基金项目：天津市科委重点资助项目（项目编号：09JCZDJC20200）；天津市卫生局重点攻关项目（项目编号：06KG09）作者单位：300070天津医科大学研究生院2009级
（李家林）；300192天津市第一中心医院神经外科
（罗仲秋），卫生部危重病急救医学重点实验室（徐新女）；33613美国南佛罗里达州州立大学阿尔茨海默病研究中心（曹传海）；300060天津市环湖医院神经外科（王金环）
通讯作者：王金环（Email ：************************ ）
李家林
罗仲秋
徐新女
曹传海
王金环
突变型A β1~42致敏树突状细胞疫苗治疗阿尔茨海默病
转基因鼠作用机制探讨
【摘要】研究背景β⁃淀粉样蛋白在脑组织中沉积是阿尔茨海默病的典型病理特征之一，
免疫疗法虽可有效清除β⁃淀粉样蛋白，但在治疗的同时也伴随出现一些不良反应。为了避免疫苗治疗过程中产生的严重不良反应如脑膜脑炎等，尝试采用突变型β⁃淀粉样蛋白（A β1~42）致敏树突状细胞制备阿尔茨
海默病疫苗，并在充分评价其安全性和有效性的基础上，进一步探讨其治疗阿尔茨海默病转基因鼠的作用机制。方法
提取C57/B6小鼠胫骨和股骨树突状细胞，分别以突变型A β1~42致敏树突状细胞
（实验组）和经弗氏佐剂免疫的野生型A β1~42多肽（佐剂阳性对照组）制备疫苗，然后接种于阿尔茨海默病转基因鼠。免疫组织化学染色观察小鼠脑组织中核激素肝X 受体（LXR ）、三磷酸腺苷结合盒转运子1
（ABCA1）、CD45、晚期糖基化终产物受体（RAGE ）和β⁃分泌酶（BACE ）表达水平，体视学法半定量检测海马区CA1、CA2、CA3、DG 、Rad 和皮质区阳性神经元。结果
与阴性对照组相比，实验组和佐剂阳性对照
组转基因鼠脑组织β⁃淀粉样蛋白表达水平显著降低（P =0.000），阴性对照组治疗前后无变化；经突变型A β1~42致敏的树突状细胞疫苗治疗后，
转基因鼠脑组织中的LXR 、ABCA1、CD45和BACE 表达水平升高（P =0.000），RAGE 表达水平降低
（P =0.000）。结论经突变型A β1~42致敏树突状细胞制备的疫苗可通
swana过多种因素的相互作用使阿尔茨海默病转基因鼠大脑β⁃淀粉样蛋白代谢达到新的免疫平衡，从而减少其在脑组织中的沉积，且无脑膜脑炎等严重不良反应，此与LXR/ABCA1通道作用有关。树突状细胞自身也在清除β⁃淀粉样蛋白的过程中扮演着预防不良反应发生的重要角色。
【关键词】阿尔茨海默病；树突细胞；淀粉样β蛋白；肽类；接种；疫苗DOI ：10.3969/j.issn.1672⁃6731.2012.03.016
The role of mutated amyloid beta 1⁃42stimulating dendritic cells in a PDAPP transgenic mou
LI Jia ⁃lin 1,LUO Zhong ⁃qiu 2,XU Xin ⁃nü3,CAO Chuan ⁃hai 4,WANG Jin ⁃huan 51
Grade 2009,Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China 2
Department of Neurosurgery,3Key Lab for Critical Care Medicine of the Ministry of Health,Tianjin First Center Hospital,Tianjin,300192,China 4
USF/Byrd Alzheimer's Institute,University of South Florida,Tampa,FL 33613,USA 5
Department of Neurosurgery,Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,China Corresponding author:WANG Jin ⁃huan (Email:************************)
【Abstract 】Background Amyloid plaque is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's dia (AD).Anti ⁃beta ⁃amyloid (A β)immunotherapy is effective in removing brain A β,but has shown to be associated with detrimental effects.To avoid vere adver effects such as meningoencephalitis induced by amyloid beta vaccine with adjuvant,and take advantage of amyloid