网络出版时间:2022-12-0917:32:35 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail//34.1086.R.20221209.1428.022.html
丹参酮ⅡA通过调节线粒体转位蛋白诱导HepG2细胞凋亡
张 谊1,欧玉龙1,王惠霞1,黄晓佳2
(1.南通大学附属丹阳医院江苏省丹阳市人民医院,江苏丹阳 212300;2.常州大学生物医学工程与健康科学研究院,江苏常州 213164)
doi:10.12360/CPB202201049
文献标志码:A文章编号:1001-1978(2023)01-0101-07中国图书分类号:R284.1;R329.24;R329.25;R341;R735.7摘要:目的 探讨丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,TanⅡA)通过调节线粒体转位蛋白(translocatorprotein,TSPO)诱导HepG2细胞凋亡中的作用及可能存在的作用机制。方法 采用MTT比色法检测TanⅡA对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV PE/7 氨基-放线菌素D双染色法和Hochest染色法观察细胞凋亡率,荧光素酶发光法检测HepG2
细胞中ATP的含量,Clark氧电极法测定细胞耗氧率,JC 1荧光探针法检测细胞线粒体膜电位变化,免疫荧光染色法观察转位蛋白在细胞内的表达及定位,免疫印迹法检测线粒体内细胞色素C
、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 3以及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶
9的表达。结果 TanⅡA能够剂量依赖性地抑制肝癌细胞H
epG2增殖,诱导细胞凋亡、ATP生成减少、耗氧量降低以及线粒体膜电位的下降。同时,TanⅡA可诱导HepG2细胞TSPO表达上调并聚集于核内。结论 TanⅡA可诱导HepG2细胞凋亡,其机制与促进细胞转位蛋白TSPO表达及细胞核转位,进而引起线粒体功能障碍有关。
关键词:丹参酮ⅡA;HepG2细胞;细胞凋亡;转位蛋白;线粒体;细胞能量代谢
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
收稿日期:2022-08-18,修回日期:2022-10-22
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No81300059);镇江市社会
发展指导性项目(NoFZ2019005);镇江“金山英才”高层次领才培养计划(第六期“169工程”)
作者简介:张 谊(1990-),女,硕士,研究方向:中药药理学,E
mail
:zhangyiujs@163.com;黄晓佳(1980-),男,博士,副教授,研究方向:神经药理学,通信作者,
E mail:huangxj@cczu.edu.cn 原发性肝细胞癌(hepaticcellcarcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都
非常高。H
CC的发病是由多种因素及多个步骤共同演变而来的繁杂过程,同时也受到内外环境的双
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重影响,但其病因及确切的分子机制尚未清楚[1]
。
临床上常采用手术切除、化疗、放疗等手段进行肿瘤治疗,但由于耐药和不良反应,大部分HCC治疗药物效果不佳,因此,寻找更有效的抗HCC药物迫在
眉睫[2]。
丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,TanⅡA)是中草药丹参的主要有效活性成分之一,具有多方面的药理活性,如TanⅡA对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒性作用,能够抑制肿瘤细胞的增殖活力,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制细胞内相关DNA合成、阻滞细胞周期过渡、激活凋亡基因以及上调原癌基
因的表达水平等有关[
3-4]。近年来[5-6]
,丹参酮调控线粒体功能也屡有报道,认为丹参酮ⅡA可引起细胞线粒体膜透性转运孔(mitochondrialpermeabili tytransitionpore,MPTP)开放,释放大量活性氧,降低跨膜电位,从而诱导细胞凋亡。
MPTP是与线粒体凋亡途径有关的重要结构,由线粒体外膜的电压依从性阴离子通道、内膜的腺苷酸转运蛋白以及转位分子蛋白(
translocatorpro tein,TSPO)等共同构成[7]
。TSPO调节离子通道的开放,在线粒体凋亡过程中起着关键作用[8]。但目
前有关转位蛋白T
SPO及线粒体途径在TanⅡA诱导肝癌细胞凋亡中的研究较少,本实验选用人肝癌
细胞HepG2作为实验对象,观察TanⅡA对肿瘤细胞H
