武春爽，程榕欣，黄泳谚，等．黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１基因的特征及低温下表达变化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２２，５０（２４）：４３－５０．
ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２２．２４．００６
黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１基因的特征及低温下表达变化
武春爽１，２，程榕欣１，黄泳谚１，王 斌１
，２
（１．韶关学院英东生物与农业学院，广东韶关５１２００５；２．华南农业大学园艺学院，广东广州５１０６４２）
摘要：Ｇ蛋白偶联受体是重要的信号传导因子，在低温信号应答中发挥着重要作用。ＣＯＬＤ１（ｃｈｉｌｌｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ１）编码１个Ｇ蛋白信号调节因子，可能作为低温信号感受器发挥作用。以采后黄瓜作为试验材料，克隆ＣｓＣＯＬＤ１的全长序列，分析其序列特性及其在低温处理期间的表达变化。结果显示，ＣｓＣＯＬＤ１基因全长１４４３ｂｐ，编码４８０个氨基酸残基；ＣｓＣＯＬＤ１蛋白定位在细胞膜、叶绿体上，含有９次跨膜结构，是一个跨膜蛋白；黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１与拟南芥等双子叶植物ＣＯＬＤ１蛋白的氨基酸序列同源性较高，两者ＣＯＬＤ１的
进化关系较近，葫芦科植物ＣＯＬＤ１的ＧＰＨＲ＿Ｎ与ＡＢＡ＿ＧＰＣＲ结构域高度保守；在６℃低温处理下ＣｓＣＯＬＤ１表达量在叶片中基本没有变化；在５、１０℃低温处理下，ＣｓＣＯＬＤ１的表达量在采后黄瓜中显著下调。虽然未在ＣｓＣＯＬＤ１启动子中鉴定到低温响应元件，但检测到乙烯响应元件、ＭＹＢ和ＭＹＣ转录因子结合位点，表明该基因是一个逆境胁迫相关基因。ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的氨基酸序列中含有多个磷酸化位点，表明其可能在磷酸化后发挥功能。
关键词：温度感受器；Ｇ蛋白信号调节蛋白；ＣＯＬＤ１；黄瓜；表达分析
中图分类号：Ｓ６４２．２０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２２）２４－００ －
收稿日期：２０２１－１２－３１
顺治皇帝简介基金项目：广东省基础与应用基础研究基金（编号：２０２０Ａ１５１５０１００６８、２０２２Ａ１５１５０１１９１３）；广东省教育厅青年创新人才项目（编号：２０１８ＫＱＮＣＸ２３１）。
作者简介：武春爽（１９９９—），女，黑龙江绥化人，硕士研究生，主要从事采后果蔬生物学方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｓｈｕａｎｇ＿５＠１６３．ｃｏｍ。通信作者：王 斌，博士，讲师，主要从事采后果蔬生物学方面的研究。Ｅ－
ｍａｉｌ：ｂ＿ｗａｎｇ＠ｓｇｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 植物具有感知环境温度变化的能力，并可对环
境温度的改变作出响应［
１］
。但是温度是无形的物理因子，无法直接与细胞内的化学组分相互作用。因此推测，在植物体内必定存在着一些特殊的温度
感受器［２］
，植物通过这类感受器感知环境温度的变
化，温度感受器再将信号向下传递，最终使植物响应温度的变化。异三聚体Ｇ蛋白是生物体中重要
的信号传导因子［３］
，具有经典的七重跨膜结构，由
Ｇα、Ｇβ和Ｇγ等３个亚基组成，四字开头成语
在失活状态下，这３个亚基形成异三聚体Ｇ蛋白［４］
。Ｇ蛋白的上游是细胞膜受体蛋白，即Ｇ蛋白偶联受体（
Ｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ）［５］。ＣＯＬＤ１（ｃｈｉｌｌｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ１）编码１个ＧＰＣＲ蛋白，是１个Ｇ蛋白信
