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自噬通过降解MBP参与脑白质损伤过程
摘要
目的：探讨自噬在新生鼠缺氧致脑白质损伤过程中的作用。
方法：选取3日龄的SD大鼠100只，同窝随机分为假手术组（Sham）和缺氧组(HI)，每组各50只，假手术组仅分离左侧颈总动脉，缺氧组通过分离左侧颈总动脉联合缺氧40min建立新生儿脑白质缺血缺氧模型；通过实验大鼠左眼睁眼时间观察以及组织病理学观察、超微病理学观察来评估脑白质损伤情况；通过免疫组化染色及Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3、Bclin1和髓鞘相关蛋白MBP的表达情况来评估自噬在新生鼠脑缺血缺氧诱导脑白质损伤过程中的作用及自噬与髓鞘相关蛋白MBP的表达减少间的关系。实验数据采用PSPP 17.0统计软件分析。
结果：（1） P3大鼠左侧颈总动脉联合缺氧40min可成功建立脑白质损伤模型，表现为睁眼时间延迟，HE染色见白质结构疏松，电镜观察髓鞘生成减少，自噬体增加（2）新生鼠脑缺血缺氧会引起脑白质MBP表达下调，缺血缺氧后48h时下调的比率最明显（P<0.05）（3）新生鼠轻度脑缺血缺氧12
落实制度小时即可诱导脑白质发生自噬，并在缺血缺氧48h后自噬水平达到高峰（P<0.05）； (4)免疫荧光双标共定位结果显示自噬表达和MBP蛋白表达有部分重合
结论：（1）新生鼠脑缺血缺氧可诱导脑白质发生自噬，且自噬水平变化呈缺血缺氧—时间依赖性；（2）新生鼠脑缺血缺氧后MBP表达减少可能与自噬介导MBP 的降解有关，提示自噬参与脑白质损伤的过程。
关键词：自噬；脑白质损伤；碱性髓鞘蛋白；新生鼠；缺血缺氧
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Autophagy Mediates the Degradation of MBP in Cerebral
White Matter Damage Model
Abstract
Objectives:To investigate the effect of autophagy in cerebral white matter damage in neonatal hypoxia-ischemia.
Method: Postnatal day (P) 3 Sprague-Dawley（SD）rats were randomized into Sham group (n=50) and hypoxia-ischemia (HI) group (n= 50), In HI group, SD rats were subjected to 6% oxygen for 40
min after left carotid artery ligation on;Cerebral white matter damage was evaluated by obrving rats’ left eye open time , histopathological changes and ultrastructural findings. Immunohistochemical staining and Western blot was ud to study the expression level of MBP, LC3 and Beclin1 The data were analyzed by using SPSS17.0 statistical software.
Results:(1) In HI group, rats’ eyes open time were delayed (P<0.05); HI groups’cerebral white matter rarefaction was showed with HE staining, lower myelin formation and increasing autophagosomes were obrved by TEM; (2) The expression of MBP significantly reduced in 48h after hypoxia-ischemia(P<0.05); (3) After HI 12h, autophagy can be found in neonatal white matter by Western blot, and the peak was on HI 48h (P<0.05); (4) Immunofluorescence double-staining showed that the expression of LC3 and MBP were partly overlap.
Conclusions:(1) Autophagy can be induced in cerebral white matter after hypoxia-ischemia in a time-dependence pattern; (2) The higher autophagy and lower expression of MBP after HI may be related that autophagy may play an important role cerebral white matter damage.
Key words:autophagy; white matter damage; MBP; neonatal rat；hypoxia-ischemia
中英文缩略词表
缩略词英文全称中文全称
海之泪WMD White matter damage 脑白质损伤
MBP Myelin basic protein 髓鞘碱性蛋白UPR Unfolded protein respon 非折叠蛋白反应HI Hypoxia-ischemia 缺血缺氧
3-M 3-Methyladenine 3-甲基腺嘌呤CNS Central nervous system 中枢神经系统
OL Oligodendrocytes 少突胶质细胞
Pre-O L s Pre-oligodendendrocytes 少突胶质细胞前体P V L Periventricular leukomalacia 脑室周围白质软化Atg Autophagy-related gene 自噬相关基因CMA Chaperone-mediated autophagy 分子伴侣介导自噬TEM Transmission electron microscope 透射电子显微镜
前言
近年来，随着科学技术的发展及医疗水平的提高，早产儿的生存率已显著提高，随之而来的则是不断升高的新生儿脑病发生率[1]。新生儿脑病是导致儿童神经系统伤残的主要原因，可由宫内感染，窒息，缺血等原因引起，常有后遗症，如脑性瘫痪、智力低下、癫痫、耳聋、视力障碍等。它不仅是个
人和家庭的问题更是一种社会问题，对其损伤机制的研究已经迫在眉睫。研究表明早产儿发生脑病的概率远高于足月儿，主要表现为脑白质损伤（White matter damage，WM D），即少突胶质细胞成熟障碍及髓鞘形成障碍引起的脑白质软化。少突胶质细胞（oligodendrocytes，OL）是早产儿WMD的主要靶细胞，深入研究其损伤机制，寻找保护少突胶质细胞的关键环节，及时采取保护措施将是未来研究的突破点。
髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein，MBP）是反映髓鞘发育成熟度的敏感指标，其含量高低在一定程度上也可反映脑损伤的严重程度及范围[2]。大量研究表明新生鼠缺血缺氧后MBP蛋白表达下调[1]，但是目前还没有直观的证据证明导致MBP下调的原因是什么。
断垣残壁
蛋白质表达量的减少，一般可以从两个方面考虑：（1）蛋白质合成减少；（2）蛋白质降解增多。MBP的合成呈OL-成熟依赖性，成熟的OL才能合成MBP。蛋白质的降解主要通过以下两种途径：（1）通过蛋白酶体降解蛋白质；（2）通过细胞自噬作用降解蛋白质。自噬是哺乳动物中高度保守的清除、降解、和回吸收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的重要代谢通路，主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白。当大量的未折叠或错误折叠的蛋白聚集在内质网，蛋白酶体不能完全降解时，非折叠蛋白反应(Unfolded protein respon,UPR )会上调自噬机制[3]。目前研究表明新生鼠缺血缺氧可诱导神经元细胞发生自噬[4]，但是自噬是否参与缺血缺氧致脑白质损伤的过程及MBP表达水平的下调
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是否是由于自噬介导的蛋白降解引起的尚不明确。
综上所述，我们拟在建立新生鼠脑白质损伤模型的基础上，探讨以下三个问题：（1）新生鼠脑缺氧缺血后脑白质是否发生自噬；（2）新生鼠脑缺血缺氧后穿上英语怎么说
