费工资脂多糖（
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）也称为内毒素，是革兰氏阴性菌的外膜成分，在组成性产生的外膜小泡中释放，小泡中也含有蛋白质。脂多糖在Ｌ９２９细胞
核和巨噬细胞中诱导自噬［
５］，在Ｘｕｅ等［６］
伊索寓言读书笔记的研究中发现抑制ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ信号通路促进骨关节炎大鼠关节软骨细胞自噬并且减轻了炎症反应。也有研究表明抑制ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路可以改善骨关节
炎的进展［７］
。
白杨素（
ｃｈｒｙｓｉｎ，ＣＨＲ）属于植物类黄酮化合物，它广泛存在于蜂胶、蜂蜜、百香果中，甚至存在于蘑菇和其他植物来源中，抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒的活性，同时已被广泛用于各种退行性疾病的治疗，
因此拥有巨大的经济价值和药用价值［８，９］。有文献
报道，在ＯＡ的过程中伴随着软骨细细胞自噬，但白杨素对Ｏ
Ａ的治疗作用暂未有文献报道，且白杨素对自噬的作用机制尚未阐明，因此本研究旨在探索白杨素对ＬＰＳ诱导软骨细胞自噬的作用和机制。１ 材料
１．１ 药品与主要试剂 白杨素（纯度≥９９ ８％）（货号：ＨＹ １４５８９）：购自ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ公司；脂多糖（货号：ＳＭＢ００６１０）：美国Ｓｉｇｍａ公司；ＤＭＥＭ培养基（货号：１０５６５０１８）：美国Ｇｉｂｃｏ公司；ＣＣＫ ８（货号：ＢＳ３５０Ｂ）：北京兰杰柯科技有限公司；活性氧检测试剂盒（货号：Ｓ００３３Ｓ）、ＲＩＰＡ裂解液（货号：Ｐ００１３Ｃ）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ蛋白上样缓冲液（货号：Ｐ００１５Ａ）、ＢＣＡ测定蛋白浓度试剂盒（货号：Ｐ００１２Ｓ）：上海碧云天生物技术有限公司；β ａｃｔｉｎ一抗（货号：ａｂ８２２６）
、ＰＩ３Ｋ一抗（货号：ａｂ１９１６０６）、ｐ ＰＩ３Ｋ一抗（货号：ａｂ１８２６５１）、ＬＣ３Ｂ一抗（货号：ａｂ１９２８９０）、Ｂｅｃｌｉｎ １一抗（货号：ａｂ２１０４９８）：购于英国Ａｂｃａｍ公司；ＡＫＴ一抗（货号：ＡＦ６２６１）、ｐ ＡＫＴ
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２６６·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｙ；３７（５）：６６２－８
一抗（货号：ＡＦ００１６）：购于美国Ａｆｆｉｎｉｔｙ公司。
１．２ 主要仪器 倒置荧光显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ）；正置荧光显微镜（德国Ｚｅｉｓｓ）；全波长全自动酶标仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ）；ＣＯ
２
培养箱（美国Ｔｈｅｒｍｏ）。
２ 方法
２．１ 大鼠软骨细胞分离、培养和传代 软骨细胞的提取：ＳＰＦ级健康ＳＤ大鼠１０只，♂，４周龄，体质量１１０－１３０ｇ，购自山东省朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号：ＳＣＸＫ（鲁）２０１９０００３，大鼠分别饲养于室温１８℃－２５℃的干燥层流室内，颈椎脱位处死大鼠，将其浸泡于含７５％医用酒精中２０ｍｉｎ。在无菌培养皿中加入含有１％双抗的完全培养基。在无菌条件下将大鼠下肢截取，去除脂肪组织，同时将分离的膝关节留在培养皿上。分离关节软骨，切除关节软骨面和股骨头，获得肱骨头表面软骨。软骨用培养基冲洗３次，然后用眼用剪刀切成１ｍｍ３大小。再加入含０ ２５％ＥＤＴＡ的胰蛋白酶，在３７℃孵箱中消化软骨组织，并轻轻摇晃１次。孵育３０ｍｉｎ后加入新鲜培养基终止消化，后加入０ ２％Ⅱ型胶原酶，３７℃孵育４ｈ，用２００目无菌尼龙网过筛，１８００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ。随后，去掉上清液，加入适量的新鲜培养基制备细胞悬液。细胞接种于２５ｃｍ２
