•250.血病•淋巴瘤 2021 年4 j j第 30 卷％4期 Journal of Leukemia ^ l-vniphoma. April 2021. VoL_30a N〇.4
单细胞测序技术在多发性骨髓瘤中的研究进展
吉佳梅屈晓燕
南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院血液科，南京210029
通信作者：屈晓燕，Email:quxiaoyan2()
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【摘要】多发性骨髓瘤（MM)是•种由单克隆浆细胞异常增殖引起的恶性血液疾病传统的高通
量细胞测序仅仅反应细胞群体的异质性，却忽略单细胞中的遗传信息中.细胞测序技术的发展能够电
清楚J'解肿瘤和骨髓微环境中的细胞差异，深入探索MM的发病机制，并指导临床治疗文章综述广第
细胞测序技术的最新进展及其在MM发病机制、疾病进展监测、免疫治疗和治疗反应方面的应用
【关键词】多发性骨髓瘤；单细胞分析；免疫疗法；队列研究；预后
DOI ：10.3760/rm l 15356-20201 118-00280
Progress of single-cell quencing in multiple myeloma
哈尔滨师范大学录取分数线Ji Jiamei,Qu Xiaoyan
Department of Hematology,the First AJ/llialecl Hospital of Nanjing Medical University.Jiangsu Province
HospitaL Nanjing 210029,China
Corresponding author: Qu Xiaoyan.Email: (/
【Abstract】Multiple myeloma (MM) is a malignant hematological disorder caud bv the abnormal
proliferation of monoclonal plasma c ells. Traditional high-throughput cell (|uencing reflects the helerogeneily
of cell population, while it ignores tht* genetic information in single - cell. The developm ent of sin g le-cell
quencing：has enabled the access to cell - to-cell variation in tumor and m icroenvironment of hone marrow,
providing a deep understanding of the pathogenic m echanism s of MM and guidance* for clinical trealmeMil. This
paper reviews the latest progress of sin g le-cell quencing and its application in dia pathogenesis,
monitoring 〇( dia progression, immunotherapy and therapeutic respons of MM.
【Keywords】Multiple myeloma; Single-cell analysis; Im munotherapy；Cohort studies; Prognosis
1)01 ：10.3760/cm l 15356-20201 118-00280
多发性骨髓瘤（MM)是一种以浆细胞单克隆增殖为特征 的恶性血液病核划分析和荧光原位杂交是MM患者诊疗的 重要组成部分荧光原位杂交定义染色体畸变，但不能进行 全面细胞遗传学分析1下一代测序或全基因组测序技术可 研究MM患者基因组的改变〃，但忽略了单个细胞包含的遗 传信息单细胞测序技术分析单个细胞差异的异质性，对疾 病的发病机制、靶向治疗及预后有电深层次的理解：文章就 单细胞测序技术在MM中的应用和进展进行综述
1单细胞测序技术
中-细胞测序技术的流程包括单细胞样本制备、单细胞捕 获、基因组/转录组/表观遗传组的文库构建、测序与数据分 析等步骤
1.1单细胞样本准备
制备高质M的单细胞悬浮液是单细胞研究成功的关键，因此研究多采用新鲜的组织样本操作过程中，不同时间点 收集的样本可冷冻保存后同时处ffl以避免技术批次效应51.2单细胞捕获
荧光激活细胞分选技术使用特异性荧光色素标记单个细 胞.通H激光照射捕获细胞特有信号，但低强度荧光样本不适 用免疫磁珠分离利用磁力进行细胞分离微流控技术当前 M常使用.10 x蓰因组学系统则是当前应用最广泛的微流控系 统之一，商业化的l〇x基因组学是利用油相的微小水滴封装 单细胞，被捕获的单细胞在油包水液滴中裂解、标i d、反转录 和扩增微流控技术通量高.移液误差小，实验准确性高. 但成本较高。
1.3 单细胞测序
1.3.1单细胞基因组测序
中-细胞基因组测序依赖于全基因组扩增（WGA)，将微M 的堪因组l)NA扩增以获得单细胞全基因组图谱简并寡核苻 酸引物聚合酶链反应（I)〇P-PCK)最早出现，但基因组盖率较低多重置换扩增（MDA)利用一种链置换DNA聚合酶，将 申链DNA按指数方式扩增成超支化结构M .但等位基因丟失 率H]■高达65%，不适合进行基因拷贝数变异（CNV>的分析
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i f f l病•淋巴#留 202 丨 <；丨'4 J j第 30 往來 4 期 Journal of LtMikemia & I,\.mp 丨丨丨)ma，April 202 丨•Vol. 30. 1\<>.4•251.
