人类肠道病毒71型衣壳蛋白全基因成和原核表达分析
研究
目录
意识的特征摘要 2
Abstract. 4
前言7
第一部分人类肠道病毒 71 型衣壳蛋白 VP1 ,VP0 ,VP3 的体外合成. 8
1、材料与方法8
2 实验结果 16
3 讨论21
喝咖啡心慌第二部分人类肠道病毒 71 型衣壳蛋白 VP1 ,VP0 ,VP3 的原核表达分析 24
1 实验材料和方法 25
2 实验结果 31
3 讨论35
第三部分基孔肯雅病毒衣壳 C 和包膜蛋白 E2 的全基因合成及原核表达分析37
1 材料与方法 37
2 实验结果. 45
3 讨论52
总结53
综述53
参考文献 59
附录个人简历. 61
56号教室
致谢63缩略词表
英文缩写英文全称中文名称
EV71 Human enterovirus 71 肠道病毒 71型HFMD Hand foot mou dia 手足口病
CHIKV Chikungunya virus 基孔肯雅病毒
Amp Ampicillin 氨苄青霉素
bp ba pair 碱基对
BSA Bovine rum albumin 牛血清白蛋白
dNTPs Deoxynucleotide triphosphates 脱氧三磷酸核苷
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media DMEM 培养基
EB ethidium bromide 溴化乙锭
EDTA Ethylene diaminotetraacetic acid 乙二胺四乙酸
ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay 酶联免疫吸附实验
h Hour 小时
RP Horradish Peroxida 辣根过氧化物酶
IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 异丙基- β
-D-硫代半乳糖苷
Kan Kanamycin 卡那霉素
LB Luria-Bertani medium LB培养基
OD optical density 光密度
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
PCR polymera chain reaction 聚合酶链式反应
宝宝舌苔厚
rpm roTation per minute 每分钟转速
s cond 秒
SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基磺酸钠
TMB tetramethylbenzidine 四甲基联苯氨
Tris N-trishydroxymethylaminomethane N-三羟甲基氨基甲烷
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摘要
人类肠道病毒 71 型(Human enterovirus 71，简称 EV71)属于小RNA病毒科
肠道病毒属，人类肠道病毒 A，核酸为单股正链 RNA。目前已知EV71的感染可
骑虎难下
以导致手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、疱疹性咽峡炎和脊髓灰质炎样的麻痹性
疾病等多种与神经系统相关的疾病。手足口病在美国和欧洲处于小范围流行的阶
段，但是在 1975保加利亚和 1978年匈牙利有过两次大疫情爆
发和高死亡率。近
年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，包括马来西亚、新加坡、台湾、
日本、韩国、越南和中国大陆。
肠道病毒 EV71型有 A、B(B1、B2、B3、B4、B5)、C(C1、C2、C3、C4、
C5)三个基因型，共 11个亚型，病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无
包膜，直径约 24~30nm，核酸为含有大约 7400个核苷酸的单股正链 RNA。RNA
中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含 2194 个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为哈克贝利费恩
5′和 3′非编码区(UTRs)，与其他肠道 RNA 病毒一样，在 3′末端有多聚腺苷酸(poly
A)尾，而其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)VP1,P2 和 VP3 三个
蛋白暴露在病毒外壳的表面，而 VP4 包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接,
因而抗原决定簇基本上位于 VP1-VP3 上。近年来，已经开发出不同类型的 EV71疫苗，但目前普遍处于临床前开发阶段, 包括灭活疫苗、DNA 疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、表位多肽疫苗和病毒样颗
粒疫苗。这些疫苗在动物模型中的研究表明中和抗体的产生起关键作用。本研究
就目前研究中缺乏批准上市的抗原、抗体(酶标或化学发光)试剂，造成疫苗活
性评价中中和抗体效价测定的不准确性和可比性，我们构建了VP1,VP0,VP3
理论与实践三种原核表达质粒，成功的表达了 VP1,VP0 蛋白，并对其免疫原性做了初步评
价而且验证了 VP1 是抗原决定中心，为 EV71诊断试剂盒和亚单位疫苗的研究奠
定基础。
(一) EV71相关基因片段的体外合成根据 GenBank中录入的EV71///0>./19.08/6株全基因序列，翻译成
经大肠杆菌密码子优化后的 VP1,VP0 ,VP3 的基因核苷酸序列，利用 OE-PCR 原
2
描写声音的成语理设计全基因体外合成的特异性引物并进行体外合成。合成的全长片段 TA克隆至
pMD18T载体上，经过序列测定和最后的修正合成，成功合成三个外壳蛋白的基
因片段。
(二)VP1,VP0,VP3 的原核表达和 VP1 的免疫原性分析。
