自然发酵腐乳中细菌多样性评价
李娜; 崔梦君; 马佳佳; 余海忠; 张振东; 郭壮; 赵慧君
【期刊名称】《《食品研究与开发》》
【年(卷),期】2019(040)016
【总页数】7页(P165-171)
【关键词】腐乳; 变性梯度凝胶电泳; Miq高通量测序; 细菌多样性; 乳酸菌
【作 者】李娜; 崔梦君; 马佳佳; 余海忠; 张振东; 郭壮; 赵慧君
【作者单位】湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所 湖北襄阳441053; 恩施市公共检验检测中心 湖北恩施445000
【正文语种】中 文
腐乳，又称豆腐乳，是一种中国传统的大豆发酵食品，也是由微生物作用的代表性豆制品[1]。
根据加工方式不同，腐乳可分为细菌型腐乳、霉菌型腐乳、酶法发酵以及自然发酵腐乳[2]。在腐乳自然发酵过程中，由于制作环境和人工因素等的影响，导致其蕴含的微生物的种类丰富多样，从而使腐乳具有别样风味。众多学者对腐乳中微生物群落构成进行了研究，其中程永强等[3]在低温发酵腐乳中发现1 株嗜低温的毛霉——黄色毛霉（Mucor flavus），同时姚翔等[4]在益阳自然发酵腐乳中分离出总状毛霉（Mucor racemosus）和鲁氏毛霉（Mucor roxianus），而鲁菲等[5]在青方腐乳中分离出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和短小奇异菌，然而关于湖北地区腐乳微生物多样性的研究较少。
变性梯度凝胶电泳（polymera chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术是一种可以对微生物的群落结构及遗传多样性进行连续分析的技术[6]，同时具有重复性好、检测结果可靠以及应用范围广等优点[7]，目前应用于葡萄酒[8]、香肠[9]和奶酪[10]等领域。Illumina Miq 高通量测序技术可以从宏基因组层面对样品中的微生物多样性进行全方位且客观的分析评价，同时克服了传统微生物学手段耗时长、工作量大等缺点[11]，广泛应用于研究肠道菌群[12]、发酵食品[13]以及环境检测[14]等方面。
大气磅礴的诗句
本试验以恩施地区自然发酵腐乳为研究对象，利用PCR-DGGE 结合Illumina Miq 高通量测序技术相结合的手段对腐乳中的微生物群落组成及多样性进行解析，同时利用传统微生物学方法分离鉴定腐乳中的乳酸菌。通过本研究的开展，可促进腐乳产业化生产，为大豆发酵食品领域提供一个重要的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品：采购于恩施市菜市场。
传发三羟甲基氨基甲烷（分析纯）、乙酸（分析纯），乙二胺四乙酸（分析纯）、丙烯酰胺（分析纯）、甲叉双丙烯酰胺（分析纯）、去离子甲酰胺（分析纯）、（分析纯）、过硫酸铵（分析纯）、四甲基乙二（分析纯）、乙醇（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、甲醛（分析纯）、硝酸银（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、MRS 合成培养基：国药集团化学试剂有限公司；D5625-01 DNA 提取试剂盒、DNA marker、PCR 清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；2xPCR mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP m
ix、pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司；正向引物338F（加入7 个核苷酸标签barcodes）和反向引物806R、PCR 引物合成和测序：武汉天一辉远生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
VeritiTM 96-well thermal cycler PCR 仪、NanoDrop 2000/2000c：美国 Thermo Fisher 公司；DCodeTM System：美国Bio Red 公司；DYY-12 电泳仪：北京六一仪器厂；Miq PE300 高通量测序平台：美国Illumina 公司；R920 机架式服务器：美国 DELL 公司；CT15RE 冷冻离心机：日本HITACHI 公司；Bio-5000 plus 扫描仪：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250 厌氧工作站：英国DWS 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品宏基因组提取与检测
采用试剂盒方法提取腐乳样品中的宏基因组，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，测定各样品宏基因组DNA 浓度。
1.3.2 PCR-DGGE
将宏基因组DNA 浓度调整为一致后作为模板细菌16S rRNA V3 区域基因片段PCR 扩增。采用25 μL体系进行 PCR 扩增：10×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，模板1 μL，灭菌超纯水补充至25 μL。其中上游引物为ALL-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCG GCCCGGGGGCACCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物为 ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。扩增程序：95 ℃ 4 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环，72 ℃ 10 min。扩增结束后，PCR 扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