的培养瓶中，３７℃，５％ＣＯ
２
一个星期有几天进行原代培养。隔天更换培养基，倒置显微镜观察细胞生长情况。当细胞融合率达到８０％时进行传代培养。去掉培养瓶中的培养基，用ＰＢＳ洗涤细胞２次，加入含０ ２５％ＥＤ ＴＡ胰蛋白酶１ｍＬ后在显微镜下观察细胞形态。在１８００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ后，去掉上清液，将细胞重新悬浮在新鲜的完全培养基中，使其充分混合。最后，将细胞传代到培养瓶中进行培养。
２．２ 分组 实验分为四组，分别为空白对照组、ＬＰＳ组、白杨素（ＣＨＲ）组和ＬＰＳ＋ＣＨＲ组，其中空白对照组仅加入完全培养基，ＬＰＳ组加入ＬＰＳ，ＣＨＲ组加入白杨素，ＣＨＲ＋ＬＰＳ组加入ＬＰＳ与白杨素。２．３ 大鼠软骨细胞的鉴定
２．３．１ 甲苯胺蓝染色 将大鼠第３代关节软骨细胞接种于有盖玻片（４％多聚赖氨酸处理过）的六孔板中，每孔５×１０４个细胞，２４ｈ后观察细胞贴壁情况，并更换培养液，３ｄ更换１次培养液，倒置显微镜下观察并摄片记录。当细胞铺满盖玻片６０％－７０％时取出盖玻片，用ＰＢＳ漂洗玻片３次，滴加４％多聚甲醛，在室温下固定１ｈ，再用ＰＢＳ缓冲液漂洗玻片３次，加入２％甲苯胺蓝染色液室温放置１ｈ，然后用双蒸水漂洗至蓝色基本消失，晾干后用中性树脂封片，倒置显微镜观察收集图像。２．３．２ 二型胶原免疫组织化学染色 将大鼠第３代关节软骨细胞接种于有盖玻片（４％多聚赖氨酸处理过）的６孔板中，每孔５×１０４个细胞，２４ｈ后用１０％多聚甲醛固定４０ｍｉｎ，用ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。之后添加５０ｍＬ０ １％ＴｒｉｔｏｎＸ １００，并用ＰＢＳ进行漂洗。细胞在室温下用３％Ｈ
２
Ｏ
２
孵育１０ｍｉｎ，用ＰＢＳ进行洗涤３次。去除ＰＢＳ缓冲液后，加入５０ｍＬ５％封闭液室温孵育３０ｍｉｎ，向玻片中加入５０ｍＬ一抗（１∶２００），并在４℃下孵育过夜，然后用ＰＢＳ清洗３次，每次３ｍｉｎ。加入５０ｍＬ的二抗室温孵育３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤。加入１００ｍＬ新制备的二氨基联苯胺（ＤＡＢ）溶液进行显微镜观察。盖玻片用自来水轻轻冲洗，细胞样本用苏木精复染１ｍｉｎ，用自来水冲洗，盖玻片置于分级酒精中脱水。干燥的盖玻片用二甲苯透明处理，并用中性树脂粘合，将制备好的样品用倒置显微镜观察收集图像。２．４ 白杨素剂量的筛选 传代至第二代的软骨细胞在９６孔板（每孔５×１０４个细胞）中培养２４ｈ，加入ＬＰＳ（１００μｇ·Ｌ－１），然后继续在不同浓度的白杨素（０、５、１０、２０、４０、８０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）中分别培养２４ｈ、４８ｈ。在规定的时间，用ＰＢＳ清洗细胞，每孔添加１００μＬＤＭＥＭ，将１０μＬ的ＣＣＫ ８溶液加入每个孔中，并在３７℃培养箱中培养１ｈ。然后使用全自动酶标仪检测，激发波长４５０ｎｍ，重复３次以上实验。２．５ 活性氧ＲＯＳ的检测 取对数生长期的细胞，以２×１０６个·Ｌ－１的密度接种于６孔板，分别设置空白组（未处理）、模型组（ＬＰＳ处理）、加药组（ＣＨＲ）、实验组（ＬＰＳ＋ＣＨＲ），预孵育ＬＰＳ２ｈ，ＣＨＲ处理２４ｈ，按照１∶１０００的比例使用无血清培养基稀释ＤＣＦＨ ＤＡ荧光探针，使ＤＣＦＨ ＤＡ的终浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，每孔加入２ｍＬ稀释的ＤＣＦＨ ＤＡ探针培养基，３７℃细胞培养箱孵育细胞２０ｍｉｎ后，弃去培养液，使用无血清ＤＥＭＥ培养基清洗３次，充分洗涤细胞以除去未进入细胞的游离探针；于４８８ｎｍ激发波长处使用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光水平，并摄片。
电动车选购２．６ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３线粒体膜电位检测 取对数生长期的细胞，以２×１０６个·Ｌ－１的密度接种于６孔板，分别设置空白组（未处理）、模型组（ＬＰＳ处理）、加药组（ＣＨＲ）、实验组（ＬＰＳ＋ＣＨＲ），ＬＰＳ预处理２ｈ，ＣＨＲ处理４８ｈ，按照１∶１０００的比例向每孔中加入１μＬ的Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３染料原液，使Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３的终浓度为１ｍｍｏｌ·Ｌ－１，３７℃细胞培养箱孵育细胞３０ｍｉｎ后，弃尽培养基，使用ＰＢＳ洗涤３次，充分冲洗以除去多余染液，于４８８ｎｍ激发波长处使
