中国口岸科学技术
HPLC-ICP-MS法同时测定贝类中5种确形态化合物刘敏慧1谢思瑶£魏晓恒1胡业明勺许瀛丹2吴瑞茹2蒋小良，
摘要采用水-甲醇(1：1.V/V)溶液超声波辅助萃取.建立了同时快速测定贝类中碑胆.碱、碑甜菜碱、亚碑酸、碑酸和4-氨基苯肿酸等5种碑形态的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)分析方法.对萃取溶液浓度、超声波辅助萃取温度和时间等条件进行了优化选用Hamilton PRP-X100阴离子分析柱，以50mmol儿碳酸镀-甲醇(99：1,V/V)溶液为流动相，进行梯度洗脱对5种碑形态分离，并优化了质谱测试条件。试验结果表明，5种碑形态达到很好的分离效果，在质量浓度为0~100Ng/L的范围内与其对应的峰面积均具有良好的线性关系，线性相关系数卢均大于0.999，检出限在0.2~0.60p.g/L间，两水平样品加标回收率在90.5%~103.5%之间.方法的精密度在1.6%~4.2%之间。
关键词贝类；碑形态；高效液相色谱；电感耦合等离子体质谱法
Simultaneous Determination of5Arnic Species in
Shellfish by HPLC-ICP-MS
LIU Min-Hui1XIE Si-Yao1WEI Xiao-Heng1HU Ye-Ming1
XU Ying-Dan*12WU Rui-Ru2JIANG Xiao-Liang1,
Abstract A method was developed for the simultaneous and rapid determi n ation of arnic choline,arnic betaine,arnous acid,arnic acid and4-aminopheny1a rsonic acid in shellfish through high performance liquid chromatography一inductively coupled plasma mass spectrometry(HPLC-ICP-MS),with samples extraction by oscillating in water-methanol(1：1,V/V).The concentration of extraction solution,ultrasonic-assisted extraction temperature and time were optimized.An anion-exchange column(Hamilton PRP-X100)was found suitable the simultaneous paration inorganic and organic species.Five compounds were parated using50 m mol/L(NH4)2CO,-methanol(99：1,V/V)with a gradient elution,and ICP-MS conditions was optimized.The results showed that the five kinds of arnic species can reach the baline paration,and the arnic concentration in the range of0-100p.g/L is linear,
基金项目：江门市基础与理论科技计划项目(2020JC03020)
第一作者：刘敏慧(1969—)，女，本科，工程师，研究方向为食品及食品包装材料分析检测工作，E-mail：***************通讯作者：蒋小良(1979—)，男，硕士，高级工程师.研究方向为食品及食品包装材料分析检测工作，E-mail：****************
1.江门海关江门529000
2.中国检验认证集团广东有限公司江门分公司江门529000
1.Jiangmen Customs,Jiangmen529000狮子女和处女男
2.China Certification&Inspection and Group Guangdong Co.,Ltd Jiangmen Branch,Jiangmen529000
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with correlation coefficients(r-)of all more than0.999,and the detection limit was from0.2|x g/L to0.6p.g/L.The two levels of sample standard addition recovery rate range from90.5%to103.5%,the precision of the method is between1.6%to4.2%.
Keywords shellfish；arnic species；high performance liquid chromatography；inductively coupled plasma mass spectrometry
贝类是我国最重要的水产品之一，年产量高达1400万吨，贝类及其加工食品在我国渔业经济贸易中占
有极其重要的地位「％贝类中的重金属含量，与其生活的水体环境质量息息相关，常见的重金属污染有碑、汞、铅、镉等。由于贝类对碑的富集能力强，所以在贝类中碑含量高于其他水产品。人体吸入过量的碑会对免疫系统、神经系统和造血系统等造成一定的损伤问。碑对人体的毒性不仅仅与其含量有关，最主要的是由其存在的形态决定.日常中神形态主要有：碑胆碱（AsC）、亚碑酸［As（m）］、碑酸［As（V）］、碑甜菜碱（AsB）和4-氨基苯肿酸（p-ASA）等，其毒性依次为As（III）>As（V）>p-ASA>AsC>AsB同。