独钓寒江雪全诗采用8%的聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=38.93 ∶1.07，质量比）、变性范围为35%～52%（100%变性剂：尿素42 g，去离子甲酰胺40 mL）的凝胶进行分析。将凝胶置于温度为60 ℃的0.5 x TAE 电泳缓冲液中，于每个胶孔点样10 μL，先电压120 V，持续80 min 后，电压80 V，持续13 h。电泳结束后，采用硝酸银法染色，使用扫描仪对电泳图进行观察拍照，找出各泳道优势条带并切胶，将胶块捣碎于50 μL 无菌超纯水中，4 ℃静置过夜。用不含GC 夹的引物（ALL-V3F 和ALL-V3R）将回收胶块进行PCR 扩增，扩增体系及条件同DGGE 扩增。用清洁试剂盒纯化PCR 产物，并与载体（PMD18-T）连接后转化
到感受态细胞中进行克隆培养，筛选阳性克隆进行测序。使用BioEdit 软件将去除载体序列后在NCBI 中进行同源性比对。
1.3.4 样品细菌16S rRNA PCR 扩增及Miq 高通量测序
参考王玉荣等[15]方法进行样品细菌16S rRNA PCR扩增及Miq 高通量测序。采用20 μL 扩增体系：5×PCR 缓冲液 4 μL，dNTP mix 2 μL，上游引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和下游引物 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）各 0.8 μL，rTaq 酶0.4 μL，模板 10 ng，灭菌超纯水补充至 20 μL。扩增条件为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共运行 30 个循环，72 ℃延伸 10 min。扩增结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，合格后进行高通量测序。
1.3.5 序列拼接及质量控制
参照于丹等[16]和陈泽斌等[17]的方法，在除去不合格序列、barcode 序列和引物序列的基础上，将数据序列进行拼接。同时利用PyNAST 软件将所有的序列对齐，采用UCLUST 算
什么同舟鲜明的近义词法将相似度＞97%序列划分为一个操作单元（operational taxonomic units，OTU），从而进行物种鉴定和相对含量分析，对腐乳中的微生物多样性进行解析。
1.3.6 腐乳中乳酸菌的分离与鉴定
腐乳样品中乳酸菌的分离采用倍比稀释涂布法。将各样品稀释液涂布于改良MRS 固体培养基（含1.5%CaCO3）上，置于37 ℃厌氧培养48 h，挑选具有不同特征且透明圈现象明显的菌落划线纯化。纯化后的菌株进行革兰氏染色镜检、过氧化氢试验及冻存。参考文献[18]提取各菌株DNA，并参照张晓辉等[19]方法使用通用正向引物 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物 1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）进行PCR 扩增和测序。测序结果分析同1.3.3。
1.4 数据处理
通过Origin 8.5 软件对DGGE 图谱特征条带序列进行统计，同时对样品的稀释曲线及香农指数曲线（shannon diversity index curve）的作图。系统发育树由BioEdit 软件和MEGA 5.0 软件共同绘制。使用Office 2016 绘制平均相对含量＞5%的属水平饼图。Venn 图由在
员工外出登记表线绘图网页（http：//bioinfogpb.csic.es/tools/venny/index.html）进行绘制。相对含量＞1.5%的核心OTU热图由Matlab 2010b 绘制。
微信卡券2 结果与分析
2.1 腐乳中细菌DGGE图谱及分析
其实楠木可依本研究首先使用变性梯度凝胶电泳技术对样品16SrRNAV3 区域细菌群落组成进行研究，如图1所示。
图1 腐乳细菌PCR-DGGE 图谱Fig.1 PCR-DGGE analysis of bacteria in sufu
由图1可知，图谱中共出现6 条明亮的条带，同时条带 1、2、4、5 和 6 是两个样品的共有条带，说明不同腐乳样品中存在一些共有的细菌种群，其中条带1 最亮且存在于两个样品中，说明此条带所对应的细菌在腐乳中发挥着重要的作用。值得一提的是各条带亮度不同，条带2 和条带5 在FR01 中亮度较高，条带6 在FR02 中亮度较高，表明在细菌种群丰富度存在差异。而条带3 仅存在FR02 样品中，说明不同腐乳样品中存在着不同的细菌菌群。进一步将各条带进行序列分析，结果如表1所示。
表1 腐乳细菌DGGE 比对结果Table 1 Blast results of bacteria DGGE in sufu菌株编号 近源种 相似度 登录号1 Lactobacillus plantarum 100 MH544641.1 2 Lactobacillus plantarum 100 MH544641.1 3 Halobacillus karajiensis 100 AJ486874.2 4 Acinetobacter oryzae 100 MH071139.1 5 Pudomonas fluorescens 99 LS483372.1 6 Tetragenococcus halophilus 99 NR115655.1
