科研⼲货⼁⼿把⼿教你做PCR引物设计！
在整个PCR体系中，引物占有⼗分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他⾮⽬的的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能与引物进⾏有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。
⼀、PCR引物设计原则
1、引物长度⼀般在15-30bp
引物长度⼀般为15-30bp，常⽤的为18-27bp，但不应⼤于38bp，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应；
2、引物GC含量⼀般为40%-60%
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引物GC含量⼀般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过⾼或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右
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Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，⾄少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method)；
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4、引物3’端的碱基⼀般不⽤A
引物3’端的碱基⼀般不⽤A，因为A在错误引发位点的引发效率相对⽐较⾼。
5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
6、引物3’端的互补、⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
7、如扩增编码区域，引物3’端不要终⽌于密码⼦的第3位，因密码⼦的第三位易发⽣简并，会影响扩增特异性与效率；
8、引物5’端可以修饰
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引物5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物。
9、碱基要随机分布，且引物⾃⾝和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错误引发。降
低引物与模板相似性的⼀种⽅法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物⾃⾝不应存在互补序列，否则引物⾃⾝会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本⾝复性。这种⼆级结构会因空间位阻⽽影响引物与模板的复性结合。引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3’端的互补重叠以防⽌引物⼆聚体（Dimer与Cross Dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物⼆聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过⾼（应⼩于4.5kcal/mol）。否则易导致引物⼆聚体带的 产⽣，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏。
10、引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼。
ΔG值（⾃由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，⼀般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，⽽5’端和中间ΔG 值相对较⾼。3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
11、引物应在核酸保守区内设计并具有特异性。引物与⾮特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
⼆、Real Time PCR引物设计原则
Real Time PCR⽤引物与普通PCR引物设计要求不同。RealTime PCR是让⽬的基因按照理论值进⾏扩增，对⾮特异性反应和引物⼆聚体要求严格。
三、常⽤的引物设计软件
“Primer premier”，“Oligo”，“Vector NTI Suit”，“DNAsis”，“Omiga”和“DNAstar”。插播：后台回复【引物设计软件】即可Oligo/DNAstar/Primer premier5/6/DNAstar软件。
下⾯详细介绍⼀下Primer premier 5.0的⽤法：
1、通过File下的New或Open载⼊需要设计引物的序列
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2、进⼊到程序的引物设计窗⼝
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3、点击arch，则出现新的界⾯
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蜡笔总动员在新界⾯设置你需要设计的引物的相关参数。主要有五个要设置的地⽅。
第⼀个地⽅是选择设计PCR引物，测序引物和杂交探针，如果要做PCR就选第⼀个圈圈“PCR Primers”。
第⼆个地⽅是搜寻模式，⼀般我们搜索引物是以对搜索，所以⼀般选"pairs"。
第三个地⽅是正负链的所在区间以及产物的⼤⼩长度，这个按⾃⼰的需要来，跟实验⽬的有关，具体情况具体分析。第四个地⽅是引物的长度以及正负波动值，⼀般来说引物长度在18-27范围内。第五个地⽅是选择模式，⼀般选“Automatic”。设置完上⾯所说的这些地⽅后按“OK”键，则跳转到新界⾯。
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4、点击“OK”，出现如下新界⾯
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显⽰结果按照评估分数从⾼到低向下排列， ⼀般选取评估分数较⾼的结果。打分是衡量引物质量的综合性参数，利⽤打分系统可以对引物进⾏有效评估和引物间进⾏对⽐选择提供有效的证据。如果我们只想要寻找正向或反向的引物，就可以选择“Sen”或“Anti-n”按钮。
5、点击评分⾼的结果，就可以显⽰引物的详细信息，如下图。
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该图左上⾓的两个按钮
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和
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分别代表的是正向和反向引物。该图中间部分给出了引物的得分，位置，长度，Tm值，GC含量，⾃由能等信息。该图最下⾯的模块给出了正反
引物是否形成发夹结构，⼆聚体，错配以及引物之间的⼆聚体等情况，红⾊代表有。点击
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我们会看到出现这些结构的具体信息，⽐如开始的位置，产⽣的⾃由能。
6、如果我们对搜索到的引物不满意，可以⼿动调整引物的位置，同时可以点击
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的按钮对引物进⾏修改。如下图，我们可以增加，删除或修改碱基。直到找到最佳的结果。
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7、最后将设计好的引物导出或复制出来。
四、推荐⼏款在线引物设计⽹站
1、Primer3
⼀个⼴泛使⽤的PCR引物设计程序。
2、Primer-BLAST