beta antibody's therapeutic effect on Alzheimer's dia sufficiently,our group has developed a new Alzheimer vaccine with mutated amyloid beta 1-42peptide stimulating dendritic cells (DC).Our previous work has confirmed that DC vaccine can induce adequate anti ⁃amyloid beta antibody in PDAPP Tg mice safely and efficiently.The DC vaccine can improve impaired learning and memory in the Alzheimer's animal model,and did not cau microvasculitis,microhemorrhage or meningoencephalitis in the animal model.However,the exact mechanism of immunotherapy which reduces A βdeposition remains unknown.In this report,we studied the mechanism
·基础研究·
of the vaccine,thinking that this may have implications for better understanding of the pathogenesis of Alzheimer's dia.Methods A new Alzheimer vaccine with mutated amyloid beta1-42peptide stimulating DC which were obtained from C57/B6mou bone marrow was developed.Amyloid beta with Freund's adjuvant was inoculated at the same time to act as positive control.After the treatment was done, the samples of brains were collected,fixed,cut.Immunohistochemical staining was performed to obrve the expression of the nuclear hormone liver X receptor(LXR),membrane⁃bound protein tyrosine phosphata(CD45),the ATP⁃binding castte family of active transporters(ABCA1),receptor for advanced glycation end products(RAGE),β⁃site APP⁃cleaving enzyme(BACE)and Aβin mou brain tissue.Semi⁃quantitative analysis was ud to defect CA1,CA2,CA3,DG,Rad in hippocampus region and positive neuron in cortex region.Results Aβwas significantly reduced in the experimental group and the positive control group(P=0.000),but no changes were en in the negative control group.The levels of LXR, ABCA1,CD45,BACE expression were significantly higher in the PFDM group with DC vaccine treatment and the levels of RAGE were lower than tho in the control group.Conclusion The reduction of Aβvia the DC vaccine occurs through multiple factors to achieve a new immune balance.The beneficial results of DC vacci
ne,which did not produce side effects,may be caud by the LXR/ABCA1path.DC alone may play an important role in clearing the Aβto prevent the occurrence of adver reaction.