多重退火和基于环的扩增循环（MALBAC)通过基于环的扩增 子保护和随后的PCK采用准线性扩增n，但存在一定假阳性 率因此研究过程中可有冃的的组合使用扩增技术
1.3.2单细胞转录组测序
单细胞转录组测序先将mKNA反转录成rDNA，在末端 插人引物结合位点后再对rDNA进行扩增：最常见的方法 有 CEL-q2、Drop-s e q、MARS-s e q、SCRBq、Sm注rt-q 和Smart-sf(|2Ziegfiilmin等l：利用小鼠胚胎干细胞对上述6种方法进行评估研究发现当分析低盖率的大量细胞，首选 Drop-q；当定量较少细胞时，SCRB-q和MARS-q较好；当注释较少细胞时，4以使用内部产生的转座酶，Smart-S eq2最优因此需根据不同的研究目的选择适宜的扩增方法。
1.3.3单细胞表观遗传测序
一旦表观遗传层面发生变化，细胞的功能随之改变_表 观遗传包括UNA甲基化(5-mc)、羟甲基化(5-hmc)、KNA甲基 化等：Hi-C法与m_KRBS无法分析来自同一个体细胞的不同 层表观基因组，所以Guo等"研发了 C00L-S eq(染色质整体组 级横向测序），可以同时分析来自同一单个细胞的染色质可
及 性、核小体定位、脱氧核糖核酸甲基化和CNV，具有高灵敏度 和高覆盖率.CnBATCH方法大大提高了 ChIP效率，组合标签 的方法实现了每个细胞可产生12 000个独特的非重复读 取14 ，是H前最高效的Ch丨P-q技术
2单细胞测序技术在MM中的应用
2.1 发病机制
MM患者发病会经历意义不明的单克隆丙种球蛋白病 (MGUS)或冒烟铟多发性骨髓瘤（SMM)阶段^ _.基因组研 究表明MGUS和SMM克降叫能已经存在于MM发病相关的染 色体重排1^。但从MGUS和SMM进展为活动性骨髓瘤的比 例约为每年1%和10% w有研究表明，骨髓微环境中T细胞、自然杀伤（NK)细胞和树突细胞会发生数t t变化，因此探索免 疫微环境很有必耍Zavidij等1:1_在MGUS阶段观察到T细胞，Cl)W单核细胞和NK细胞明显扩增；在SMM阶段，记忆细胞 丢失，T细胞向表达GrB/ H的效应细胞状态的分化明显偏斜 除此之外，骨髓间充质干细胞和成熟的C1H4'单核细胞/巨噬 细胞早在MGUS阶段就丧失了 MHC II类表面表征，抑制T细胞激活
Bailur等发现了随着疾病发展而进行性增加的末端效 应T细胞，这提示T细胞分化的改变起源于癌变前早期在 M GUS患者中，骨髓中的记忆性T细胞被富集为TC F1hi记忆T 细胞.，在维持长期保护性免疫的过程中，TCFlhi记忆T细胞 被认为通过减少衰竭的T细胞的损耗而发挥了重要作用所 以他们推测M
中TC FI lii id忆性T细胞的丢失可能导致保护 性免疫的失效和免疫监测的丢失尽管需要更大的队列进行 进一步的研究来验证结果的可靠性，但他们的研究为阻止 MGUS向MM方向转化提供了一条新的思路.
结构性染色体重排可能导致基因融合.也就是肿瘤形成 的强有力的驱动突变Foltz等y分析742例MM患者的融 合基因，证明了肿瘤负荷与融合的一致性，之后分折5例M M 患者的scRNA-q数据，从srRNA-q中的嵌合转录物发现了 单细胞融合，证明使用单细胞测序技术可检测到基因融合 因此w R N A-q在单细胞水平上提供了一种检测基因融合的 方法，有助于获得更完整的患者肿瘤进化过程
2.2 治疗与预后
原发性和继发性细胞遗传学异常以及特异性分子改变都 会影响疾病进展、治疗反应和预后i25Jang等M根据不同的 疾病进展阶段分患者为4组（LI-L4 >，通过比较4组细胞群集 组，从中确定了 44个组间表达水平持续增加的特征基因，.研 究还发现mTOKG丨途径基因可能作为U P R的激活，糖酵解和 厂体性高危M M和复发难治M M人群之间的蛋内质分泌途径 的特征，提示m TO K抑制剂匀蛋白酶体抑制剂联合治疗的u]■行性为探索获得性耐药机制，Xie等=在MM患者中发现Hh信 号激活，并且S IK T I靶向治疗有助于克服骨髓瘤细胞在体外和 体内的硼替佐米抗性该研究证明f单细胞测序技术在疾病 耐药性研究方面的用途：
近年来MM患者完全缓解率增高，但复发率居高不下，其 根源是存在微小残留病（MKD);Ledergm•等
对5例患有残 留疾病的患者进行纵向S(_RNA-q分析，其中4例患者接受了 以硼替佐米为基础的治疗方案，所有患者均接受了自体造血 干细胞移植的高剂量美法仑数据表明患者治疗前后主要驱 动因子表达相当，但ELK2AP基因、涉及钙结合的基因LCP1等发生显著改变。
综上所述.srRNA-q是指导MM治疗方案与预后的一种 强有力的方法
2.3髓外病变机制
部分患者可在骨髓原发灶处发现突出骨骼外的或远离骨 髓原发灶的软组织浆细胞瘤，被称为髓外病变，患者生存期通 常较短 Ryu等lw确定增殖、细胞周期进程上调中的转录变 化.并&发现了核转录因子（NF-k B)通路在骨髓或髓外微环境 中的不同作用此外.以A细胞介素6UL-6)为主的骨髓瘤生 长因子受体的自分泌和多效性基因表达表型的改变也被认为 在髓外进展过程中发挥重要作用
Pang等™对5例EMP阳性患者的骨髓中骨髓瘤细胞和外 周循环浆细胞k P C)进行分析，发现S1PR2在fP C中的表达下 调选用SIPK2选择性拮抗剂JTE-0丨3进行药理学抑制或敲 除SIPK2后，发现细胞的迁移和侵袭增加.而敲除S1PR2降低 细胞中MMP-9表达_NF-k B途径可能介导SIPK2对MM细胞 迁移和侵袭的抑制作用，表明S1PK2下调可能通过激活NF-k B 途径促进细胞迁移和侵袭w :,