号调节因子，含有９次跨膜结构［６］
卡通狗图片。用低温处理粳稻
时，
ＣＯＬＤ１蛋白能与水稻Ｇ蛋白α亚基（ｒｉｃｅＧ－ｐｒｏｔｅｉｎαｓｕｂｕｎｉｔ１，ＲＧＡ１）相互作用，激活Ｃａ２＋
通道
和Ｇ蛋白的三磷酸鸟苷（
ｇｕａｎｏｓｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＧＴＰ）酶活性，触发下游耐冷防御机制［
７］
。上述研究结果表明，水稻ＣＯＬＤ１可能作为重要的低温信号感受器，能
够调控水稻对低温的耐受能力［７］
。但是目前仅在极
少数禾本科植物中鉴定了ＣＯＬＤ１蛋白的低温信号感
知能力［
碟中谍4８－９］
，其他植物的ＣＯＬＤ１蛋白是否也具有类似的低温信号感知功能，值得进一步探究。
黄瓜（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）是一种重要的经济作物，在世界各地广泛栽种，也是我国栽培的主要设
施蔬菜［１０］
。黄瓜起源于热带亚热带地区，喜温、不
耐冷，在其生长期遭受低温胁迫会严重影响其生长
发育，甚至会对产量造成影响［１１］
。将采收后的黄瓜
果实贮藏在低于１
０℃的低温环境中即会产生冷害，遭遇冷害的采后黄瓜很容易被致病菌侵染而腐烂
变质，造成严重的经济损失［１２］
。因此，挖掘耐冷相
关基因，对于通过分子育种方法改良黄瓜种质具有重要意义。本研究从黄瓜中克隆了Ｃ
ｓＣＯＬＤ１基因，采用生物信息学方法分析其编码蛋白的基本特性，并探究低温处理对黄瓜不同组织中ＣｓＣＯＬＤ１基因表达的影响，可为进一步的功能鉴定奠定基础。１ 材料与方法１．１ 材料与处理
以商品名为翠夏的采后黄瓜为试验材料，种子
购自广东现代金穗种业有限公司，父母本信息不详。２０１９年５月，采收商品成熟度的黄瓜用于低温处理试验，将采收后的黄瓜立即运回实验室，剔除有病虫害、机械伤的黄瓜，挑选成熟度、大小、形状基本一致的黄瓜作为试验材料。
叶片低温处理：种子在播种前，用１％次氯酸钠消毒３０ｍｉｎ，用纯净水充分洗净种子表面的消毒剂，然后放置在２６℃环境中直至种子萌发。将发芽的种子移植在无机盐培养基（含０．５ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ和０．１ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ
２
，ｐＨ值为５．７）中，室温（２４℃）黑暗条件下培养５～６ｄ。之后，将黄瓜幼苗在６℃低温下处理１２ｈ，提取黄瓜幼苗的叶片总ＲＮＡ，检测低温处理期间ＣｓＣＯＬＤ１在叶片中的表达情况。
采后黄瓜低温处理试验：将黄瓜分为２组，每组１０根，将分组黄瓜装在果篮中，用塑料薄膜保鲜袋套袋包装、密封。一组黄瓜贮藏在５℃低温冷库中，另一组贮藏在１０℃冷库中，冷库的相对湿度为８５％。分别在贮藏后０、１２、７２ｈ取样，提取黄瓜果皮总ＲＮＡ，检测低温处理下ＣｓＣＯＬＤ１基因的表达情况。１．２ 总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成
黄瓜果皮样品在液氮中充分研磨，称取０．１ｇ样品用于总ＲＮＡ的提取。采用天根生化科技（北京）有限公司的ＲＮＡｐｒｅｐＰｕｒ多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒（产品编号：ＤＰ４４１）提取黄瓜果皮总ＲＮＡ。使用上海翊圣生物科技有限公司生产的Ｈｉｆａｉｒ Ⅲ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ反转录试剂盒（产品编号：１１１４１ＥＳ６０）合成第１链ｃＤＮＡ。总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ合成的具体方法和步骤严格参照试剂盒说明书进行。
１．３ ＣｓＣＯＬＤ１全长序列的克隆