【Key words】Alzheimer dia;Dendritic cells;Amyloid beta⁃protein;Peptides; Vaccination;Vaccines
Fund Project:Key Project of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No.09JCZDJC20200);Key Project of Tianjin Public Health Bureau(No.06KG09)
阿尔茨海默病（AD）为临床常见的中枢神经系
统退行性病变，其典型病理学表现为β⁃淀粉样蛋白
怎么确定狗狗怀孕了（Aβ）沉积、神经原纤维缠结（NFTs）形成、神经元减
少，以及轴索和突触异常、颗粒空泡变性等。目前
针对阿尔茨海默病的治疗仅限于缓解临床症状，尚
无特殊的有效方法。以往也曾采用免疫疗法治疗
银烛秋光冷画屏
阿尔茨海默病，通过减少Aβ在脑组织中的沉积而改
善临床症状，1999年由美国Elan公司研制成功的首
株Aβ疫苗［Elan's AN⁃1792，由野生型Aβ配伍佐剂
（QS21）配制而成］经美国食品与药品管理局（FDA）
批准进入Ⅱ期临床试验，其结果显示，经免疫接种
后可使绝大多数患者临床症状得到明显改善。但
是在随后的试验中，由于有6%的患者出现自发性
脑膜脑炎而被迫停止临床应用［1］，经证实其反应源
来自其中的佐剂成分［2］。为了避免疫苗中佐剂引起
的不良反应，2008年Cao等［3］选用树突状细胞制成
不含佐剂的树突状疫苗，接种于阿尔茨海默病转基
因鼠［BALB/c和APP（SW）］取得一定疗效，且未发
现明显不良反应。为了进一步研究该疫苗的药理
作用机制，在本项研究中我们对多种与Aβ清除通道
蛋白相关因子进行动物实验观察，包括核激素肝X
受体（LXR）、三磷酸腺苷结合盒转运子1（ABCA1）、CD45、β⁃分泌酶（BACE）和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）等。载脂蛋白E为迟发型阿尔茨海默病
的主要遗传学危险因素，而LXR可通过调节细胞内
心中的她
胆固醇及载脂蛋白水平和输出量而影响阿尔茨海
默病的发病机制［4］；ABCA1既为LXR的主要靶点之
一，又是三磷酸腺苷结合盒中的活性转运蛋白，为
介导反向胆固醇限速步骤的重要运输途径［5］；β⁃分
职工小家建设泌酶作为γ⁃分泌酶的四聚体，可在酶处理β⁃淀粉样
前体蛋白（APP）的加工过程中作为APP转变为非淀
粉样蛋白形成状态的通路，或作为APP与Aβ形成之
间的穿梭机制，通过阻断Aβ的生成而抑制其在脑组
织中的沉积［6］。此外，根据阿尔茨海默病“炎症因子
假说”，炎症亦为阿尔茨海默病发病机制之一，而CD45正是脑内炎症即神经小胶质细胞激活的标志蛋白质，为作用于T细胞、B细胞和小神经神经元的
由抗原受体介导的信号肽，在阿尔茨海默病患者的
脑组织中可见到以p38有丝分裂原激活蛋白激酶
（MAPK）或p44/42MAPK信号转导为特征的神经小
胶质细胞激活［7］。正常脑组织存在使Aβ由外周血
转运至大脑或从大脑至外周血的平衡机制，通过以
内皮低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）和P⁃糖蛋
白（P⁃gp）为Aβ输出蛋白负责将其转运至外周血，RAGE则将Aβ转运至大脑［8］。而阿尔茨海默病患者的这种平衡机制破坏，使Aβ输入量超过输出量，因此在脑组织中沉积导致神经原纤维缠结形成。
材料与方法
一、实验材料
式微式微胡不归1.试剂与药品（1）实验肽蛋白：F和D双突变多肽（PFDM）性Aβ1~42由美国佛罗里达州阿尔茨海
默病研究中心曹传海博士惠赠，野生型Aβ1~42多肽购自美国Sigma公司，完全与不完全弗氏佐剂（Freund's adjuvants）为美国波士顿生物技术公司产品。（2）实验所需抗体：Ⅰ抗工作液［为小鼠抗人Aβ6F/3D（1∶50）、兔抗人LXR（1∶100）、兔抗人ABCA1（1∶200）、小鼠抗人CD45（1031G，1∶50）、小鼠抗人RAGE（1∶100）和小鼠抗人β位点APP内切酶BACE （1∶200）单克隆抗体］中抗体分别购自美国Vector、Abcam、Novus、AbD Serotec和Santa Cruz公司；即用型SABC免疫组织化学试剂盒［含生物素化大鼠抗小鼠、生物素标记大鼠抗兔IgGⅡ和辣根过氧化物酶标记链酶菌卵白素Ⅱ抗，工作浓度均为（1∶500）］由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。（3）其他试剂：重组小鼠白细胞介素⁃4（IL⁃4）和粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子（GM⁃CSF）由美国R&D公司提供。RPMI⁃1640细胞培养基购自美国Gibco公司。纯胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。树突状细胞培养基由终浓度为100U/ml的青霉素和链