epG2的作用及相关线粒体凋亡途径的调控,探讨其可能存在的作用机制,为肝癌的预防和治疗提供新的分子靶标和实验支持,为未来临床应用提供理论依据和新思路。1 材料与方法
1.1 材料 人肝癌细胞HepG2(中国科学院上海细胞库);TanⅡA(质量分数≥98%)(中国药品生物制品检定所,批号110766 200619);DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司,货号12100046、25200 056);新生牛血清(杭州四季青,货号22011
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8612/22011 8615);荧光素酶 ATP检测试剂盒(南
通碧云天,货号S0026);JC 1试剂盒(美国BD公司,货号551302);AnnexinVPE/7 氨基-放线菌素D细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号CA1030);噻唑蓝MTT(美国Amresco公司,货号0793);兔抗TSPO多克隆抗体(美国CST公司,货号70358S);兔抗线粒体内细胞色素C(mitochon drialcytochromeC,CytoC)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 3(cysteinylaspartatespecificproteinase 3,caspase 3)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 9(cys teinylaspartatespecificproteinase 9,caspase 9)多克隆抗体(美国Abcam公司,货号ab133504、ab32351、ab32539);鼠抗甘油醛 3 磷酸脱氢酶(glyceralde hyde 3 phosphatedehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体(美国SantaCruz公司,货号sc 47724);超敏显影液ECL(美国Millipore公司,货号WBKlS0100)。其余未注明试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器 超净台(苏州净化设备总厂);CO
2
细胞培养箱(上海HealForce公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);超纯水机
(成都超纯科技有限公司);电子分析天平(德国赛多利斯公司);酶标仪、电泳仪(美国Bio Rad公司);凝胶成像系统(南京麦高德生物科技公司);冷冻离心机(美国ThermoFisher公司);荧光显微镜(德国CarlZeiss公司);超声波粉碎机(新芝生物科技公司);流式细胞仪(美国BD公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及药物处理 将HepG2细胞培养于含10%新生牛血清、1×105U·L-1青霉素和100mg·L-1链霉素的高糖DMEM中,然后置于含5%
CO
2
和95%空气的培养箱中,待单层细胞生长至80%后传代。实验用细胞均处于指数生长期。1.3.2 MTT比色法检测细胞存活率 将细胞按5×107L-1密度接种于96孔板中,加入不同浓度的TanⅡA,使其终浓度分别为2.5、5、10μmol·L-1,对照组中加入相应体积的溶剂。
药物处理结束后,在每孔中加入MTT(终浓度为0.5g·L-1),37℃下反应4h,弃去培
养液,在每孔加入100μLDMSO,待完全溶解后,于490nm处测定各孔吸光度。按公式:细胞增殖抑制率/%=(1-处理组OD值/对照组OD值)×100%,计算抑制率。
1.3.3 细胞形态学检测 用终浓度为2.5、5、10μmol·L-1的TanⅡA处理HepG2细胞24h后,将培养皿置于普通光学倒置显微镜下,记录细胞形态和变化并拍照。
1.3.4 细胞凋亡检测 药物作用24h后,加入Ho echst33342染色液于室温下反应5min,用荧光酶标仪检测荧光强度,在倒置显微镜下观察细胞的核变化,并计算细胞核凋亡小体的数量。
同时,将细胞离心重悬于100μL的缓冲液中,分别加入5μLAnnexin V PE和7 氨基-放线菌素D荧光染料,避光孵育15min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3.5 荧光素酶发光法检测ATP的生成 加入ATP裂解液进行细胞裂解,收集细胞裂解液,置于冷冻离心机中离心10min,取上清液,加入100μL/孔的ATP检测试剂,常温下反应2~3min后放于化学发光酶标仪上检测细胞荧光强度,同时测定各组ATP浓度和蛋白含量,计算每毫克蛋白中ATP的量。
墨索里尼总是有理1.3.6 Clark氧电极法检测细胞耗氧率 将细胞悬液收集于离心管中,在37℃记录每组如何提高学习