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｙ；３７（５）
用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光水平，并摄片。２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 取对数生长期的细胞以２×１０６Ｌ－１的密度接种于６孔板，分别设置空白组（未处理）、模型组（ＬＰＳ处理）、加药组（ＣＨＲ）、实验组（ＬＰＳ＋ＣＨＲ）；继续培育２４ｈ后，每孔加入１５０μＬ蛋白裂解液（购自中国Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）及蛋白酶抑制剂
ＰＭＳＦ裂解３０ｍｉｎ，加入１５０μＬ２×ＳＤＳ上样缓冲液，干式恒温器于１００℃１０ｍｉｎ，使用４％浓缩胶，１２％分离胶进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳，转膜至ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂牛奶封闭３ｈ，一抗４℃孵育过夜，二抗孵育１ｈ，ＴＢＳＴ清洗３次，３ｍｉｎ／次，使用Ｔａｎｏｎｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍ进行成像。
２．８ 统计学方法 结果以珋ｘ±ｓ表示。采用Ｇｒａｐｈ ｐａｄＰｒｉｓｍ６作图，采用ＳＰＳＳ２０ ０进行统计学分析，两样本之间比较采用ｔ检验，多组间比较用Ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ法进行显著性检验。
３ 结果
３．１ 正常软骨细胞形态 倒置相差显微镜下观察正常软骨细胞的形态，新分离的软骨细胞悬浮在液体培养基中呈圆形，原代大鼠关节软骨细胞培养２４ｈ，细胞呈椭圆形或梭形，贴壁生长，细胞膜完整光滑，折射率好（Ｆｉｇ１Ａ）；原代培养大鼠关节软骨细胞培养８ｄ，细胞呈长梭形、不规则
型或树突状，多呈“铺路石状”，分布密集，甚至与可见的屈光性细胞外基质融合成单层，细胞融合率达８０％时进行传代培养，传代细胞具有快速生长和良好的基质分泌能力（Ｆｉｇ１Ｂ）。第一代软骨细胞甲苯胺蓝染色，显微镜下观察。结果发现，细胞核呈深蓝色，核仁呈蓝紫色，而软骨细胞质和细胞外基质因其异染性而呈褐红色（Ｆｉｇ１Ｃ）。同时，对第一代软骨细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，染色结果表明，由于软骨细胞合成分泌的特异性Ⅱ型胶原被染色，细胞质内有大量可见的棕色颗粒，被染成棕色，证明分离的细胞为软骨细胞（Ｆｉｇ１Ｄ）。
３．２ ＣＨＲ对正常软骨细胞活性的影响 白杨素的化学结构如Ｆｉｇ２Ａ所示。采用ＣＣＫ ８法检测不同剂量的ＣＨＲ对正常软骨细胞的毒性作用。正常软骨细胞在不同浓度的ＣＨＲ（０、５、１０、２０、４０、８０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）处理１２和２４ｈ，在处理１２ｈ时，ＣＨＲ各浓度对细胞活力没有明显影响（Ｐ＞０ ０５），见Ｆｉｇ２Ｂ；在ＣＨＲ处理２４ｈ后，当ＣＨＲ浓度≥４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，细胞活力受到明显抑制（Ｐ＜０ ０５），而在ＣＨＲ浓度为（５、１０、２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）对细胞活力无抑制作用，见Ｆｉｇ２Ｃ
英文备忘录格式
。
Ｆｉｇ１ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓｏｆｎｏｒｍａｌｒａｔｋｎｅｅｃａｒｔｉｌａｇｅ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ（×２００）
