【干货】诱导型条件性基因敲除介绍
在上上上上次,我们为大家简单的介绍了Cre-loxP重组酶系统,知道了条件性基因敲除策略主要是基于Cre-loxP系统,并且还可以通过它来实现在特定组织细胞中or在动物的特定发育时期对目的基因敲除。
那么,如何随心所欲地实现时空上的条件性基因敲除呢?让我为您一一道来!😎😎😎
条件性基因敲除小鼠
首先,在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个Loxp序列,得到flox小鼠。然后,将flox小鼠与带有组织特异性表达Cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞里把目标基因敲除的小鼠,即条件性基因敲除小鼠。
对于在特定组织细胞中的基因敲除,我们应该能够理解,主要取决于所选择的启动子。利用组织特异性表达的启动子调控Cre重组酶的表达,就可以实现相应部位特定基因的敲除。
另外,某些启动子(即诱导型启动子)也可以受某些外源性化学物质的调控,外源性调控的
评价鲁迅基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用,如荷尔蒙诱导系统、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。
这其中最频繁使用的是四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)和他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
五颜六色的近义词四环素诱导的Cre-loxP系统
四环素诱导的条件性基因敲除系统包含两个互补系统,tTA依赖(tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent)和rtTA依赖(rever tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent)的基因敲除系统,现在又称为Tet-Off系统和Tet-ON系统。
Fig.1 Tetracycline-inducible system[1]
(a) Tet-Off system. tTA is active without Dox (or tetracycline), and the gene of interest is expresd. With Dox (or tetracycline) treatment, tTA is inactivated, and the gene is no longer expresd. (b) Tet-On system. rtTA is inactive without Dox(or tetracycline), and the gene of interest is not expresd. With Dox (or tetracycline) treatment, rtTA is activated, and the gene is expresd.
琵琶行小序
徐冠巨在这两个系统中,四环素(tetracycline)或其衍生物多西环素(强力霉素Dox)控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合,从而调控下游基因的表达。沙和尚
不同的是:
01
Tet-Off系统
tTA与Ptet启动子结合不需要四环素或Dox,即可启动转录;但加入Dox后,形成Dox-tTA复合物,构象改变而不与启动子结合,阻碍目的基因表达。
02
Tet-On系统
与此相反,rtTA与启动子结合则需要四环素或Dox;加入Dox后,形成Dox-rtTA复合物与启动子Ptet结合,才能启动目的基因表达。
Tet-Off/On系统进行条件性基因敲除
采用Tet-Off系统进行条件性基因敲除时,需要两种小鼠品系,一个是将受特异性启动子调控的tTA的表达载体和受Ptet启动子调控的Cre重组酶的表达载体转入小鼠体内的转基因小鼠,一个是靶向目的基因的flox小鼠,将两种小鼠进行交配繁殖产生的子代小鼠中会在特定组织细胞中表达tTA,tTA再与Ptet结合后激活下游的Cre重组酶的表达,可实现特定基因在特定组织细胞中的敲除。如果在子代小鼠出生时就给予四环素,并且一直维持下去,特定基因的敲除就不会发生,只有在停止四环素的应用后才会发生该基因在特定部位的丢失。
采用Tet-On系统与上述情况正好相反,在不用四环素时基因敲除不发生,只有给予四环素时才会导致特定基因在特定部位的敲除。因此,可以使用该系统对靶位点进行时空上的调
控。
他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统
不像四环素系统调控基因的转录,他莫昔芬诱导的条件性基因敲除系统是在蛋白水平上调控基因的功能。该系统中,雌激素受体(ER)的配体结合域的突变形式与Cre重组酶融合,形成Cre-ERT。Cre-ERT不再与它的天然配体17β雌二醇结合,而与合成配体他莫昔芬结合。
Fig. 5 Tamoxifen-inducible system[1]
一篇作文300字
In the abnce of tamoxifen, Cre-ER binds with Hsp90, and is located in the cytoplasm. When tamoxifen is prent, it binds with the ER, displacing Hsp90. The Cre-ER-tamoxifen complex translocates to the nucleus, in which Cre executes its function. The black triangles indicate loxP sites. Modified from Tian et al.(2006)
球蛋白偏低是什么原因
不加他莫昔芬时,Cre-ERT融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白如Hsp90,抑制受体临近结构域的功能,使这种复合体定位于细胞质中,而不能进入核。
加入他莫昔芬时,Hsp90从ER中转移出来,ER受体转变为活性状态,暴露出ER的核定位信号,在核定位信号的引导下,Cre重组酶能进入核中并行使其功能。
目前,新出的Cre-ERT2和ER-Cre-ER是两种相较于Cre-ERT效率更高的融合蛋白。
他莫昔芬系统进行条件性基因敲除
与四环素诱导的系统一样,采用他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统进行条件性敲除时也需要2种小鼠品系,一个是flox小鼠,另一个是Cre工具小鼠,Cre-ERT位于广谱型启动子或组织特异性启动子下游,他莫昔芬可以在蛋白水平激活它。将Cre-ERT小鼠与flox小鼠进行交配繁
殖,再使用他莫昔芬便可以实现特定时间的基因敲除。
百奥赛图利用ES、EGE基因编辑技术可以制备flox鼠并开发了一系列Cre工具大小鼠,欢迎您前来咨询哦!
参考文献
[1] Zhang et al.Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology). 2012 13(7):511-524
搞定客户
[2] 封面图片来自Wikipedia.
BIOCYTOGEN USA