细胞的耗氧率[nmol·(min·mL)-1]的变化。根据各组细胞耗氧率和细胞密度分别计算细胞耗氧率[nmolO
2
·(min·104细胞)-1]。
1.3.7 JC 1染色检测线粒体膜电位 以每孔4×103个密度将细胞接种于24孔培养板中,药物处理24h结束后,加入2.5mg·L-1的JC 1染色工作液,37℃负载探针40min,PBS洗涤2次后,倒置荧光显微镜观察并拍照,同时用荧光酶标仪检测和记录线粒膜电位的变化。
1.3.8 细胞内TSPO的表达定位检测 将HepG2细胞接种于放置玻璃片的培养皿中,用冰甲醇固定细胞,0 3%TritonX 100透化,羊血清封闭半小时后,滴加抗TSPO抗体(1∶300),4℃摇床反应过夜;后加入Cy3标记的二抗(1∶600)常温下避光反应1h,加入Hoechst33258染液于室温下染色10min,置荧光显微镜下观察。
1.3.9 细胞TSPO、CytoC、caspase 3、caspase 9蛋白的表达检测 HepG2细胞经不同浓度TanⅡA处理24h后,收集细胞,提取总蛋白并测定蛋白浓度。各组
按比例以30μg总蛋白上样,电泳分离后转膜,脱脂奶粉封闭后加入TSPO(1∶1000)、CytoC(1∶1000)、caspase 3(1∶1000)、caspase 9(1∶1000)和GAPDH(1∶7000)抗体,于4℃反应过夜。PBS洗涤后,将膜和对应的二抗(1∶5000)在常温下孵育1h,洗涤后加入显影剂并在凝胶成像系统下进行
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拍照,以ImageJ软件分析各条带灰度值。以GAP DH条带灰度值作参照,进行半定量分析。1.3.10 统计学处理 数据均以珋x±s表示,应用SPSS16 0统计软件进行分析,多组间均数采用单因素方差分析,两组间比较用Bonferroni检验法。
2 结果
2.1 TanⅡA对HepG2细胞形态及增殖的影响 如Fig1A所示,对照组中HepG2细胞形态完整且饱满,2 5μmol·L-1的TanⅡA处理24h后,HepG2细胞数量减少,并开始出现死亡;而10μmol·L-1TanⅡA处理过的HepG2细胞形态发生明显变化,细胞胞体皱缩成圆形,细胞数量明显减少。
以终浓度为2 5、5、10μmol·L-1的TanⅡA作用于HepG2细胞12h、24h和48h后,如Fig1B所示,2 5μmol·L-1的TanⅡA即能引起细胞损伤,10μmol·L-1的TanⅡA抑制率达到70 26%,说明TanⅡA可抑制HepG2细胞的增殖,并且具有时间-浓度梯度依赖性。经计算,不同浓度的TanⅡA作用HepG2细胞24h,引起细胞损伤的的IC
50
为(5 8±1 83)μmol·L-1。
2.2 TanⅡA对HepG2细胞凋亡的影响 Ho echst33342是一种常用于检测细胞凋亡的荧光染料。细胞膜在正常情况下常保持完整性,荧光染料极少能透过细胞膜,因此只能产生微弱的蓝色荧光;而当细胞发生凋亡时,细胞膜的通透性会随之增强,从而进入膜内里的荧光染料逐渐增多,因此凋亡细胞的荧光强度要比正常细胞明显。如Fig2A所示,不同浓度的TanⅡA处
理细胞24h后,对照组中的HepG2细胞核凋亡小体较少,呈现出相对较弱的蓝色荧光,5μmol·L-1的TanⅡA导致HepG2细胞的胞核皱缩碎裂,出现较多凋亡小体,蓝色荧光加强;而10μmol·L-1的TanⅡA则导致大量细胞出现凋亡,蓝色荧光进一步增强。
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以TanⅡA处理HepG2细胞24h后,将细胞以AnnexinVPE/7 氨基放线菌染色,经流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果如Fig2C所示,对照组细胞凋亡率为(0 88±0 83)%,终浓度为2 5、5、10μmol·L-1的TanⅡA处理后,细胞凋亡率分别为(5 34±2 38)%、(20 85±5 40)%和(47 04±3 11)%,表明TanⅡA可诱导HepG2细胞凋亡,且呈浓度依赖性。
2.3 TanⅡA对HepG2细胞ATP含量及耗氧率的影响 荧光素-荧光素酶法检测细胞中ATP的含量,结果如Fig3A所示,与对照组相比,2 5~1
0
Fig1 TreatmentwithTanⅡAinducedcelldeathand
morphologicalchangesofHepG2cells(n=5)
A:RepresentativemicrographsshowedthatHepG2cellsexhibiteddecreasedcellularprocessesandcellviabilityafterthetreatmentwithTanⅡAfor24h.ScaleBar=20μm;B:AfterthetreatmentwithTanⅡAfor
12h,24h,48h,theviabilityofHepG2cellswassignificantlyre duced, P<0 05, P<0 01vscontrolGroup.