从黄瓜基因组数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／）中获得ＣｓＣＯＬＤ１（登录号：ＣｓａＶ３＿２Ｇ０１４０６０）的ｃＤＮＡ序列，设计特异引物（正向引物序列：５′－ＡＴＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＡＡＴＴＧＴＡ－３′；反向引物序列：５′－ＴＴＡＧＴＣＴＡＴＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣ－３′）。以黄瓜ｃＤＮＡ为模板，采用生工生物工程（上海）股份有限公司的高保真ＤＮＡ聚合酶，通过ＰＣＲ法扩增ＣｓＣＯＬＤ１的全长序列。ＰＣＲ反应程序：９５℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。用１％琼脂糖凝胶电泳回收ＰＣＲ产物，将回收产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接。用连接产物转化ＤＨ５α大肠杆菌感受态细胞（购自上海唯地生物技术有限公司），将转化了重组载体的大肠杆菌在含有氨苄霉素抗生素的ＬＢ固体培养基上培养，直至长出肉眼可见的单菌落。挑
取阳性单菌落，用菌落ＰＣＲ法验证重组载体是否转化成功，将成功转化重组载体的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司进行测序鉴定。
１．４ 生物信息学分析
ＣＯＬＤ１基因及其编码蛋白的生物信息学分析参照郝向阳等的方法［１３］。通过在线平台ＥｘＰＡＳｙ分析ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的理化性质，用ＳＯＰＭＡ工具分析其二级结构，用Ｐｌａｎｔ－ｍ－ＰＬｏｃ预测ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的亚细胞定位。用ＮｅｔＰｈｏｓ３．１工具分析蛋白序列中潜在的磷酸化位点，用ＥｘＰＡＳｙ－ＰＲＯＳＩＴＥ在线工具（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）预测蛋白结构域和功能位点。通过ＷｅｂＬｏｇｏ网站分析ＣｓＣＯＬＤ１保守结构域的氨基酸序列保守性，用ＳｉｇｎａｌＰ４．１工具预测信号肽。用Ｎｏｖｏｐｒｏ公司网站的在线工具预测跨膜结构域，得分超过５００即认为存在显著意义。先用ＰｌａｎｔＣＡＲＥ网站分析启动子中的顺式作用元件，然后用ＴＢｔｏｏｌｓ软件绘制启动子结构图。
１．５ 氨基酸的多序列比对和进化树的构建
通过同源比对的方法，在美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库中筛选出与ＣｓＣＯＬＤ１氨基酸序列同源性高的蛋白，用ＤＮＡＭＡＮ软件比对氨基酸序列的同源性，用ＭＥＧＡ７．０中的邻接（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）法构建系统发育进化树。
１．６ ＣｓＣＯＬＤ１基因的表达分析
ＣｓＣＯＬＤ１基因在采后黄瓜中的表达量由转录组测序获得，结果用每千个碱基的转录每百万映射读取（ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ，ＦＰＫＭ）值表示。转录组测序由北京百迈客生物科技有限公司完成，每个处理均包含３个完全独立的生物学重复。黄瓜叶片中ＣｓＣＯＬＤ１的表达数据从公开的黄瓜基因组测序项目中获得，项目编号为ＰＲＪＮＡ４３８９２３，所有表达量均用３次生物学重复的平均值表示。
１．７ 数据分析
用Ｅｘｃｅｌ２０１６软件整理试验数据，并绘制图片，用ＳＰＳＳ２２．０软件分析数据间的显著性。
２ 结果与分析无锡特色菜
２．１ ＣｓＣＯＬＤ１基因的克隆
本研究成功从黄瓜果皮中克隆了ＣｓＣＯＬＤ１基因的全长序列，经测序鉴定得出，该基因的开放阅
读框长度为１４４３ｂｐ（图１－Ａ），编码长度为４８０个氨基酸的蛋白质。在基因组中，ＣｓＣＯＬＤ１基因定位
在２号染色体上，全长由１３个外显子组成（图１－Ｂ）。
２．２ 黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的生物信息学分析２．２．１ 理化性质及亲疏水性 蛋白质理化性质分析结果显示，Ｃ
