网络出版时间：２０２２－１２－０９１７：３２：３５ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２８．０２２．ｈｔｍｌ
丹参酮ⅡＡ通过调节线粒体转位蛋白诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡
张 谊１，欧玉龙１，王惠霞１，黄晓佳２
（１．南通大学附属丹阳医院江苏省丹阳市人民医院，江苏丹阳 ２１２３００；２．常州大学生物医学工程与健康科学研究院，江苏常州 ２１３１６４）
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０１０４９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－０１０１－０７中国图书分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ３２９．２４；Ｒ３２９．２５；Ｒ３４１；Ｒ７３５．７摘要：目的 探讨丹参酮ⅡＡ（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ，ＴａｎⅡＡ）通过调节线粒体转位蛋白（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＳＰＯ）诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡中的作用及可能存在的作用机制。方法 采用ＭＴＴ比色法检测ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响，ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＰＥ／７ 氨基－放线菌素Ｄ双染色法和Ｈｏｃｈｅｓｔ染色法观察细胞凋亡率，荧光素酶发光法检测ＨｅｐＧ２
细胞中ＡＴＰ的含量，Ｃｌａｒｋ氧电极法测定细胞耗氧率，ＪＣ １荧光探针法检测细胞线粒体膜电位变化，免疫荧光染色法观察转位蛋白在细胞内的表达及定位，免疫印迹法检测线粒体内细胞色素Ｃ
、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 ３以及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶
９的表达。结果 ＴａｎⅡＡ能够剂量依赖性地抑制肝癌细胞Ｈ
ｅｐＧ２增殖，诱导细胞凋亡、ＡＴＰ生成减少、耗氧量降低以及线粒体膜电位的下降。同时，ＴａｎⅡＡ可诱导ＨｅｐＧ２细胞ＴＳＰＯ表达上调并聚集于核内。结论 ＴａｎⅡＡ可诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡，其机制与促进细胞转位蛋白ＴＳＰＯ表达及细胞核转位，进而引起线粒体功能障碍有关。
关键词：丹参酮ⅡＡ；ＨｅｐＧ２细胞；细胞凋亡；转位蛋白；线粒体；细胞能量代谢
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
收稿日期：２０２２－０８－１８，修回日期：２０２２－１０－２２
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１３０００５９）；镇江市社会
发展指导性项目（ＮｏＦＺ２０１９００５）；镇江“金山英才”高层次领才培养计划（第六期“１６９工程”）
作者简介：张 谊（１９９０－），女，硕士，研究方向：中药药理学，Ｅ
ｍａｉｌ
：ｚｈａｎｇｙｉｕｊｓ＠１６３．ｃｏｍ；黄晓佳（１９８０－），男，博士，副教授，研究方向：神经药理学，通信作者，
Ｅ ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｘｊ＠ｃｃｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 原发性肝细胞癌（ｈｅｐａｔｉｃｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都
非常高。Ｈ
ＣＣ的发病是由多种因素及多个步骤共同演变而来的繁杂过程，同时也受到内外环境的双
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重影响，但其病因及确切的分子机制尚未清楚［１］
。
临床上常采用手术切除、化疗、放疗等手段进行肿瘤治疗，但由于耐药和不良反应，大部分ＨＣＣ治疗药物效果不佳，因此，寻找更有效的抗ＨＣＣ药物迫在
眉睫［２］。
丹参酮ⅡＡ（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ，ＴａｎⅡＡ）是中草药丹参的主要有效活性成分之一，具有多方面的药理活性，如ＴａｎⅡＡ对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒性作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖活力，诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞内相关ＤＮＡ合成、阻滞细胞周期过渡、激活凋亡基因以及上调原癌基
因的表达水平等有关［
３－４］。近年来［５－６］
，丹参酮调控线粒体功能也屡有报道，认为丹参酮ⅡＡ可引起细胞线粒体膜透性转运孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉ ｔｙｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐｏｒｅ，ＭＰＴＰ）开放，释放大量活性氧，降低跨膜电位，从而诱导细胞凋亡。