霉素及含体积分数为0.1%的2⁃巯基乙醇和10%胎牛血清的RPMI⁃1640培养基配制而成。
2.实验动物清洁级（SPF组）PDAPP V717I转基因鼠48只，雌雄各24只，12月龄，体质量约为30g，购于中国医学科学院实验动物研究所。小鼠经耳后打孔编号，随机数字表法分为PFDM组（接种经PFDM Aβ1~42多肽致敏的树突状细胞疫苗，12只）、佐剂组（接种经弗氏佐剂免疫的野生型Aβ1~42多肽疫苗，为阳性对照组，12只）、DC组（接种未经多肽致敏的树突状细胞，为PFDM阴性对照组，12只）和PBS组（注射磷酸盐缓冲液，为佐剂组阴性对照组，12只）。另选择与PDAPP V717I具有相同遗传背景的健康8周龄雌性小鼠（C57/B6小鼠，普通洁净级）共50只，用于树突状细胞的培养，购于解放军军事医学科学院实验动物中心。所有小鼠实验前均于实验室正常环境（12h白昼-12h夜晚，常温26℃）、按性别、正常饮食分笼饲养。
二、实验方法
1.疫苗制备与接种（1）经PFDM Aβ1~42多肽致敏的树突状细胞疫苗的制备：50只C57/B6小鼠迅速脱颈处死（每次5只），消毒后于无菌台内切取股骨和胫骨，RPMI⁃1640培养基冲洗骨髓腔，200目筛网过滤，离心半径16cm、1500r/min离心5min。弃上清液，滴加适量红细胞裂解液，震荡30s后加入Hank缓冲液终止反应；再次1500r/min离心5min。弃上清液，加入树突状细胞培养基（含质量浓度为5.50ng/ml的IL⁃4和GM⁃CSF）稀释细胞密度至1×106/ml，细胞悬液移至6孔板，37℃、体积分数为5%
二氧化碳培养箱继续培养至第4天，剔除不贴壁细胞，滴加含PFDM Aβ1~42多肽、质量浓度为20μg/ml 的RPMI⁃1640培养基；第8天时收获致敏树突状细胞疫苗，储存于⁃80℃冰箱备用。（2）以弗氏佐剂免疫的野生型Aβ1~42多肽疫苗的制备：磷酸盐缓冲液稀释野生型Aβ1~42多肽至质量浓度为50μg/100μl，将弗氏佐剂37℃水浴，融化为液态后与等体积的野生型Aβ1~42多肽溶液混合，涡旋30min，直至呈淡黄色乳状物，现配现用。（3）免疫接种：取出疫苗、解冻，浓度为0.10mmol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.4）冲洗3min（×3次），调整细胞密度至1×106/ml后行腹腔注射，各组动物均间隔2周注射1次，共注射3次，每次注射体积为0.20ml/只。
2.免疫组织化学染色观察致敏小鼠皮质和海马区蛋白质表达变化（1）脑组织切片的制备：水合氯醛（0.01ml/g）腹腔注射麻醉小鼠，暴露心脏、剪开右心耳经左心室灌注生理盐水50ml，以质量浓度为4%多聚甲醛溶液50ml固定、切取海马，经质量浓度为4%多聚甲醛溶液固定后脱水、石蜡包埋，行层厚为4μm的连续冠状切片，45℃水中展片捞起、40℃烤片过夜。（2）免疫组织化学染色：采用SABC法进行免疫组织化学染色［2］。脑组织切片脱蜡至水，经体积分数为3%过氧化氢反应10min以消除内源性过氧化物酶活性，0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液92~ 98℃反应30min修复抗原，质量浓度为5%胎牛血清封闭30min，滴加Ⅰ抗、4℃过夜；磷酸盐缓冲液冲洗后滴加生物素化Ⅱ抗（1∶500），于37℃反应30min，再次磷酸盐缓冲液冲洗，加入碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液（1∶200），再于37℃反应30min；DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。每组各选择1张脑组织切片，以磷酸盐缓冲
液取代Ⅰ抗作为阴性对照。低倍镜（×100）下观察显色情况，以目标区域神经元呈棕黄色或黄色者为阳性细胞。（3）半定量分析：于高倍镜（×400）下随机选择海马CA1、CA2、CA3、DG、Rad及皮质区进行灰度分析，灰度值由0（黑色）至255（白色），灰度值越高，蛋白质表达越强。
三、统计分析方法
采用SPSS16.0统计软件进行数据计算与分
析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数（灰度值）间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较行LSD⁃t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。
结果