μmol·L-1浓度TanⅡA能明显降低HepG2细胞中的ATP水平;用Clark氧电极检测各组HepG2细胞的耗氧率。结果如Fig3B所示,与空白对照组相比,TanⅡA(5~10μmol·L-1)作用于HepG2细胞24h后,细胞耗氧率明显降低,且随着TanⅡA浓度的增加,HepG2细胞耗氧率不断降低。
2.4 TanⅡA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响 JC 1染色法检测结果如Fig4所示,对照组JC 1呈聚合体形式存在于细胞中,表明细胞的线粒体膜电位比较高。当不同终浓度的TanⅡA作用于HepG2细胞后,图中JC 1的红色荧光逐渐减弱,绿色荧光随JC 1的单体增多而逐渐增强,说明细胞线粒体膜电位的降低呈剂量依赖性;从定量结果中分析发现,各浓度TanⅡA处理后,细胞中线粒体膜电
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Fig2 TanⅡAinducedcellapoptosisinHepG2cells(n=4)
AfterthetreatmentwithTanⅡAfor24h,theHepG2cellapoptosiswasdeterminedbyHoechst33342stainingandflowcytometry.A:Representa tivemicrographsshowingcellapoptosisinHepG2cells.Scalebar=20μm;B:Theincreasedratioofcondensednucleiofthecells;C:RepresentativeflowcytometrydotplotsshowingtheinductionofcellapoptosisintheTanⅡA treatedcellsafterlabellingwithannexinV PEand7 amino actinomycinD;D:Thequantificationofapopt
oticratiodeterminedbyflowcytometry. P<0 05, P<0 01vsControlgroup
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Fig3 TanⅡAinhibitedATPproductionanddecreased
oxygenconsumptionrateinHepG2cells(n=5)
AfterchallengewithTanⅡAfor24h,theintracellularATPlevelsandoxygenconsumptionrateofthecellsweredetermined.A:TanⅡAreducedATPproductioninaconcentration dependentmanner;B:ThedecreasedoxygenconsumptionrateofthecellsafterTanⅡAtreatment.
P<0 05,
P<0 01vsControlgroup
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Fig4 TanⅡAdecreasedmitochondrialmembranepotentialinHepG2cells(n=4)
AfterthetreatmentwithTanⅡAfor24h,themitochondrialmem branepotentialoftheHepG2cellssignificantlydecreased.Thefluores cenceintensityratio(Red/Green)wasreduced.Scalebar=50μm.
P<0 01vsControlgroup.
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Fig5 TanⅡAinducednucleicTSPOexpressioninHepG2cells
HepG2cellsexhibitedinducedaccumulationofTSPOinthenucleiafterthetreatmentwithTanⅡAfor24h.
Scalebar=100μm.
位也随之下降,尤其10μmol·L-1的TanⅡA处理后线粒体膜电位下降明显。
2.5 TanⅡA对HepG2细胞TSPO表达的影响 免疫荧光染色可准确检测TSPO在细胞内的表达位置。如Fig5所示,在正常细胞中,TSPO几乎不表达;2 5~5μmol·L-1的TanⅡA处理HepG2细胞24h后,细胞内TSPO出现表达;经10μmol·L-1的TanⅡA处理后,细胞核内TSPO的表达明显增加,表明TanⅡA可诱导HepG2细胞TSPO的表达,并且使TSPO进入细胞核内。
2.6 TanⅡA对HepG2细胞TSPO、CytoC、caspase 3、caspase 9蛋白表达的作用 采用免疫印迹法检测TanⅡA对HepG2细胞中TSPO、CytoC、caspase 3、caspase 9的蛋白表达。如Fig6所示,与对照组相比,HepG2细胞经不同浓度(2 5~10μmol·L-1)TanⅡA处理后,细胞内TSPO、CytoC、caspase 3以及caspase 9蛋白的表达水平随TanⅡA剂量的增加而明显上调。
3 讨论
中药提取物TanⅡA是从丹参中提取的脂溶性菲醌类化合物,具有多种药理学作用,如TanⅡA
可保护肝脏损伤,抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡[9-10]。本研究结果显示,TanⅡA(2 5~10μmol·L-1)对HepG2细胞有增殖抑制作用,并呈时间-剂量依赖性。同时,TanⅡA作用于HepG2细胞24h后,细胞形态缩小,细胞发生核皱缩,流式细胞仪检测也表明TanⅡA可诱导细胞出现凋亡性死亡。
细胞凋亡是一种复杂的生化过程,主要经外源性和内源性两种途径发生,外源性途径常由细胞表面的死亡引发,而内源性途径则与线粒体相关。通常认为后者是细胞凋亡主要的途径[11]。线粒体功能障碍引起细胞膜电位下降,继而引发线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mPTP)开口,使CytoC从线粒体释放到胞质中,促
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