ＭＰＴＰ是与线粒体凋亡途径有关的重要结构，由线粒体外膜的电压依从性阴离子通道、内膜的腺苷酸转运蛋白以及转位分子蛋白（
ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒｐｒｏ ｔｅｉｎ，ＴＳＰＯ）等共同构成［７］
。ＴＳＰＯ调节离子通道的开放，在线粒体凋亡过程中起着关键作用［８］。但目
前有关转位蛋白Ｔ
ＳＰＯ及线粒体途径在ＴａｎⅡＡ诱导肝癌细胞凋亡中的研究较少，本实验选用人肝癌
细胞ＨｅｐＧ２作为实验对象，观察ＴａｎⅡＡ对肿瘤细胞Ｈ
ｅｐＧ２的作用及相关线粒体凋亡途径的调控，探讨其可能存在的作用机制，为肝癌的预防和治疗提供新的分子靶标和实验支持，为未来临床应用提供理论依据和新思路。１ 材料与方法
１．１ 材料 人肝癌细胞ＨｅｐＧ２（中国科学院上海细胞库）；ＴａｎⅡＡ（质量分数≥９８％）（中国药品生物制品检定所，批号１１０７６６ ２００６１９）；ＤＭＥＭ培养基、胰蛋白酶（美国Ｇｉｂｃｏ公司，货号１２１０００４６、２５２００ ０５６）；新生牛血清（杭州四季青，货号２２０１１
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１０１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）：１０１～７
８６１２／２２０１１ ８６１５）；荧光素酶 ＡＴＰ检测试剂盒（南
通碧云天，货号Ｓ００２６）；ＪＣ １试剂盒（美国ＢＤ公司，货号５５１３０２）；ＡｎｎｅｘｉｎＶＰＥ／７ 氨基－放线菌素Ｄ细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号ＣＡ１０３０）；噻唑蓝ＭＴＴ（美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司，货号０７９３）；兔抗ＴＳＰＯ多克隆抗体（美国ＣＳＴ公司，货号７０３５８Ｓ）；兔抗线粒体内细胞色素Ｃ（ｍｉｔｏｃｈｏｎ ｄｒｉａｌｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，ＣｙｔｏＣ）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 ３（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３，ｃａｓｐａｓｅ ３）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 ９（ｃｙｓ ｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９，ｃａｓｐａｓｅ ９）多克隆抗体（美国Ａｂｃａｍ公司，货号ａｂ１３３５０４、ａｂ３２３５１、ａｂ３２５３９）；鼠抗甘油醛 ３ 磷酸脱氢酶（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅ ｈｙｄｅ ３ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）单克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，货号ｓｃ ４７７２４）；超敏显影液ＥＣＬ（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，货号ＷＢＫｌＳ０１００）。其余未注明试剂均为国产分析纯。
１．２ 仪器 超净台（苏州净化设备总厂）；ＣＯ
２
细胞培养箱（上海ＨｅａｌＦｏｒｃｅ公司）；倒置显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）；超纯水机
（成都超纯科技有限公司）；电子分析天平（德国赛多利斯公司）；酶标仪、电泳仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）；凝胶成像系统（南京麦高德生物科技公司）；冷冻离心机（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）；荧光显微镜（德国ＣａｒｌＺｅｉｓｓ公司）；超声波粉碎机（新芝生物科技公司）；流式细胞仪（美国ＢＤ公司）。
１．３ 方法
１．３．１ 细胞培养及药物处理 将ＨｅｐＧ２细胞培养于含１０％新生牛血清、１×１０５Ｕ·Ｌ－１青霉素和１００ｍｇ·Ｌ－１链霉素的高糖ＤＭＥＭ中，然后置于含５％
ＣＯ
２
和９５％空气的培养箱中，待单层细胞生长至８０％后传代。实验用细胞均处于指数生长期。１．３．２ ＭＴＴ比色法检测细胞存活率 将细胞按５×１０７Ｌ－１密度接种于９６孔板中，加入不同浓度的ＴａｎⅡＡ，使其终浓度分别为２．５、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１，对照组中加入相应体积的溶剂。
药物处理结束后，在每孔中加入ＭＴＴ（终浓度为０．５ｇ·Ｌ－１），３７℃下反应４ｈ，弃去培
养液，在每孔加入１００μＬＤＭＳＯ，待完全溶解后，于４９０ｎｍ处测定各孔吸光度。按公式：细胞增殖抑制率／％＝（１－处理组ＯＤ值／对照组ＯＤ值）×１００％，计算抑制率。
１．３．３ 细胞形态学检测 用终浓度为２．５、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ后，将培养皿置于普通光学倒置显微镜下，记录细胞形态和变化并拍照。
１．３．４ 细胞凋亡检测 药物作用２４ｈ后，加入Ｈｏ ｅｃｈｓｔ３３３４２染色液于室温下反应５ｍｉｎ，用荧光酶标仪检测荧光强度，在倒置显微镜下观察细胞的核变化，并计算细胞核凋亡小体的数量。
同时，将细胞离心重悬于１００μＬ的缓冲液中，分别加入５μＬＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＰＥ和７ 氨基－放线菌素Ｄ荧光染料，避光孵育１５ｍｉｎ，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
