网络出版时间：２０２２－１２－０９１８：３０：２８ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２８．０１７．ｈｔｍｌ
葡萄籽原花青素低聚体抑制Ａ１型星形胶质细胞极化机制
王 青１，杨智超１，董艺薇１，苑舒文１，李彦青１，宋丽娟１，黄建军２，马存根１
，３（１．山西中医药大学神经生物学研究中心，国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西晋中 ０３０６１９；
２．国药同煤总医院神经外科／山西省卫健委神经疾病防治研究重点实验室，山西大同０３７００３；
３．山西大同大学脑科学研究所，山西大同 ０３７００９）
收稿日期：２０２２－０８－１０，修回日期：２０２２－１０－１０
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ８１９０３５９６）；山西高校科技创
新项目（Ｎｏ２０１９Ｌ０７２１，２０１９Ｌ０７２８）；山西省卫健委医学科技领军团队（
Ｎｏ２０２０ＴＤ０５）；基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室项目（Ｎｏ２０２１０５Ｄ１２１０１１）；山西中医药大学培育项目（
Ｎｏ２０１９ＰＹ１３０，２０２０ＰＹ ＪＣ １４）；山西中医药大学学科建设经费（Ｎｏ０３０２００１１７）
作者简介：王 青（
１９８３－），女，博士，副教授，研究方向：神经免疫和神经保护，Ｅ ｍａｉｌ：４０２４７７１４５６＠１６３．ｃｏｍ；
马存根（
１９６０－），男，博士，教授，研究方向：中西医结合防治神经炎性变性疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｍａｃｕｎｇｅｎ＠ｓｘ ｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０３０１４
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００７７－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８５ ５；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３６４ ５；Ｒ７４４ ５摘要：目的 星形胶质细胞
（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ＡＳ）是脑内最丰富的神经胶质细胞，可对中枢神经系统（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）损伤迅速作出反应，极化为不同的表型。葡萄籽原花青素低聚体（ｇｒａｐｅｓｅｅｄｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ，ＧＳＰｓ）可抑制ＣＰＺ小鼠髓鞘脱失，并致病灶区ＡＳ富集，所以本研究探索ＧＳＰｓ靶向ＡＳ的作用机制。方法 以体外ＴＮＦ α、ＩＬ １α和Ｃ１ｑ诱导的Ａ１型ＡＳ模型为研究对象，采用ＲＴ ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等方法检测ＧＳＰｓ对ＡＳ的表型及其分泌的细胞因子的影响，并对其机制进行初步探讨。结果 ＧＳＰｓ减少Ａ１型ＡＳ的标记Ｃ３ｄ和Ｃ１ｑ的表达，并抑制ＪＮＫ的磷酸化。而且，与模型组相比，ＧＳＰｓ可明显抑制促炎因子ＩＬ ６、ＩＬ １α、ＩＬ １７和Ｈ２Ｏ２的释放，促进抗炎因子ＴＧＦ β和神经营养因子ＣＮＴＦ的分泌。结论 ＧＳＰｓ可抑制ＡＳ向Ａ１型极化，改善炎性微环境，其机制与抑制ＪＮＫ的磷酸化有关。关键词：星形胶质细胞；ＧＳＰｓ；Ａ１型；ＪＮＫ；炎症因子；神经营养因子
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
中枢神经炎性脱髓鞘疾病是一类以炎性反应和广泛原发性髓鞘脱失为主要特征的疾病。其中复发
－缓解型的多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）、视神经脊髓炎谱系疾病（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓｏｐｔｉｃａｓｐｅｃｔｒｕｍｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ＮＭＯＳＤ）
是我国最常见的脱髓鞘疾病，病程通常表现为复发－缓解交替进行，多次发作造成神经功能不可逆的损伤，是中青年非创伤性致残的