ｓＣＯＬＤ１蛋白的相对分子量为５４８２０．６１，理论等电点为７．５６，分子式为Ｃ２５３９Ｈ３９４４Ｎ６２０Ｏ６７５Ｓ２７，原子总数为７８０５。该蛋白由２０种氨基酸构成，其中异亮
氨酸（Ｌｅｕ）占比最高，占总氨基酸数量的１３．１％；其次为丝氨酸（Ｓｅｒ），占比为９．２％。带负电荷的氨基酸残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为４５个，带正电荷的氨基酸残基总数（Ａｒｙ＋Ｌｙｓ）为
４４个。ＣｓＣＯＬＤ１蛋白同时定位在细胞膜和叶绿体上，这与前人报道的植物ＣＯＬＤ１蛋白主要定位在细
胞膜的结果［
７－９］
一致。信号肽预测结果显示，ＣｓＣＯＬＤ１的氨基酸序列中无信号肽位点，属于非分泌性蛋白质（图２－Ａ）。亲疏水性分析结果显示，
ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的亲水性总得分为０．４２９，脂肪族系数为１１０．４６，不稳定系数为４４．７７，表明ＣｓＣＯＬＤ１是一个不稳定的疏水性蛋白（图２－Ｂ）
。一本师范大学
会务组织
２．２．２ 黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的二级结构 ＣｓＣＯＬＤ１蛋白的二级结构由６７．０８％的α螺旋（蓝色）、２０ ８３％的无规则卷曲（粉色）、８．９６％的伸展链（红色）和３．１２％的β转角（绿色）结构构成（图３）。２．２．３ ＣｓＣＯＬＤ１蛋白跨膜结构域与磷酸化位点分析 跨膜结构域分析结果显示，黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１蛋白有９重跨膜结构（图４－Ａ），这与水稻ＯｓＣＯＬＤ１蛋
白同样具有９重跨膜结构的特性是一致的［７］
。磷
酸化位点预测结果显示，该蛋白的氨基酸序列中有多个可被磷酸化的氨基酸残基（图４－Ｂ）。ＥｘＰＡＳｙ
－
ＰＲＯＳＩＴＥ分析结果显示，在３９５～４２４ａａ氨基酸序列区间，含有１个蛋白激酶腺嘌呤核苷三磷酸（ＡＴＰ）结合域，表明ＣｓＣＯＬＤ１蛋白可能在被蛋白激酶磷酸化
修饰后发挥作用。
２．２．４ 植物ＣＯＬＤ１蛋白的同源性分析 进化树分析结果显示，所有植物ＣＯＬＤ１蛋白均聚在一起（图５－Ａ），其中黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１与甜瓜ＣｍＧＴＧ１（ＸＰ＿００８４５９２０６．１）的亲缘关系最近，但与水稻ＯｓＣＯＬＤ１（ＸＰ＿０１５６３３３９８．１）、海枣ＰｄＣＯＬＤ１（ＸＰ＿００８８１３６２５．１）蛋白间的进化关系最远（图５－Ａ）。 用ＤＮＡＭＡＮ软件比较黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１与其他植物Ｃ
ＯＬＤ１蛋白的氨基酸序列同源性。结果显示，黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１与甜瓜ＣｍＧＴＧ１的同源性最高，序列相似性为９８．５４％；与拟南芥ＡｔＧＴＧ１（ＮＰ＿００１０３１２３５．１）、ＡｔＧＴＧ２（ＮＰ＿１９４４９３．２）及水稻ＯｓＣＯＬＤ１的同源性均较高（图５－Ｂ），序列相似性分别为８６．５４％、８６．１１％和８２．４８％。另外，所有植物ＣＯＬＤ１蛋白的氨基酸序列中均含有２个保守的结构域，分别是高尔基体ｐＨ调节因子家庭（ｇｏｌｇｉｐＨｒｅｇｕｌａｔｏｒｆａｍｉｌｙＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌ，ＧＰＨＲ＿Ｎ）和脱落酸Ｇ蛋白偶联受体（ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄＧ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＢＡ＿ＧＰＣＲ）保守域（图５－Ｂ）。值得注意的是，在氨基酸序列的Ｎ端，同是葫芦科黄瓜的
ＣｓＣＯＬＤ１、甜瓜的ＣｍＣＯＬＤ１，比水稻的ＯｓＣＯＬＤ１和拟南芥的ＡｔＧＴＧ１、Ａｔ