Ａ：Ｐｒｉｍａｒｙｒａｔａｒｔｉｃｕｌａｒｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２４ｈ；Ｂ：Ｐｒｉｍａｒｙｒａｔａｒｔｉｃｕｌａｒｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ８ｄ；Ｃ：Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｒａｔａｒｔｉｃｕｌａｒｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｄ：ＣｏｌｌａｇｅｎⅡｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｔａｒｔｉｃｕｌａｒｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．
３．３ ＬＰＳ对正常软骨细胞活力的影响 用不同浓度ＬＰＳ处理大鼠正常软骨细胞２４ｈ后，如Ｆｉｇ３所示，当ＬＰＳ的浓度为５０μｇ·Ｌ－１时对软骨细胞的活力无影响，当ＬＰＳ浓度为１００μｇ·Ｌ－１时可以明显降低软骨细胞的活力（Ｐ＜０ ０１），且当ＬＰＳ的浓度不断增大，大鼠软骨细胞的活力不再继续降低，因此，本实验选择用浓度为１００μｇ·Ｌ－１的ＬＰＳ来诱导大鼠软骨细胞损伤模型（Ｆｉｇ３）。
３．４ ＣＨＲ处理对ＬＰＳ诱导的大鼠软骨细胞细胞活性的影响 用ＣＣＫ ８法检测ＣＨＲ对ＬＰＳ诱导的软骨细胞损伤模型中细胞活力。软骨细胞分别用未含有或者含有不同浓度ＣＨＲ的培养基预处理２ｈ后，再用含有ＬＰＳ的培养基培养２４ｈ。由Ｆｉｇ４显示，与空白组比较，ＬＰＳ刺激细胞后，细胞活力下降，而在ＣＨＲ预处理的，细胞活力有所恢复，且在浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＣＨＲ处理２４ｈ时细胞对ＬＰＳ诱导的软骨细胞损伤的增殖能力最强，ＣＨＲ组（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）比ＬＰＳ（１００μｇ·Ｌ－１）组的细胞活力明显增加（Ｐ＜０ ０１）。因此，我们选择１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＣＨＲ作为后续实验研究受试药物有效使用浓度。３．５ ＣＨＲ对软骨细胞活性氧（ＲＯＳ）的影响 本研究采用ＤＣＦＨ ＤＡ探针来检测大鼠软骨细胞内活性氧的水平。ＤＣＦＨ ＤＡ能够被细胞内的酯酶水解生成ＤＣＦＨ，细胞内活性氧可以氧化ＤＣＦＨ生成有荧光的ＤＣＦ，通过检测ＤＣＦ的荧光强度可以反映细胞内的活性氧水平。实验结果（Ｆｉｇ５）表明，经过
快乐保姆·
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｙ；３７（５）
Ｆｉｇ２ Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｈｒｙｓｉｎｏｎｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ａ：Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｈｒｙｓｉｎ；Ｂ：Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｈｒｙｓｉｎｆｏｒ１２ｈｏｕｒｓ；Ｃ：Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ
ｃｈｒｙｓｉｎｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ
； Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
．Ｆｉｇ３ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＬＰＳｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
．
