宁波罗蒙鸡肠道大肠埃希菌的分离鉴定及对噬菌体的敏感性测定
邹玲;刘晓飞;任慧英
【摘 要】This study aimed to identify the lysis ability of phages for chicken pathogenic Escherichia coli to the li in intestinal flora of li in collected chicken cloacal swab samples were iso-lated and cultured on SS medium.Morphological obrvation and biochemical identification were done for 28 bacterial isolates.Single plaque and double layer plate method were ud to detect the nsitivity li isolates to eight phages.The results showed that 28 bacterial isolates were Escherichia coli ,and only 1 isolate could be lyzed by 4 phages,the others were not nsitive.The results indicated that bacteri-ophage lyzing chicken pathogenic Escherichia coli could not lyze chicken normal li.%研究确定鸡致病性大肠埃希菌的噬菌体能否裂解鸡肠道正常菌群中的大肠埃希菌，采集鸡肛拭子样本，通过 SS 培养基进行大肠埃希菌的分离培养，并对分离到的28株菌进行形态观察及生化鉴定。分别采用单斑法和双层平板法，检测了大肠埃希菌分离株对8株噬菌体的敏感性。结果显示，分离到的28株大肠埃希菌中只有1株对4株噬菌体敏感，其
他菌株对8株噬菌体均不敏感。说明对鸡致病性大肠埃希菌具有裂解作用的噬菌体不能裂解鸡肠道正常大肠埃希菌。
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2014(000)009
【总页数】3页(P82-84)
【关键词】鸡;肠道;大肠埃希菌;分离鉴定;噬菌体
【作 者】邹玲;刘晓飞;任慧英
【作者单位】青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109;青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109;青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109
【正文语种】中 文
土尔其【中图分类】S852.612
随着集约化养禽业的发展，大肠杆菌病已成为危害养禽业的重要细菌病。目前对大肠杆菌病主要是利用抗生素进行预防和治疗，随着抗生素的大量使用，致病性大肠埃希菌（大肠杆菌）对药物的敏感性逐渐降低，耐药谱不断扩大，治疗效果显著下降［1］。而多数养殖场饲养管理过程中滥用抗生素现象普遍存在［2］，更有甚者，将兽药用作饲料添加剂来降低动物发病率与死亡率、提高饲料利用率、促进生长和改善产品品质，这都将导致畜产品兽药残留［3］。据相关资料记载和报道，禽源大肠埃希菌的血清型众多，目前国外报道的血清型已达160多种［4－5］，且菌株之间缺乏完全保护，研制出具有高保护力的大肠埃希菌疫苗十分困难。鉴于新抗菌药物研发的速度远远低于耐药菌产生的速度，寻找代替抗生素治疗细菌性疾病的策略成为解决该问题的有效途径［6－7］，噬菌体具有高度特异性，不会影响到其他的菌群，不会破坏体内微生态的平衡、导致其他耐受性致病菌的生长，也很少引起胃肠道反应、过敏反应等［8］。因此，噬菌体作为一种生物抗菌剂，比抗生素在细菌性疾病的治疗和预防方面更有优势，越来越广泛地受到人们的关注［9］。
占座本试验拟分离不同健康鸡群肠道正常菌群的大肠埃希菌，测定对鸡致病性大肠埃希菌具有裂解作用的噬菌体能否裂解鸡肠道正常菌群的大肠埃希菌。研究结果可为临床上应用噬菌体制剂进行大肠杆菌病的预防及治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及噬菌体 5株鸡源致病性大肠埃希菌分离株（血清型分别为 O15、O24、O78、O93，另有一株未定型）；8株噬菌体Bp2、Bp3、Bp4、Bp5、Bp6、Bp7、Bp8、Bp9，均由青岛农业大学动物科学学院兽医微生物实验室保存。
1.1.2 主要试剂及培养基 普通营养琼脂培养基；LB肉汤液体培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁培养基、枸橼酸盐培养基、胰蛋白胨水培养基，北京陆桥技术有限责任公司产品；葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化管，杭州天和微生物试剂有限公司产品；葡萄糖蛋白胨水、吲哚试剂、MR试剂、V－P试剂；革兰染液由本实验室配制。