ＧＴＧ２蛋白多１３个氨基酸残基。在Ｃ端，ＯｓＣＯＬＤ１的第４５３个氨基酸位点处插入１个异亮氨酸（图５－Ｂ）。２．２．５ 葫芦科植物ＣＯＬＤ１保守结构域的保守性分析 本研究分析了葫芦科植物ＣＯＬＤ１蛋白的２个保守结构域的保守性，其中ＧＰＨＲ＿Ｎ结构域含有６９个氨基酸残基。结果显示，除第２０、第４５、第４６和第５８个氨基酸的相似性较低外，其他氨基酸序列高度一致（图６－Ａ）。ＡＢＡ＿ＧＰＣＲ结构域由１５８个氨基酸残基组成，仅有６个氨基酸的保守性较低，其他氨基酸的同源性都很高（图６－Ｂ）。由此可见，葫芦科植物ＣＯＬＤ１蛋白的ＧＰＨＲ＿Ｎ结构域、ＡＢＡ＿ＧＰＣＲ结构域在进化过程中高度保守，意味着葫芦科植物的ＣＯＬＤ１蛋白具有相似的功能。２．３ 黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１基因在低温处理期间表达量的变化
将叶片在黑暗、６℃低温条件下处理１２ｈ。与处理前（０ｈ）相比，低温处理期间ＣｓＣＯＬＤ１基因的表达量没有发生明显变化（图７－Ａ），表明叶片ＣｓＣＯＬＤ１没有响应低温处理。将采后黄瓜分别在５、１０℃处理７２ｈ，与处理前相比，２种低温处理均显著下调了ＣｓＣＯＬＤ１表达（图７－Ｂ），表明低温处理抑制了果实ＣｓＣＯＬＤ１的表达。２．４ 黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１启动子分析启动子在响应环境胁迫的过程中发挥重要作用，低温诱导基因的启动子中通常含有低温响应元
件和相关反式作用因子的结合位点［１４］
三月三庙会。为了探究ＣｓＣＯＬＤ１基因是否通过启动子直接响应低温胁迫以及是否受相关转录因子调控，笔
者从基因组中调出了该基因起始密码子（ＡＴＧ）上游１６８０ｂｐ的ＤＮＡ序列，分析了启动子中含有的与逆境响应有关的顺式作用元件。结果显示，ＣｓＣＯＬＤ１启动子中含有１个生长素响应元件（ＴＧＡ）、２个乙烯响应元件（ＥＲＥ）、１个厌氧诱导元件（ＡＲＥ）和７个光响应元件（６个Ｂｏｘ４，１个ＡＥ－ｂｏｘ），但是没有低温响应元件（ＬＴＲ）；含有２种反式作用因子因子结合元件，其中有２个ＭＹＢ位点、２个ＭＹＣ位点（图８）。上述结果表明，非生物胁迫可能调控ＣｓＣＯＬＤ１的表达。３ 讨论与结论
生物体对温度信号的感应与传导是一个复杂
的过程，温度感受器是植物生长发育和适应环境温度胁迫等生理生化过程所必需的生物感受器［１５］。瞬时型感受器电位通道（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｈａｎｎｅｌｓ，ＴＲＰ）蛋白是动物中的温度感受器，温度变化会激活ＴＲＰ蛋白，改变跨膜离子运输，起到内吞或外排等细胞活动，从而调节基因表达［１６］。但到目前为止，尚未在植物中鉴定出与动物类似的ＴＲＰ温度感受器。近几年的研究结果表明，水稻跨膜蛋白ＯｓＣＯＬＤ１可能是一个低温信号感受器［６－７，１７］。为了探究黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１是否也具有感知低温信号的能力，本研究从黄瓜中克隆了ＣｓＣＯＬＤ１全长序列。结果显示，该基因序列全长１４４３ｂｐ，编码１个４８０个氨基酸残基长度的蛋白质，是１个具有９重跨膜结构的跨膜蛋白，含有ＧＰＨＲ＿Ｎ（１５６～２２３ａａ）和ＡＢＡ＿ＧＰＣＲ（２９８～４５６ａａ）２个保守结构域。与水稻ＯｓＣＯＬＤ
１同时定位在细胞膜、内质网［７］不同，黄瓜ＣｓＣＯＬＤ１同时定位在细胞膜、叶绿体。番茄、辣椒和马铃薯等茄科植物的ＣＯＬＤ１蛋白主要定位在内质网和线粒体［１８］。上述结果表明，植物ＣＯＬＤ１蛋白具有多样的亚细胞定位特性。
水稻ＣｓＣＯＬＤ１是一个数量性状基因，该基因在耐冷性差异明显的粳稻和籼稻中的表达不同，在粳稻中的表达量更高，过表达ＯｓＣＯＬＤ１能显著提高水稻的耐冷性［７］。低温处理会诱导ＯｓＣＯＬＤ１的表达，在低温条件下，ＯｓＣＯＬＤ１蛋白通过与Ｇ蛋白ＲＧＡ１的α亚基互作，激活Ｃａ２＋通道活性，从而增强水稻的耐冷性［１９］。低温胁迫处理也能显著上调玉米、高粱和斑茅等单子叶植物中ＣＯＬＤ１的表达［８］。在玉