Ｆｉｇ４ ＥｆｆｅｃｔｏｆＣＨＲｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒａｔｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＰＳ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｆｔｅｒｃｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＣＨＲａｎｄＬＰＳｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ．
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓＬＰＳｇｒｏｕｐ．
家长评语10条ＬＰＳ作用２４ｈ后，能够引起大鼠软骨细胞内活性氧水平明显提高，ＣＨＲ处理后可以明显降低ＬＰＳ诱导引起的活性氧水平。
３．６ ＣＨＲ对软骨细胞线粒体膜电位的影响 用罗丹明１２３染色观察线粒体膜电位，
评估软骨细胞状
Ｆｉｇ５ Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌｏｆ
ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓＬＰＳｇｒｏｕｐ．Ｓｃａｌｅｂａｒ：
２０μｍ．
态，可以在高膜电位的细胞中观察到绿色荧光。
ＬＰＳ（１００μｇ·Ｌ－１
）预处理，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，ＬＰＳ
组细胞线粒体膜电位明显下降，其线粒体膜电位低
于Ｃｏｎｔｒｏｌ组。ＣＨＲ处理组可以恢复ＬＰＳ处理后线粒体膜电位，与ＬＰＳ组相比表达出更高的荧光强度，线粒体膜电位明显提高（Ｆｉｇ６）。
３．７ 白杨素逆转ＬＰＳ暴露后对自噬相关蛋白Ｂｅｃ ｌｉｎ １与ＬＣ３Ｂ的表达 采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测白
雅鲁藏布大峡谷
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５６６·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｙ；３７（５）
Ｆｉｇ６ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３） Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５ｖｓＬＰＳｇｒｏｕｐ．Ｓｃａｌｅｂａｒ：２０μｍ．
杨素浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１时软骨细胞的自噬蛋白的表达水平。Ｆｉｇ７结果显示，与空白组相比，模型组Ｂｅｃｌｉｎ １、ＬＣ３Ⅱ的含量上升（Ｐ＜０ ５）；与模型相比，ＣＨＲ给药可以明显改善组软骨细胞的自噬水平上升的情况，该差异有统计学意义。结果表明，ＣＨＲ能抑制Ｂｅｃｌｉｎ １、ＬＣ３Ⅱ自噬蛋白的表达，进而起到抑制自噬的作用。
３．８ 白杨素对软骨细胞ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路的影响 采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测白杨素对ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ ＰＩ３Ｋ、ｐ ＡＫＴ蛋白表达的影响。结果如Ｆｉｇ８所示，各组细胞总ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ的蛋白含量差异无显著性（Ｐ＞０ ０５），与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比较ＬＰＳ组的ｐ ＰＩ３Ｋ、ｐ ＡＫＴ蛋白含量升高，差异有显著性（Ｐ＜０ ０５）；ＬＰＳ＋ＣＨＲ组与ＬＰＳ组相比，ＣＨＲ给药可以明显降低ｐ ＰＩ３Ｋ、ｐ ＡＫＴ蛋白含量，差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０５）。结果表明，ＣＨＲ能够抑制ｐ ＰＩ３Ｋ、ｐ ＡＫＴ蛋白的表达。
４ 讨论
骨关节炎致病过程中伴随着关节肿胀、疼痛和活动性丧失，随着中国人口衰老进程的加快，困扰着