１．３．５ 荧光素酶发光法检测ＡＴＰ的生成 加入ＡＴＰ裂解液进行细胞裂解，收集细胞裂解液，置于冷冻离心机中离心１０ｍｉｎ，取上清液，加入１００μＬ／孔的ＡＴＰ检测试剂，常温下反应２～３ｍｉｎ后放于化学发光酶标仪上检测细胞荧光强度，同时测定各组ＡＴＰ浓度和蛋白含量，计算每毫克蛋白中ＡＴＰ的量。
墨索里尼总是有理１．３．６ Ｃｌａｒｋ氧电极法检测细胞耗氧率 将细胞悬液收集于离心管中，在３７℃记录每组如何提高学习
细胞的耗氧率［ｎｍｏｌ·（ｍｉｎ·ｍＬ）－１］的变化。根据各组细胞耗氧率和细胞密度分别计算细胞耗氧率［ｎｍｏｌＯ
２
·（ｍｉｎ·１０４细胞）－１］。
１．３．７ ＪＣ １染色检测线粒体膜电位 以每孔４×１０３个密度将细胞接种于２４孔培养板中，药物处理２４ｈ结束后，加入２．５ｍｇ·Ｌ－１的ＪＣ １染色工作液，３７℃负载探针４０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤２次后，倒置荧光显微镜观察并拍照，同时用荧光酶标仪检测和记录线粒膜电位的变化。
１．３．８ 细胞内ＴＳＰＯ的表达定位检测 将ＨｅｐＧ２细胞接种于放置玻璃片的培养皿中，用冰甲醇固定细胞，０ ３％ＴｒｉｔｏｎＸ １００透化，羊血清封闭半小时后，滴加抗ＴＳＰＯ抗体（１∶３００），４℃摇床反应过夜；后加入Ｃｙ３标记的二抗（１∶６００）常温下避光反应１ｈ，加入Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染液于室温下染色１０ｍｉｎ，置荧光显微镜下观察。
１．３．９ 细胞ＴＳＰＯ、ＣｙｔｏＣ、ｃａｓｐａｓｅ ３、ｃａｓｐａｓｅ ９蛋白的表达检测 ＨｅｐＧ２细胞经不同浓度ＴａｎⅡＡ处理２４ｈ后，收集细胞，提取总蛋白并测定蛋白浓度。各组
按比例以３０μｇ总蛋白上样，电泳分离后转膜，脱脂奶粉封闭后加入ＴＳＰＯ（１∶１０００）、ＣｙｔｏＣ（１∶１０００）、ｃａｓｐａｓｅ ３（１∶１０００）、ｃａｓｐａｓｅ ９（１∶１０００）和ＧＡＰＤＨ（１∶７０００）抗体，于４℃反应过夜。ＰＢＳ洗涤后，将膜和对应的二抗（１∶５０００）在常温下孵育１ｈ，洗涤后加入显影剂并在凝胶成像系统下进行
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
拍照，以ＩｍａｇｅＪ软件分析各条带灰度值。以ＧＡＰ ＤＨ条带灰度值作参照，进行半定量分析。１．３．１０ 统计学处理 数据均以珋ｘ±ｓ表示，应用ＳＰＳＳ１６ ０统计软件进行分析，多组间均数采用单因素方差分析，两组间比较用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ检验法。
２ 结果
２．１ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞形态及增殖的影响 如Ｆｉｇ１Ａ所示，对照组中ＨｅｐＧ２细胞形态完整且饱满，２ ５μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理２４ｈ后，ＨｅｐＧ２细胞数量减少，并开始出现死亡；而１０μｍｏｌ·Ｌ－１ＴａｎⅡＡ处理过的ＨｅｐＧ２细胞形态发生明显变化，细胞胞体皱缩成圆形，细胞数量明显减少。
以终浓度为２ ５、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ作用于ＨｅｐＧ２细胞１２ｈ、２４ｈ和４８ｈ后，如Ｆｉｇ１Ｂ所示，２ ５μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ即能引起细胞损伤，１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ抑制率达到７０ ２６％，说明ＴａｎⅡＡ可抑制ＨｅｐＧ２细胞的增殖，并且具有时间－浓度梯度依赖性。经计算，不同浓度的ＴａｎⅡＡ作用ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ，引起细胞损伤的的ＩＣ
５０
为（５ ８±１ ８３）μｍｏｌ·Ｌ－１。
２．２ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞凋亡的影响 Ｈｏ ｅｃｈｓｔ３３３４２是一种常用于检测细胞凋亡的荧光染料。细胞膜在正常情况下常保持完整性，荧光染料极少能透过细胞膜，因此只能产生微弱的蓝色荧光；而当细胞发生凋亡时，细胞膜的通透性会随之增强，从而进入膜内里的荧光染料逐渐增多，因此凋亡细胞的荧光强度要比正常细胞明显。如Ｆｉｇ２Ａ所示，不同浓度的ＴａｎⅡＡ处
理细胞２４ｈ后，对照组中的ＨｅｐＧ２细胞核凋亡小体较少，呈现出相对较弱的蓝色荧光，５μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ导致ＨｅｐＧ２细胞的胞核皱缩碎裂，出现较多凋亡小体，蓝色荧光加强；而１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ则导致大量细胞出现凋亡，蓝色荧光进一步增强。
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以ＴａｎⅡＡ处理ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ后，将细胞以ＡｎｎｅｘｉｎＶＰＥ／７ 氨基放线菌染色，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果如Ｆｉｇ２Ｃ所示，对照组细胞凋亡率为（０ ８８±０ ８３）％，终浓度为２ ５、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理后，细胞凋亡率分别为（５ ３４±２ ３８）％、（２０ ８５±５ ４０）％和（４７ ０４±３ １１）％，表明ＴａｎⅡＡ可诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡，且呈浓度依赖性。