目前，碑形态分析主要方法有：高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法―叭高效液相色谱-原子荧光光谱法17-9〕、离子色谱-电感耦合等离子体质谱法⑷、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法I1"和原子荧光光谱法验-⑹等。本文采用超声辅助萃取的前处理方式，通过实验选择了0.5mmol/L（NH^CO.』-甲醇（99:1）为萃取溶液，在超声波条件下萃取后，利用高选择性、高灵敏度等高效液相色谱技术（HPLC）和电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）相结合，建立了同时快速测定贝类中5种碑形态的分析方法。
1材料与方法
1.1材料与仪器
碑胆碱（AsC）、碑甜菜碱（AsB）、亚碑酸［As（m）h 碑酸［As（V）］和4-氨基苯肿酸（p-ASA）
，均购自国家标准物质研究中心甲醇（TIDEA HPLC级，德国Merck公司）；碳酸钱（优级纯，德国默克Sigma-Aldrich公司）；冰乙酸（优级纯.广州化学试剂厂）7700X型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国安捷伦公司）；1100型高效液相色谱仪（LC，美国安捷伦公司）；BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国密理博公司）；S-18KS高速离心机（德国SIGMA公司）；XY-CS-HP高频率超声波清洗仪（上海昕仪仪器仪表有限公司）。
1.2试验方法用春暖花开造句
1.2.1样品前处理
取常见的海产贝类牡蛎、扇贝、文蛤等（均购于江门本地海鲜市场），取可食用部分进行均质后，再精密称取样品2.00g（精确至0.01g）于50mL塑料具塞刻度离心管中，加入30mL水-甲醇（l：l）（pH8.5）溶液，放置于80弋恒温超声波中，超声波萃取75min 后取出，冷却至室温后再加入2mL冰醋酸，用水定容至50mL，静置，取5mL上层溶液，用0.22“m水相滤膜过滤至10mL的离心管中，以转速为12000r/min 离心5min后，静置.吸取上清液至进样小瓶供高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪分析其碑形态" 1.2.2仪器工作条件
高效液相色谱仪工作条件和电感耦合等离子体质谱仪工作条件见表1，流动相A为水相.流动相B为50mmol/L（NH4）2CO-甲醇（99：l）（pH=8.5），梯度洗脱程序见表2，整个分析时长为20min。
表4仪器工作条件
Table1Instrument working conditions
项目参数
色谱柱Hamilton PRP-X100100(250mm x4mm,10jxm)
进样量20jiL
流速 1.0mL/min
RF功率1450W
采集模式时间分辨采集（TRA）
采集时间1500s
载气流速 1.0mL/min
辅助气流速0.2mL/min
雾化器同心玻璃雾化器
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表2梯度洗脱程序参数
Table2Parameters for procedure of gradient elution
序号时间/min A/%B/%
101000
221090
3100100
2结果与讨论
2.1样品前处理的优化
2.1.1萃取溶液的选择
考察不同萃取溶液萃取效率，试验了甲醇-水
(1：1,V/V).超纯水、水-乙酸(19：1,V/V)和0.5
mmol/L(NH4)2CO3-甲醇(99：1,V/V；pH=&5)等4
种常用的萃取溶液。采用超声波辅助萃取方式，设定
萃取温度80°C，萃取时间为50min,4种萃取溶液的
萃取效率实验结果见表3。
表3不同萃取溶液对5种碑形态萃取效果的影响
Table 3Effect of different extraction solutions on the
extraction of five arnic species
\^萃取溶液
萃取效率济、甲醇-水
(1：1,V/V)
超纯水
水-乙酸
(19：1,V/V)
0.5mmol/L
(nh4)2co3-甲醇
(99：1,V/V；pH=8.5)
白羊座女孩
AsC79.575.878.489.4
AsB80.279.683.692.4
As(ni)75.472.580.596.8
As(V)86.476.578.688.4
p-ASA79.478.479.593.6
由表3可见，实验选择的4种萃取溶液对贝类样品中5种碑形态的萃取效率存在明显差异，其中采用0.5 mmol/L(NH4)2CO-甲醇(99：1.V/V；pH=&5)萃取溶液的萃取效率明显高于其他3种萃取溶液，因此，实验选择的萃取溶液为0.5mmol/L(NH4),CO-甲醇(99：1)。2.1.2萃取温度的选择
选择0.5mmol/L(NH4)2CO-甲醇(99：1,V/V；pH=8.5)为萃取溶液，采用超声波辅助萃取方式，分别考察萃取温度为50°C.60°C.70°C.80弋和90弋时，对贝类中5种碑形态萃取效果的影响，实验结果见表4：
表4萃取温度对5种碑形态萃取效果的影响
Table4Effect of extraction temperature on the extraction
of five arnic species
^度/°c
萃取效率洽、
5060708090 AsC65.475.689.295.495.3
AsB59.870.488.696.296.5
As(IlI)63.574.587.493.594.2
红米怎么刷机As(V)65.276.491.594.894.3
p-ASA5&669.586.595.294.8
由表4可见，随着萃取温度的升高，5种碑形态萃取效率不断提高，当温度达到8CTC时，5种碑形态的萃取效率基本达到最大值.继续升高萃取温度到90°C，超声波辅助萃取基本达到了动态平衡。所以.