主要原因之一［１－２］几岁断奶最好
考研分数怎么算。长期以来，减少髓鞘的炎性免
疫损伤是治疗的重要靶点，但尚未取得理想的疗效。
星形胶质细胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ＡＳ）是中枢神经系统（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）最丰富的胶质细胞，以连续和基本不重叠的方式整齐有序地覆盖整个ＣＮＳ，可通过参与髓鞘形成、维护血脑屏障、调节突触功能和调节能量代谢以维持ＣＮＳ的稳态。一旦中枢受损，ＡＳ迅速作出反应，大量反应性ＡＳ增生，并借由本身的功能和表型的转化对周围的神经元和胶质细胞产生有益或有害的影响。如Ｎ
ＭＯＳＤ、ＭＳ及其动物模型－实验性变态反应性脑脊髓炎（ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）和双环己酮草酰二腙（ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ，ＣＰＺ）诱导的脱髓鞘模
型中均存在着的数量众多的反应性ＡＳ［３－４］，可通过
释放多种抑制性因子如硫酸角质素蛋白聚糖、少突
胶质细胞髓鞘蛋白和髓鞘相关蛋白，以及炎性因子如肿瘤坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α，ＴＮＦ α）、白介素 １α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １α，ＩＬ １α
）和补体１ｑ（ｃｏｍ ｐｌｅｍｅｎｔ１ｑ，Ｃ１ｑ）等损伤神经元和髓鞘细胞［３，５］。而靶向ＡＳ可明显缓解髓鞘脱失，如Ｄａｌａｈｍａｈ等［６］发
现半乳糖凝集素 ３（ｇａｌｅｃｔｉｎ ３，Ｇａｌ ３）可通过促进ＡＳ的增殖和炎性反应加重少突胶质细胞的损伤。因此，随着对反应性ＡＳ功能及其作用机制的深入研究，它已逐渐成为保护和促进髓鞘再生的一类重要潜在靶细胞。
葡萄籽原花青素低聚体（
ｇｒａｐｅｓｅｅｄｐｒｏａｎｔｈｏｃｙ ａｎｉｄｉｎｓ，ＧＳＰｓ）是最为安全有效的抗氧化剂之一，具有抗炎、抗恶性肿瘤、免疫调节、抗衰老和神经保护等药理作用，被广泛应用于食品、化妆品、药品和保
健品等领域［７－９］。基于其优良的抗炎作用，我们前
期探索了ＧＳＰｓ对ＣＰＺ脱髓鞘小鼠的治疗作用，发
·７
７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）：７７～８３
现ＧＳＰｓ可显著缓解ＣＰＺ诱导的髓鞘脱失，减少中枢炎性因子的分泌［１０］，同时诱导胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）阳性的ＡＳ在病灶区的富集，说明ＧＳＰｓ可能通过ＡＳ发挥神经保护作用。因此，本研究以体外原代ＡＳ为研究对象，初步探讨了ＧＳＰｓ靶向ＡＳ的作用机制。
１ 材料与方法
１．１ 原代星形胶质细胞的培养 将新出生２－７ｄ的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，用冰低温麻醉２～１０ｍｉｎ后，用７５的乙醇对幼鼠的头部和颈部进行消毒后进行断头处理。将大脑取出后，置于冰浴的高糖ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１１９９５０４０）中，在体视显微镜下仔细剥离脑膜，用灭菌后的眼科剪将脑组织剪成１ｍｍ３的碎片。将组织碎片置于０ ２５％胰蛋白酶ＥＤＴＡ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中，温和摇动培养１０ｍｉｎ后，添加完全培养液中止胰蛋白酶反应。完全培养液是含有１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ。消化的组织以３００×ｇ×５ｍｉｎ离心，小心地去除上清液，并重悬于高糖ＤＭＥＭ中，通过４０μｍ的ｎｙｌｏｎ膜将组织分离成单细
胞悬液。获得的单细胞悬液接种于Ｔ７５培养瓶中，以获得原代混合胶质细胞。培养瓶提前用１００ｍｇ·Ｌ－１的多聚赖氨酸（分子量为１５～３０万）包被后在４℃过夜，用ＰＢＳ洗涤３次并在使用前干燥。原代混合胶质细胞培养２ｄ后更换新鲜的完全培养液，此后每３ｄ更换１次培养液，通常７～１１ｄ混合胶质细胞会铺满培养瓶底。将长满的培养瓶放置于摇床以１８０ｒ·ｍｉｎ－１的转速摇动２４ｈ以去除小胶质细胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ，ＭＧ）。然后加入新鲜的ＡＳ培养基（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，１８０１），并以２４０ｒ·ｍｉｎ－１的转速摇动６ｈ以去除少突胶质细胞前体细胞（ｏｌｉｇｏ ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＯＰＣｓ）。剩下的细胞在实验前差速贴壁３０ｍｉｎ，进一步纯化ＡＳ。