1.2 方法
1.2.1 材料采集 自青岛10个蛋鸡养殖场无菌采集健康蛋鸡泄殖腔拭子28份，立即放入无菌EP管中，每个饲养群体采集1份。
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1.2.2 细菌的分离 分别将采集的样品在SS培养基上划线分离，于37℃过夜培养后，挑取粉红色单菌落，再培养纯化，置于4℃冰箱保存备用。
将纯化后的单菌落接种伊红美蓝琼脂培养基，于37℃培养24h后，观察菌落特征。挑取多次划线所得单菌落进行革兰染色，显微镜检查。
1.2.3 生化试验 按常规方法在无菌条件下，用接种针将分离纯化的疑似大肠埃希菌单菌落分别进行五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵、三糖铁试验、IMViC试验。
1.2.4 大肠埃希菌对噬菌体的敏感性测定
1.2.4.1 菌悬液的制备 分别挑取28株菌的单菌落分别接种于1号～28号盛有5mL LB肉汤的试管中，37℃、160r／min振荡培养8h，即得到菌悬液。
电脑如何连接宽带1.2.4.2 单斑法测定大肠埃希菌对噬菌体的敏感性［10］ 取100μL菌悬液分别均匀涂布于普通琼脂平板上，用微量移液器分别取2μL噬菌体悬液滴于平板的不同位置上，加样时，各种噬菌体悬液间不能有接触，以免影响试验结果。待自然干燥后37℃培养6h～8h，观察结
果。
act的名词1.2.4.3 双层平板法测定大肠埃希菌对噬菌体的敏感性［11］ 分别将噬菌体和菌悬液的混合液加入至已融化的上层琼脂培养基中（55℃）立即旋摇，混匀后将上层培养基迅速对号倒入已准备好的底层琼脂上，轻摇平板，使上层培养基铺满平板，待其凝固后，37℃倒置培养6h～8h，观察结果。
1.2.5 动物致病性试验 将1.2.4中所测的对噬菌体敏感的菌株、随机选择一株对8株噬菌体均不敏感的菌株及一株鸡致病性大肠埃希菌分别接种LB肉汤，37℃、160r／min振荡培养8h后作为致病力试验用菌液，每株菌接种2只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL，共分4组，致病性大肠埃希菌组为阳性对照，未注射组为阴性对照，接种后隔离饲养。随时观察并记录死亡情况，及时剖检死亡小鼠，观察病理变化并分离细菌。
2 结果
2.1 培养特性
我要结婚了经37℃培养24h～48h后，分离菌在SS琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐
的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落。
2.2 革兰染色
取28个伊红美蓝琼脂平板上黑色带金属光泽的单个菌落涂片，革兰染色后镜检可见到革兰阴性、两端钝圆的短杆菌，无芽胞。
2.3 生化试验
本试验所分离的28株菌均能够发酵乳糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露醇，2、3、5、6、12、17、18、19、23号发酵蔗糖，三糖铁培养基反应式均为均为＋ ＋ － －，结合以上培养特性及革兰染色结果，初步判定所分离的28株菌均为大肠埃希菌。
2.4 对噬菌体的敏感性测定
2.4.1 单斑法测定噬菌体敏感性 由观察结果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9可裂解9号大肠埃希菌，Bp5、Bp6疑似可裂解26号大肠埃希菌，Bp9疑似可裂解28号大肠埃希菌。BP2、BP3对所有菌株都不裂解，有待于用双层平板法进一步验证。
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2.4.2 双层平板法测定噬菌体敏感性 由结果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9 可裂解9号大肠埃希菌，BP2、BP3、BP5、BP6对所有大肠埃希菌都不裂解，与单斑法结果相比，26号、28号可疑噬菌斑在双层平板法中均无噬菌斑产生。
2.5 动物致病性试验
将致病性大肠埃希菌及在噬菌体敏感性测定中对噬菌体敏感和不敏感的菌株分别接种小鼠。接种小鼠6h以后开始出现症状，表现精神沉郁，被毛粗乱，食欲下降，呼吸急促，不愿走动。剖检死亡小鼠，有肺充血、出血，肝肿大等症状。接种10h后开始出现死亡，接种阳性对照株的两只小鼠的死亡时间分别为10h和16h；接种9号菌株小鼠的死亡时间分别为19h和12h；接种14号菌株小鼠的死亡时间为36h；接种阴性对照的小鼠表现正常。3株大肠埃希菌毒力强弱顺序为阳性对照＞9号＞14号。
