蛋白A/G层析介质（4FF）
Protein A/G Beads 4FF
货号规格
BDTL0021-5 5ml
BDTL0021-25 25ml
BDTL0021-200 200ml
1.产品介绍
本品是将重组蛋白A/G高密度定向偶联到琼脂糖凝胶微球表面，具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。产品性能见表1。
本品主要用于免疫沉淀（IP）以及免疫共沉淀（Co-IP）研究，也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择微球的类别，蛋白A、蛋白G和蛋白A/G与不同抗体的亲和性比较参见表2。
表1 蛋白A/G层析介质（4FF）性能
指标性能
基质高度交联的4%琼脂糖微球
配体重组蛋白A/G
载量~10mg人lgG/ml介质
粒径(μm)45-165
最大流速0.1 MPa, 1 bar
pH 稳定范围3-10
储存缓冲液与层析介质等体积的1×PBS（含20%乙醇）
储存温度2-8℃
表2.Protein A、Protein G和Protein A/G对不同抗体的结合能力种属亚型Protein A Protein G Protein A/G
Human IgA Varible - ++ IgD - - -
IgE - - - IgG1 ++++ ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ ++++ IgG3 - ++++ ++++ IgG4 ++++ ++++ ++++ IgM Varible - ++
数学趣味小知识Avian egg yolk IgY - - - Cow ++ ++++ ++++ Dog ++++ ++ ++++ Goat - ++++ ++++
Guinea pig IgG1 ++++ ++ ++++ IgG2 ++++ ++ ++++
人皆有之
Hamster + ++
Hor Total IgG ++ ++++ ++++ Koala - +
Liama - +
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Monkey (rhesus) ++++ ++++ ++++
Mou IgG1 + ++++ ++ IgG2a ++++ ++++ ++++ IgG2b +++ +++ +++ IgG3 ++ +++ +++ IgM Variable - -
Pig +++ +++ ++++ Rabbit Total IgG ++++ +++ ++++小学三年级周记
Rat IgG1 - + ++ IgG2a - ++++ ++++ IgG2b - ++ ++ IgG3 + ++ ++
Sheep Total IgG +/- ++ ++ ++++ 结合能力强；++ 结合能力中等；- 结合能力弱或没有结合
2.纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45 μm滤膜过滤。
结合/洗杂Buffer：0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH 7.0
洗脱Buffer：0.1M甘氨酸，pH 3.0
中和液：1MTris-HCl，pH 8.5
交联Buffer：0.2M 三乙醇胺，pH 8.2
终止液：50mM Tris，pH7.5
2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
对于100 mm培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，使用预冷PBS洗涤一次后加入2ml细胞裂解液裂解细胞。对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。植物或动物组织样品可以使用液氮研磨方法裂解。具体的裂解方法请参考不同裂解液的使用说明，裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1μg/μl范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同，需要对总蛋白浓度进行预实验调整。
2.3 去除非特异性结合（可省略）
1)取200μl至1ml蛋白样品，加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的Normal IgG和20μl充分重
悬的本品，4℃缓慢摇动30分钟。
贵州四大古镇2)2500 rpm（约1000g）离心1min，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG发生结合，可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用normal IgG和本品对裂解液预处理可以降低非特异性吸附。
2.4 免疫沉淀操作流程
免疫沉淀直接法操作流程示意图如下：
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2.4.1. 抗体吸附
1)取适量的本品加入到2ml 离心管中，500rpm离心1min，吸弃上清。
2)加入0.5ml结合Buffer，悬浮层析介质（使层析介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白
的作用），500rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。
3)向步骤2) 平衡的层析介质中加入抗体溶液，悬浮层析介质，室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转
离心管，约30min后，500rpm离心1min，收集上清液，留待检测。
4)向3) 的层析介质中加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮层析介质，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，
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500rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。
2.4.2抗体交联（可选）
如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行2.3.3。
1)向清洗过的层析介质中加入1ml交联Buffer，500rpm离心1min，吸弃上清。
2)再向其中加入1ml 20 mM DMP（dimetyl pimelimidate dihydrochloride）的交联Buffer，此试剂需要现用
现配，悬浮层析介质，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使Buffer和层析介质充分接触，约30min后，500rpm离心1min，吸弃上清。
3)再向其中加入1ml终止液，悬浮层析介质，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻
转离心管，约15min后，500rpm离心1min，再吸弃上清。
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4)加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮层析介质，进行清洗，500rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。2.4.3抗原沉淀反应
1)抗原吸附：加入含有抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与层析介质-抗体复合物均匀分散。在室温
下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。
2)洗杂：将上述完成抗原吸附的层析介质-抗体-抗原复合物进行离心，500rpm离心1min，收集上清液，
置于冰上以备后续检测。向离心管中加入1ml 洗杂Buffer，用移液器轻轻吹打使层析介质-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行离心分离，500rpm离心1min，弃上清液。再重复洗涤两次。最后加入1ml 洗杂液，用移液器将层析介质-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 ml 离心管中，并进行离心分离，500rpm离心1min，弃上清液。
3)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，500rpm离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western分析。
非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心
管，10min 后，离心，500rpm离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。
2.5免疫共沉淀操作流程
1)抗体与抗原混合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温震荡孵育30-60min，或者2-8度孵育过
夜，取决于抗体与抗原的结合效率以及抗原的稳定性，需要自己优化结合条件。形成抗原-抗体混合物。
注意：抗体的加入量要考虑到下面层析介质的量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混合物与层析介质的结合。建