１．２ 免疫荧光染色法 待细胞融合度达到８０％左右时，移除培养液，ＰＢＳ洗涤３次后，室温４％多聚甲醛固定１０ｍｉｎ，０ ３％的ＴｒｉｔｏｎＸ １００通透１０ｍｉｎ。牛血清白蛋白工作液室温封闭后，加入抗ＧＦＡＰ抗体（ＣＳＴ，１２３８９），４℃孵育过夜。加入ＦＩＴＣ标记的二抗，避光室温孵育１ ５ｈ。ＤＡＰＩ避光孵育染核２０ｍｉｎ，滴加抗荧光淬灭封片液（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｐ３６９７０），封片后使用荧光显微镜检测（Ｌｅｉｃａ，ＤＭ４０００８）。１．３ 细胞活力检测实验 原代ＡＳ进行实验之前，免疫荧光法染色ＡＳ标记物胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）进行纯度检测，其阳性率超过９５％。将原代ＡＳ接种于９６孔板，培养２４ｈ后，分别用不同浓度（０、２ ５、５、１０、２０、３０和５０ｍｇ·Ｌ－１）的ＧＳＰｓ孵育２４ｈ。乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）法：将９６孔板以３００×
ｇ离心５ｍｉｎ，每孔吸取上清液置于另一平底９６孔板，按照ＬＤＨ检测试剂盒（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，ＢＣ０６８５）说明书检测各组上清液中ＬＤＨ的含量。ＭＴＴ法：将ＭＴＴ工作液（５ｍｇ·Ｌ－１）加到９６孔板，每孔加入１０μＬ，在ＣＯ２培养箱里孵育４ｈ，弃去培养液，每孔加入１００μＬ的ＤＭＳＯ，溶解后在４９０ｎｍ处检测其光密度ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）值。
１．４ ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ自由基清除实验 ＤＰＰＨ实验：分别将１０μＬ的空白提取液、阳性标准品溶液和不同浓度的ＧＳＰｓ（０、２ ５、５、１０、２０和３０ｍｇ·Ｌ－１）加入到１９０μＬ的ＤＰＰＨ工作液中，室温避光孵育３０ｍｉｎ，在最大吸收峰５１５ｎｍ处检测吸光度（ＯＤ）值，计算清除率／％＝（Ａ
空白
－Ａ
测定
）／Ａ
守业更比创业难空白
×１００％。
ＡＢＴＳ实验：空白组：将２４μＬ的ｄｄＨ
２
Ｏ加入到１８０μＬ的ＡＢＴＳ混合液中；ＧＳＰｓ组和阳性对照组维生素Ｃ（ＶｉｔａｍｉｎＣ，Ｖｃ）：分别将６μＬ的阳性标准品溶液和不同浓度的ＧＳＰｓ加入到１８０μＬ的ＡＢＴＳ混合液和１８μｌ蒸馏水中，反应１０ｍｉｎ后，于最大吸收峰
５９３ｎｍ处测定吸光度值，计算清除率／％＝（Ａ
空白
－
Ａ
测定
轩的成语）／Ａ
空白
×１００％。
１．５ Ａ１型反应性星形胶质细胞模型的建立、药物干预和细胞因子检测 原代ＡＳ用３μｇ·Ｌ－１的ＩＬ １α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３１５ ０１Ａ）、３０μｇ·Ｌ－１的ＴＮＦ α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，２１５ １１Ａ）和４００μｇ·Ｌ－１的Ｃ１ｑ（Ｍｙ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，ＭＢＳ１４３１０５）孵育２４ｈ，建立Ａ１型ＡＳ。３０μｇ·Ｌ－１的ＧＳＰｓ（购自沐凡生物科技有限公司）加入上述的模型中，孵育２４ｈ以干预ＡＳ的极化。实验分组为正常组（Ｎｏｒ）、Ａ１型ＡＳ组（Ｍｏｄｅｌ）和ＧＳＰｓ干预组（ＧＳＰｓ）。２４ｈ后更换新鲜的ＡＳ培养液，收集上清采用ＥＬＩＳＡ法检测相关的细胞因子。使用Ｒ＆Ｄ公司的夹心ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＴＮＦ α、ＩＬ １α、ＩＬ ６、ＩＬ １７和转化生长因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ β，ＴＧＦ β）等细胞因子。使用凡科维公司ＥＬＩＳＡ试剂盒检测睫状神经营养因子（Ｃｉｌｉａｒｙ
ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＣＮＴＦ）、Ｈ
２
Ｏ
２
和ＲＯＳ等因子。细胞因子单位为ｎｇ·Ｌ－１。
１．６ ＲＴ ＰＣＲ法 ＰＢＳ洗涤细胞２次后，收集各组的原代ＡＳ，使用ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ＋（ＴａＫａＲａ，９１０８）从细胞中提取总ＲＮＡ。将提取的总ＲＮＡ用Ｐｒｉｍｅ ＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＴａＫａＲａ，６１１０Ａ）逆转录为第一链ｃＤＮＡ。使用ＴＢＧｒｅｅｎ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＲＯＸｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ，ＲＲ４２ＬＲ）和ＣＦＸ９６ＯｐｔｉｃｓＭｏｄｕｌｅ荧光定量ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ Ｒａｄ）进行定量ＰＣＲ扩增。引物序列参考已经发表的文献，
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
由上海ＢｉｏＴＮＴ公司合成［１１－１２］。采用２－ΔΔ
Ｃｔ法计算ｍＲＮＡ表达量。Ｔａｂ１是使用的引物序列。
Ｔａｂ１ ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒＲＴ ＰＣＲ
ＰｒｉｍｅｒＦｏｒｗａｒｄｓｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ ３′）Ｒｅｖｅｒｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ ３′）
１８ｓＡＴＧＡＴＧＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＳｐｈｋ１ＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＣＡＧＣＡＴＡＧＴＧＳ１００Ａ１０ＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＰＴＸ３ＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡＴＮｒｆ２ＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＣ１ｑＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＨ２ Ｔ２３ＧＧＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＡＧＣＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＣＡＴＭＸ１ＴＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣＦＢＧＡＧＣＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧ
Ｃ３ｄＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣ
ＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧ
ＡＧＡＣＧＣ１．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法 移除培养液，用ＰＢＳ洗涤细胞两次以去除杂质。然后将各组细胞用ＲＩＰＡ裂解液（Ｓｉｇｍａ，Ｒ０２７８）在冰上裂解１ｈ后，在４℃、
１３０００ｒ·ｍｉｎ－１
离心２０ｍｉｎ。在ＲＩＰＡ蛋白裂解液