本实验选择的萃取温度为80°C o
2.1.3萃取时间的选择
采用超声波辅助萃取方式，选择0.5mmol/L (NH4)2CO-甲醇(99：1,V/V；pH=&5)为萃取溶液，固定萃取温度为80°C，分别考察萃取时间为30min、45min、60min、75min和90min日寸，又寸5种碑形态萃取效果的影响，实验结果见表5。
表5萃取时间对5种碑形态萃取效果的影响
Table5Effect of extraction time on the extraction of five
arnic species
时间/min
萃取效
2030404550 AsC68.486.296.196.296.6
AsB72.689.696.496.196.5
As(ni)64.584.495.295.895.7
As(V)66.486.594.995.495.9
p—ASA69.383.595.495.696.2
由表5可见，随着萃取时间的不断加长，5种碑形态萃取效率不断提升.当萃取时间为40-50min
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时，5种碑形态的萃取效率基本上达到最大值，因此，
实验选择最佳的萃取时间为45min
2.2射频功率优化
仪器推荐最佳的射频功率是1550W，主要是综
合考虑了对轻质量元素、中质量元素、重质量元素
的影响本实验只是检测75As，为了验证对于As元
素的最佳射频功率实验考察了射频功率为1000、
1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、
1400、1450、1500、1550、1600W对应的灵敏度及
氧化物、双电荷情况。实验结果表明，灵敏度随着射
频功率的增加呈现先增后略减的趋势，当射频功率在
1450-1500W时，灵敏度最高，选择最佳射频功率
车中
为1450W o
2.3线性方程和检出限
按照1.2.2仪器工作条件及相关分析方法，分别进
样5种神形态化合物混合标准工作溶液进行分析，碑胆
碱(AsC)等5种碑形态混合标准工作溶液质量浓度依次
为0、10、20、40、60、80、100|xg/L o5种碑形态化合
物的色谱图如图1所示，以质量浓度为横坐标(x)，对
应的峰面积为纵坐标(y)绘制标准工作曲线，并进行线
性回归见表6，结果表明5种碑形态在0~100|xg/L范
围内具有良好线性关系.相关系数均大于0.999。
表65种碑形态化合物线性参数及检出限
Table6Linear parameters and detection limits of five
arnic compounds
组分线性方程相关系数/r 线性范围/
(p-g/L)
检出限/
(|xg/L)
AsC y=6506.5x+45.60.99990~1000.5
AsB y=4765.2x-112.20.99980~1000.3
As(m)y=3812.6x+125.40.99980~1000.2
As(V)y=6215.8x-98.20.99980~1000.5
p-ASA y=3652.8x+86.50.99990~1000.6
2.4方法学验证
为了验证所建立方法的准确性，随机抽取贝类样品进行精密度和加标回收率的考察。取空白样品6份分别添加两个不同浓度水平的5种神形态的混合标准溶液，结果见表7。
表7加标回收率及精密度结果
Table 7Recovering rate and precision of Standard Sample 注:n=6,ND=Not detectable
组分含</(p.g/L)
加标水平/
(p-g/L)
平均检测值/
(p-g/L)
平均回收率/
%
RSD/%
2018.793.5 3.8 AsC ND
6056.794.5 2.4
2018.190.5 4.2 AsB ND
6056.193.5 2.8
2018.492.0 3.6 As(m)ND
6055.993.2 2.7
2020.7103.5 3.4 As(V)ND
6058.697.7 1.8
2018.592.5 2.8
p-ASA ND
6061.4102.3 1.6
由表7可以看岀，5种碑形态的两个水平梯度加标回收率为90.5%~103.5%，说明该方法具有较高的准确性和测试可靠性。
xlO4
Ks(V)证券分析
As an)
4-
&012.0
保留时间Sin)
图15种碑形态混合标准溶液的色谱图
Fig.1Chromatograms of mixed standard solutions of five
arnic species
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2.5样品分析
按照1.2.1实验方法对海螺、毛蛤和尖螺等三种 贝类样品进行前处理，并按照122仪器工作条件进
行测定.每个样品平行测定11次，取其平均值为测 定结果，并同采用标准方法GB 5009.11-2014测定值
进行比较，结果见表8。
表8样品分析结果
Table 8 Analytical results of samples ( p g/kg )
注：n=l 1, ND = Not detectable
测项目
样品名
本文
方法
海螺
毛蛤
GB 5009.11
尖螺
GB 5009.11
本文
方法
本文
方法
GB 5009.11
AsC 7.367.44ND ND 10.210.5
AsB ND ND
12.6
12.1
9.569.44As(fll)
ND ND ND ND ND ND As(V)10.49.868.598.6510.610.8
p-ASA
&43
8.52
9.06
9.14
ND
ND
由表8可见，采用本方法测定海螺、毛蛤和 尖螺等三种贝类样品中5种碑形态的结果，同GB
海鸥老人5009.11-2014测定结果基本上一致。
3结论
以 0.5 mmol/L (NH 4),CO.厂甲醇(99：1, W ； pH=8.5)
为萃取溶液，采用超声波辅助萃取方式，建立了高效 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS ) 测定贝类中碑胆碱、碑甜菜碱、亚碑酸、碑酸和4-
氨基苯肿酸等5种碑形态的分析方法。对超声波辅助
萃取温度和时间进行了试验，并对质谱条件RF 功率 进行了优化，选择最佳RF 功率为1450 W，大大提高
了5种形态碑的检测灵敏度。考察了该方法的线性关 系、检出限和精密度等。实验表明，两水平加标回收
率在90.5% ~ 103.5%之间，相对标准偏差在1.6% ~ 4.2% 之间，该方法具有操作简便、灵敏度高、精密度好等优 点，适用于贝类水产品中5种碑形态的分析。
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(文章类别：CPST-B )
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