２．３ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞ＡＴＰ含量及耗氧率的影响 荧光素－荧光素酶法检测细胞中ＡＴＰ的含量，结果如Ｆｉｇ３Ａ所示，与对照组相比，２ ５～１
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Ｆｉｇ１ ＴｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈａｎｄ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ（ｎ＝５）
Ａ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｅｓａｎｄｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ２４ｈ．ＳｃａｌｅＢａｒ＝２０μｍ；Ｂ：ＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ
１２ｈ，２４ｈ，４８ｈ，ｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅ ｄｕｃｅｄ， Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌＧｒｏｕｐ．
μｍｏｌ·Ｌ－１浓度ＴａｎⅡＡ能明显降低ＨｅｐＧ２细胞中的ＡＴＰ水平；用Ｃｌａｒｋ氧电极检测各组ＨｅｐＧ２细胞的耗氧率。结果如Ｆｉｇ３Ｂ所示，与空白对照组相比，ＴａｎⅡＡ（５～１０μｍｏｌ·Ｌ－１）作用于ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ后，细胞耗氧率明显降低，且随着ＴａｎⅡＡ浓度的增加，ＨｅｐＧ２细胞耗氧率不断降低。
２．４ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞线粒体膜电位的影响 ＪＣ １染色法检测结果如Ｆｉｇ４所示，对照组ＪＣ １呈聚合体形式存在于细胞中，表明细胞的线粒体膜电位比较高。当不同终浓度的ＴａｎⅡＡ作用于ＨｅｐＧ２细胞后，图中ＪＣ １的红色荧光逐渐减弱，绿色荧光随ＪＣ １的单体增多而逐渐增强，说明细胞线粒体膜电位的降低呈剂量依赖性；从定量结果中分析发现，各浓度ＴａｎⅡＡ处理后，细胞中线粒体膜电
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
赛德克
三月诗句
Ｆｉｇ２ ＴａｎⅡＡｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４）
ＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ２４ｈ，ｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａ：Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａ ｔｉｖｅｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｓｈｏｗｉｎｇｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ．Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２０μｍ；Ｂ：Ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｒａｔｉｏｏｆｃｏｎｄｅｎｓｅｄｎｕｃｌｅｉｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓ；Ｃ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄｏｔｐｌｏｔｓｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｔｈｅＴａｎⅡＡ ｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｌａｂｅｌｌｉｎｇｗｉｔｈａｎｎｅｘｉｎＶ ＰＥａｎｄ７ ａｍｉｎｏ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ；Ｄ：Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔ
ｏｔｉｃｒａｔｉｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
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Ｆｉｇ３ ＴａｎⅡＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡＴＰｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｏｘｙｇｅｎｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｒａｔｅｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ（ｎ＝５）
ＡｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ２４ｈ，ｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡＴＰｌｅｖｅｌｓａｎｄｏｘｙｇｅｎｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ａ：ＴａｎⅡＡｒｅｄｕｃｅｄＡＴＰｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ；Ｂ：ＴｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｏｘｙｇｅｎｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＴａｎⅡＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
如何创建文件夹
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Ｆｉｇ４ ＴａｎⅡＡｄｅｃｒｅａｓｅｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４）
ＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ２４ｈ，ｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍ ｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｒａｔｉｏ（Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ）ｗａｓｒｅｄｕｃｅｄ．Ｓｃａｌｅｂａｒ＝５０μｍ．
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．
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４０１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
Ｆｉｇ５ ＴａｎⅡＡｉｎｄｕｃｅｄｎｕｃｌｅｉｃＴＳＰＯｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ
ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄｉｎｄｕｃｅｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＳＰＯｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｉａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＴａｎⅡＡｆｏｒ２４ｈ．
Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ．
位也随之下降，尤其１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理后线粒体膜电位下降明显。
２．５ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞ＴＳＰＯ表达的影响 免疫荧光染色可准确检测ＴＳＰＯ在细胞内的表达位置。如Ｆｉｇ５所示，在正常细胞中，ＴＳＰＯ几乎不表达；２ ５～５μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ后，细胞内ＴＳＰＯ出现表达；经１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＴａｎⅡＡ处理后，细胞核内ＴＳＰＯ的表达明显增加，表明ＴａｎⅡＡ可诱导ＨｅｐＧ２细胞ＴＳＰＯ的表达，并且使ＴＳＰＯ进入细胞核内。
２．６ ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞ＴＳＰＯ、ＣｙｔｏＣ、ｃａｓｐａｓｅ ３、ｃａｓｐａｓｅ ９蛋白表达的作用 采用免疫印迹法检测ＴａｎⅡＡ对ＨｅｐＧ２细胞中ＴＳＰＯ、ＣｙｔｏＣ、ｃａｓｐａｓｅ ３、ｃａｓｐａｓｅ ９的蛋白表达。如Ｆｉｇ６所示，与对照组相比，ＨｅｐＧ２细胞经不同浓度（２ ５～１０μｍｏｌ·Ｌ－１）ＴａｎⅡＡ处理后，细胞内ＴＳＰＯ、ＣｙｔｏＣ、ｃａｓｐａｓｅ ３以及ｃａｓｐａｓｅ ９蛋白的表达水平随ＴａｎⅡＡ剂量的增加而明显上调。
３ 讨论
中药提取物ＴａｎⅡＡ是从丹参中提取的脂溶性菲醌类化合物，具有多种药理学作用，如ＴａｎⅡＡ
可保护肝脏损伤，抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡［９－１０］。本研究结果显示，ＴａｎⅡＡ（２ ５～１０μｍｏｌ·Ｌ－１）对ＨｅｐＧ２细胞有增殖抑制作用，并呈时间－剂量依赖性。同时，ＴａｎⅡＡ作用于ＨｅｐＧ２细胞２４ｈ后，细胞形态缩小，细胞发生核皱缩，流式细胞仪检测也表明ＴａｎⅡＡ可诱导细胞出现凋亡性死亡。
细胞凋亡是一种复杂的生化过程，主要经外源性和内源性两种途径发生，外源性途径常由细胞表面的死亡引发，而内源性途径则与线粒体相关。通常认为后者是细胞凋亡主要的途径［１１］。线粒体功能障碍引起细胞膜电位下降，继而引发线粒体通透性转换孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐｏｒｅ，ｍＰＴＰ）开口，使ＣｙｔｏＣ从线粒体释放到胞质中，促
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）制造英语