中添加混合的蛋白酶抑制剂（Ｔｈｅｒｍｏ，８７７８６）防止蛋白质降解。蛋白质浓度通过ＢＣＡ蛋白质测定法测定。通过ＳＤＳ ＰＡＧＥ分离等量的蛋白质（３０μｇ）并半干转到ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）。用５％脱脂奶粉封闭后，分别用抗Ｃ３ｄ抗体（ＣＳＴ，９７４２５）、抗ｃ Ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ ＪｕｎＮ ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）ＪＮＫ抗体（ＡＢｃａｍ，ａｂ１９９３８０）、抗Ｐ ＪＮＫ抗体（ＡＢ ｃａｍ，ａｂ２７８６１６）和抗ＧＡＰＤＨ（ＡＢｃａｍ，ａｂ９４８４）在４℃孵育过夜。ＴＢＳＴ洗涤３次后，用种属对应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育２ｈ。洗涤后，使用增强型化学发光（ＥＣＬ）系统（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）可视化蛋白条带。
１．８ 统计学方法 各组数据以均数±标准差描述，采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ ０软件（ＧｒａｐｈＰａｄｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）进行统计分析。单因素方差分析（ＡＮＯ ＶＡ）后，两两比较采用Ｔｕｋｅｙ′ｓｐｏｓｔ ｈｏｃｔｅｓｔ，单一比
我心向阳什么意思较通过未配对ｔ检验评估。２ 结果
２．１ ＧＳＰｓ对原代星形胶质细胞活力的影响 不同浓度的ＧＳＰｓ干预２４ｈ后，分别采用ＬＤＨ法和ＭＴＴ法检测了药物对原代ＡＳ毒性和细胞增殖的影响。结果表明低、中浓度的（２ ５、５、１０、２０和３０ｍｇ·
Ｌ－１
）ＧＳＰｓ对原代ＡＳ没有细胞毒性，也不影响细胞的增殖，但高浓度（３５、４０和５０ｍｇ·Ｌ－１）对细胞有
明显的细胞毒性（Ｆｉｇ１Ａ），且抑制细胞的增殖（Ｆｉｇ
１Ｂ
）。这表明ＧＳＰｓ的给药浓度在３０ｍｇ·Ｌ－１
之内对原代ＡＳ的活力没有影响，为后续实验药物浓度的确定提供了依据。
２．２ ＧＳＰｓ在体外氧自由基清除实验 为了确定ＧＳＰｓ的最优给药浓度，检测了ＧＳＰｓ的抗氧化作用，基于细胞活力实验结果，ＧＳＰｓ的最大给药浓度为３５
ｍｇ·Ｌ－１。与Ｖｃ组相比，ＧＳＰｓ在体外对ＤＰＰＨ和
ＡＢＴＳ自由基具有强大的清除作用，且具有浓度依
赖性，且在３０ｍｇ·Ｌ－１
时清除率分别达到９５％和
９２％（Ｆｉｇ２）。因此，将ＧＳＰｓ的给药浓度确定为３０
ｍｇ·Ｌ－１。
２．３ ＧＳＰｓ对原代ＡＳ极化的影响 为了研究ＧＳＰｓ对ＡＳ极化的影响，从新生小鼠中提取分离原代ＡＳ，并使用免疫荧光法测定ＡＳ特异性标记物ＧＦＡＰ。如Ｆｉｇ３Ａ所示，绝大多数细胞呈ＧＦＡＰ阳性，显绿色荧光。ＤＡＰＩ染核，胞核呈蓝色，为总细胞数。用ＩＬ １α、ＴＮＦ α和Ｃ１ｑ孵育原代ＡＳ，发现Ａ１型标记Ｃ３ｄ和Ｃ１ｑ在基因水平明显增加（Ｆｉｇ３Ｂ）。进一步对蛋白水平进行了检测，发现与正常组相比，模型组Ｃ３ｄ和Ｃ１ｑ的表达明显升高（Ｆｉｇ３Ｃ、３Ｄ），表明Ａ１型ＡＳ模型成功建立。为了探索ＧＳＰｓ对
ＡＳ极化作用，用３０ｍｇ·Ｌ－１的ＧＳＰｓ干预Ａ１型ＡＳ
的极化，发现药物可显著降低Ｃ３ｄ和Ｃ１ｑ的表达（Ｆｉｇ４Ａ、４Ｂ），抑制其向Ａ１
型极化。
Ｆｉｇ１ ＬｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＧＳＰｓｈａｄｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｉｍａｒｙＡＳ
ＬＤＨａｓｓａｙａｎｄＭＴＴａｓｓａｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＧＳＰｓｔｏｐｒｉｍａｒｙＡＳ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓ０ｍｇ·Ｌ
－１·
９７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
Ｆｉｇ２ ＧＳＰｓｈａｄａｓｔｒｏｎｇｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎＤＰＰＨａｎｄＡＢＴＳｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｉｎｖｉｔｒｏｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ
Ｐ＜０ ０１ｖｓＶｃ
．
Ｆｉｇ３ ＧＳＰｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡＳｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｔｏｔｙｐｅＡ１
Ａ：ＧＦＡＰ＋ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｓｔａｉｎｉｎｇｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｐｒｉｍａｒｙＡＳ；Ｂ：ＴｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｒｋｅｒｓｉｎＡ１ａｎｄ
Ａ２ＡＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ ＰＣＲａｓｓａｙ；Ｃ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ３ｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡ１ｍａｒｋｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ；Ｄ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ１ｑｐｒｏｔｅｉｎｏｆ
Ａ１ｍａｒｋｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ． Ｐ＜
０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮｏｒ
．Ｆｉｇ４ ＧＳＰｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡＳｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｔｏｔｙｐｅＡ１
Ａ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ３ｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡ１ｍａｒｋｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ；Ｂ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ１ｑｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡ１ｍａｒｋｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．
Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌ．
２．４ ＧＳＰｓ对Ａ１型ＡＳ分泌的细胞因子的影响 研究表明，Ａ１型ＡＳ可通过分泌细胞因子发挥作
用。因此，我们检测了ＧＳＰｓ（３０ｍｇ·Ｌ－１）对其分泌
的细胞因子的影响。发现Ｇ
ＳＰｓ明显抑制促炎因子ＴＮＦ α、ＩＬ １α和Ｉ
Ｌ ６的分泌（Ｆｉｇ５Ａ），减少氧化应激因子Ｈ２Ｏ２的表达（Ｆｉｇ５Ｂ），促进抑炎因子ＴＧＦ β和神经营养因子ＣＮＴＦ（Ｆｉｇ５Ｃ）的分泌。
２．５ ＧＳＰｓ对Ａ１型星形胶质细胞ＪＮＫ的影响 研究表明，ＩＬ １α、ＴＮＦ α和Ｃ１ｑ激活的ＡＳ中ＪＮＫ信号通路被激活，与ＡＳ的炎症反应有关，因此，接
·０
８·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
Ｆｉｇ５ ＧＳＰｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓａｎｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓＡ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＳＰｓｏｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＴＮＦ α，ＩＬ １α，ＩＬ ６ａｎｄＩＬ １７ｉｎＡＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ；Ｂ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＳＰｓｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨ２Ｏ２ａｎｄＲＯＳｉｎＡＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ；Ｃ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＳＰｓｏｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＴＧＦ βａｎｄＣＮＴＦｉｎＡＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌ．