一、致敏小鼠皮质与海马区蛋白质表达变化
1.Aβ蛋白免疫组织化学染色显示，Aβ主要表达于细胞膜，偶见细胞质，呈淡黄色、黄色或棕黄色颗粒状，阳性细胞主要分布于海马和皮质。其中PFDM组和佐剂组小鼠海马和皮质呈弱表达或不表达，DC组和PBS组小鼠呈高表达（图1）。
2.LXR蛋白不同处理组小鼠大脑皮质神经元胞质均表达LXR蛋白，为浅黄色、黄色或棕黄色颗粒状，
呈点状或弥散分布，不同处理组表达水平强弱不一，由高至低依次为PFDM组、DC组、佐剂组和PBS组（图2）。
3.ABCA1蛋白不同处理组小鼠海马区可见大量ABCA1表达阳性细胞，表达部位主要位于神经元胞膜，偶可见于胞核，为浅黄色、黄色或棕黄色颗粒状，呈点状或弥散分布；表达强度由强至弱，依次为PFDM组、DC组、佐剂组和PBS组（图3）。
4.CD45蛋白CD45蛋白在不同处理组小鼠脑组织中均有表达，主要见于海马区神经元胞质，胞膜亦偶有表达，为浅黄色、黄色或棕黄色颗粒状；大脑皮质中呈点状或弥散分布，其他部位也可见散在分布（图4）。
观察的作文5.RAGE蛋白不同处理组小鼠海马区神经元均可见RAGE蛋白染色阳性细胞，主要表达于细胞膜，偶见胞质和胞核，为淡黄色或黄色颗粒状物质；脑皮质仅呈点状或灶状分布（图5）。
6.BACE蛋白BACE蛋白主要表达于小鼠海马区神经元胞膜，偶见胞核染色阳性，为黄色或棕黄色颗粒；大脑皮质仅呈点状或弥散分布（图6）。
二、半定量分析
PFDM组和阳性对照组（佐剂组）转基因鼠皮质区和海马区神经元Aβ蛋白表达水平与阴性对照组（DC
组和PBS组）相比降低（P=0.000），而PFDM组与佐剂组（即树突状细胞疫苗与佐剂疫苗）之间比较，差异无统计学意义（P=0.539）；两阴性对照组（DC组与PBS组）比较，差异亦无统计学意义（P= 0.108，表1）。
我国领土总面积
PFDM组转基因鼠皮质和海马区LXR蛋白表达水平升高，高于DC组11.66%（P=0.031）；而DC组LXR蛋白表达水平则分别高于佐剂组和PBS组，约升高73.96%（P=0.031）和70.47%（P=0.000，表1）。
与DC组相比，PFDM组转基因鼠皮质区和海马区ABCA1蛋白表达水平升高，约为DC组的2倍（P=0.000）；而佐剂组和PBS组则表达水平下降，且低于DC组（P=0.000，表1）。
PFDM组转基因鼠皮质和海马区CD45蛋白表达水平升高，与佐剂组相比约升高16.70%（P= 0.001），而佐剂组表达水平分别高于DC组和PBS组73.98%（P=0.000）和73.75%（P=0.000，表1）。
与PBS阴性对照组相比，PFDM组、佐剂组和DC组转基因鼠皮质和海马区RAGE蛋白表达水平分别降低62.84%（P=0.000）、87.55%（P=0.000）和57.22%（P=0.000）；但PFDM组与DC组之间差异无统计学意义（P=0.172，表1）。
与PBS阴性对照组相比，佐剂组转基因鼠BACE蛋白表达水平升高17.87%（P=0.046）；与DC 组相比，PFDM组转基因鼠BACE蛋白表达水平升高19.16%（P=0.031，表1）。
讨论
有研究表明，转基因鼠无论是接受主动免疫治疗还是被动免疫治疗，其脑组织中沉积的Aβ均可于数日内被清除，与之相伴随的是认知功能得到显著改善［9⁃10］。从本研究免疫组织化学染色结果亦可看出，在不同处理方法中，以PFDM Aβ1~42致敏的树突状细胞疫苗组PDAPP V717I转基因鼠脑组织中的Aβ沉积减少程度最为明显，其表达水平甚至低于野生型Aβ1~42佐剂疫苗组。而野生型Aβ1~42佐剂疫苗即是类似AN⁃1792临床试验中的疫苗，后者由于在临床试验中有约6%的患者发生自发性急性脑膜脑炎而被迫停止试验。树突状细胞疫苗能够有效抑制Aβ在脑组织中的沉积，且不过分激活神经胶质细胞和T细胞，从而保证了疫苗的安全性［3］。
Aβ是阿尔茨海默病的主要病理特征之一，是干预治疗阿尔茨海默病的重要靶分子，可通过预防其形成和积聚或促进其清除而达到治疗目的。LXR 通过调节细胞内胆固醇的输入与输出进而影响阿尔茨海默病的进程［4］，有研究显示，采用LXR激动药GW3965治疗老龄化Tg2576小鼠可致敏脑组织
图1光学显微镜观察所见免疫组织化学染色
（SABC 法）×4001a PFDM 组小鼠海马区弱表达或不表达A β1b 佐剂组小鼠海马区弱表达或不表达A β1c DC 组小鼠海马区高表达A β1d PBS 组小鼠海马区高表达A β1e PFDM 组小鼠大脑皮质弱表达或不表达A β1f 佐剂组小鼠大脑皮质弱表达或不表达A β1g DC 组小鼠大脑皮质高表达A β1h PBS 组小鼠大脑皮质高表达A β
Figure 1Images were obrved under light microscope Immunohistochemistry (SABC)×400Weak or even no expression of A β1a 1b
1d
1c 1e 1f
1h
1g