2.4 疾病监测
在疾病进展过程中，重复骨髓活组织检查获取基因组的 改变是不现实的Lohr等31将CD138+.CD45-细胞富集与连续 稀释相结合，富集、纯化后进行单个细胞测序。所有患者均成 功分离循环肿瘤细胞(CTC)，检测灵敏性与FACS的MRD诊断 类似，表明CTC可以在MM进展过程的多个时间点分离M M 细胞的癌基因如BRAF激活突变、KRAS G12C突变也均可检 测M此方法对MM进展阶段进行监测与评估，对于预后及治 疗相关基因的探索也有一定作用
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3小结
食堂合同单细胞测序技术在近几年迅速发展，已成为MM研究的一 项新手段但作为一种新技术，单细胞测序存在一定局限，如成本高、样本要求高、分选时易污染、扩增偏倚等针对时间和成本方面，S h m等《通过短条形码寡核苷酸的瞬时转染开 发了一种通用的样品条形码方法进行单细胞测序：通过进行 物种混合实验，他们验证了该方法的准确性，并确认了识别多 重态和负态的能力，有助于推动单细胞测序技术的应用：因此.单细胞测序仍可在适应冷冻或者间定样本、优化细 胞分选方法、自动化测序等方面进一步完善总之，单细胞测 序技术为深入了解的发病机制、进行疾病监测与预后分析 提供了新途径，并且使实现MM的个体化诊治和预测预防成为 可能
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期：2020-U-18)
(本文编辑：杨璐校对：胡睿）
淋巴瘤微环境与免疫逃逸关系的研究进展
卞真真聂山林桑威徐开林
徐州医科大学附属医院血液科徐州医科大学血液病研究所，江苏徐州 22i(_im ,… , L 扫码阅读电子版
通信作者：桑威，Email :swl
【摘要】淋巴瘤微环境是影响淋巴瘤发生、发展的重要因素，参与调控机体免疫系统对淋巴瘤细胞 的识别和免疫应答t 在淋巴瘤的免疫治疗时代，微环境的状态也影响了基于单克降抗体、小分子化合物 等免疫靶向药物对淋巴瘤细胞的作用其中，微环境相关的免疫逃逸是导致淋巴瘤治疗失畋的重要因 素之一，文章就基质细胞免疫细胞亚群、血管增生，缺氧状态、免疫检查点等微环境因素和免疫逃逸的 相关研究最新进展进行综述
【关键词】淋巴瘤；肿瘤微环境；免疫逃逸
基金项目：江苏省自然科学基金（BK 2017丨丨81)；江苏省青年医学重点人才项目（QNRC 2016791M ：L 苏省科技厅社会发展重点项目（BE 2019638)
1)01 ： 10.3760/<ma .j.rnl 15356-20200907-00218
Progress of correlation between microenvironment and immune escape of lymphoma
Bian Zhenzhen , Nie Shanlin , Sang Wei , Xu Kailin
Department of Hematology , Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University , Institute oj Hematology , Xuzhou Medical University , Xuzhou 221000, China
Corresponding author : Sang Wei , Email ：swI
【Abstract 】 The microenvironment of lymphoma is an important factor affecting the clevelopment of
lymphoma , which is involved in regulating the recognition and immune respon of lymphom
a cells by the immune system . In the era of immunotherapy of lymphoma , the state of microenvironment also affects the effect of monoc lonal antil )〇dies , small molecular compounds and other immune targeting drugs on lymphoma cells .Among them , microenv ironment - related immune escape is one of the key factors leading to the failure of lymphoma treatment . This article reviews some microenvironment factors such as stromal immune cell subts , vascular proliferation , hypoxia , immune checkpoint and the recent rearch progress of immune escape .
【Keywords 】 Lymphoma ; Tumor microenvironment ; Immune escape
Fund program: Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK 20171181); Key Program for
\oung