下来检测了ＧＳＰｓ对ＪＮＫ的影响，发现ＧＳＰｓ明显下
调了ＡＳ中ＪＮＫ的磷酸化水平（Ｆｉｇ６）
。
Ｆｉｇ６ ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＪＮＫｉｎＡＳｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙ
ＧＳＰｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌ．
３ 讨论
神经炎性脱髓鞘疾病中，大量的反应性ＡＳ增
殖，虽然其作用机制尚不清楚，但Ｂａｒｒｅｓ等［１３］根据
其表型和功能的变化，发现神经炎症和缺血诱导了
两种不同类型的反应性ＡＳ，并将其命名为Ａ１型和
Ａ２型。Ａ１型ＡＳ大量存在于阿尔茨海默病、帕金森
病、肌萎缩侧索硬化症和ＭＳ中［３，１４］，并丧失了促进
培训总监神经元存活、突触重塑和吞噬的能力，同时分泌诸多
神经毒性因子损伤神经元和髓鞘结构。如在ＥＡＥ
模型中，Ａ１型可以通过高表达乳糖神经酰胺，促进
髓鞘脱失和加重中枢炎症的效应［５］。与之相反，Ａ２
型则上调了许多神经营养因子的表达，促进ＣＮＳ受
损组织的恢复和修复。如Ａ２型可分泌ＣＸＣＬ８、ＣＸ
ＣＬ１和ＣＸＣＬ１０等趋化因子募集ＯＰＣｓ至脱髓鞘部
位、高表达基质金属蛋白酶 １（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １，
ＴＩＭＰ １）和脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕ
ｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）促进髓鞘再生［１３，１５］。因此，
抑制Ａ１型或诱导Ａ２型反应性ＡＳ可能对疾病产生
有益的影响。本研究采用促炎因子Ｃ１ｑ、ＴＮＦ α和
ＩＬ １α诱导高表达Ｃ３ｄ的Ａ１型ＡＳ，而ＧＳＰｓ可明显
抑制Ｃ３ｄ的表达，表明ＧＳＰｓ可能通过抑制Ａ１型
ＡＳ缓解髓鞘脱失。
研究发现，属于丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ
ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）的ＪＮＫ信号通路，可
以参与ＡＳ的激活［１６］。我们的实验证明了Ｃ１ｑ、
ＴＮＦ α和ＩＬ １α诱导的Ａ１型ＡＳ中存在ＪＮＫ磷酸
化的明显增加，提示ＪＮＫ信号通路的活化可能与ＡＳ
的极化有关。而ＧＳＰｓ是原花青素低聚体的混合
物，包括儿茶素、表儿茶素和原花青素Ｂ２等有效成
分，采用网络药理学的方法预测其作用靶点，发现
ＧＳＰｓ抑制中枢神经氧化应激和炎性因子的机制可
能与ＪＮＫ的磷酸化有关［１７］。本研究发现ＧＳＰｓ能够
降低Ａ１型ＡＳ中ＪＮＫ的磷酸化，抑制ＡＳ向Ａ１型
极化，说明减少ＪＮＫ的磷酸化ＧＳＰｓ影响ＡＳ极化的
靶点，为进一步研究ＧＳＰｓ的作用机制奠定了基础。
反应性ＡＳ的表型是动态变化的，其极化趋势
主要取决于微环境的不同刺激。如Ｂａｒｒｅｓ等报道异
常活化的ＭＧ可通过分泌Ｃ１ｑ、ＴＮＦ α和ＩＬ １α作用
于ＡＳ，并诱导其向Ａ１型极化。Ａ１型ＡＳ通过分泌
ＩＬ １α、ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １７和Ｃ１ｑ等促炎因子及
Ｈ
２
Ｏ
２
和ＲＯＳ等氧化应激因子攻击和损伤神经组织
的同时，还可以反作用于Ａ１型ＡＳ加重和促进继发
性炎症反应。如ＩＬ １７与其受体结合，可激活ＡＳ下
游的核因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒκＢ，ＮＦ κＢ），导致促炎因
子的产生。而抗炎因子如ＩＬ ４、ＩＬ １０和ＴＧＦ β等，
可以逆转Ａ１型ＡＳ，激活ＡＳ的神经保护作用，诱导
其向Ａ２型极化［１８］。如ＴＧＦ β信号能介导ＮＦ κＢ
高中成语积累的抑制，从而缓解中风后的神经炎症。因此，有目的
性地改变反应性ＡＳ的微环境，有利于获得具有神
经保护作用的表型。为了研究ＧＳＰｓ抑制Ａ１型ＡＳ
极化的作用机制，我们进一步检测了体系中相关的
炎性因子、氧化应激因子、抗炎因子和神经营养因
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
