2021年4月
第29卷㊀第2期
中国实验动物学报
ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA
April 2021
Vol.29㊀No.2
牛栋，赵彬彬，武婧，等.EV71㊁CA16㊁CA10三价VP1蛋白疫苗的有效性和安全性研究[J].中国实验动物学报,2021,29(2):210-218.
Niu D,Zhao BB,Wu J,et al.Study of the efficacy and safety of a trivalent EV71,CA16,CA10VP1protein vaccine [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2021,29(2):210-218.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2021.02.011
[基金项目]中国医学科学院创新工程(2016-12M -2-006)，国家科技重大专项 重大新药开发 (2016ZX09101120-006)㊂
Funded by Innovation Project of Chine Academy of Medical Science(2016-12M -2-006),National Major Scientific and Technological Special Project for Significant New Drugs Development (2016ZX09101120-006).
[作者简介]牛栋(1996 )，男，在读硕士研究生，研究方向：病原生物学㊂Email:
[通信作者]刘江宁(1981 )，男，研究员，硕士生导师，研究方向：肠道病毒的病原生物学及比较医学㊂Email:ljn_
EV71㊁CA16㊁CA10三价VP1蛋白疫苗的有效性和
安全性研究
牛栋，赵彬彬，武婧，彭婉君，张丽红，刘江宁∗
(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所,
卫健委人类疾病比较医学重点实验室，北京㊀100021)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀手足口病(HFMD)流行于5岁以下婴幼儿，由多种肠道病毒引发㊂由于该疾病具有多病原
的特点，单纯针对某一种病原的疫苗具有很大的局限性，开发多价疫苗非常必要㊂本文制作了EV71㊁CA16和CA10病毒的三价VP1蛋白疫苗，在小鼠中检测其免疫活性和安全性，以证明多价蛋白疫苗的可行性㊂方法㊀三价VP1蛋白疫苗免疫小鼠后，定期测定血清中特异性抗体情况㊁确定抗体的中和活性，检测特异性T 细胞免疫反应和细胞因子的变化情况，并通过体内感染实验评价免疫母鼠对乳鼠的被动免疫保护效果㊂结果㊀三价VP1蛋白疫苗免疫小鼠后，血清中能持续检测到特异性的IgG㊁IgM 抗体，且免疫血清具有中和活性；除诱导病毒特异的体液免疫，三价VP1蛋白疫苗还活化了病毒特异的T 细胞反应；三价VP1蛋白疫苗则只对乳鼠在感染EV71病毒时具有被动免疫保护作用㊂而在免疫过程中炎性细胞因子保持比较稳定的水平，表明疫苗具有良好的安全性㊂结论㊀三价VP1蛋白疫苗对EV71㊁CA16和CA10病毒具有一定的免疫保护活性，可用于手足口多价疫苗的进一步开发㊂
ʌ关键词ɔ㊀蛋白疫苗；肠道病毒；免疫保护
ʌ中图分类号ɔQ95-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1005-4847(2021)02-0210-09
Study of the efficacy and safety of a trivalent EV 71,CA 16,CA 10VP 1
protein vaccine
NIU Dong,ZHAO Binbin,WU Jing,PENG Wanjun,ZHANG Lihong,LIU Jiangning ∗
(Comparative Medicine Center,Peking Union Medical College(PUMC);Institute of Laboratory Animal
Sciences,Chine Academy of Medical Sciences(CAMS);Key Laboratory of Human Dias
Comparative Medicine,National Health Commission,Beijing 100021,China)
乔丹名言
Corresponding author:LIU Jiangning.E-mail:ljn_
ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀Hand,foot and mouth dia (HFMD)mainly affects children under the age of 5.
Becau HFMD is caud by a group of enterovirus,a vaccine targeting only one pathogen would be greatly limited,and a multivalent vaccine would be more effective.In this study,we prepared a trivalent VP1protein vaccine against EV71,CA16and CA10virus.This vaccine was then injected into mice to examine immune activities and to evaluate safety.
Methods ㊀After immunization with the trivalent VP1protein vaccine,virus-specific antibodies and their neutralizing activities were analyzed,and virus-specific T cell immune respons and changes in cytokines were assd.Furthermore,
passive immunoprotective effects pasd from immunized mothers to their neonatal offspring were evaluated with in vivo infection experiments.Results㊀The trivalent VP1protein vaccine continuously induced virus-specific IgGs and IgMs, which had the ability to neutralize the virus.In addition to inducing virus-specific humoral immunity,the trivalent VP1 protein vaccine activated the virus-specific T cell respon as well.The vaccine also provided passive immunity to neonatal mice against EV71virus infection.Additionally,the stable levels of inflammatory cytokines during the immune respon indicated that the vaccine was safe.Conclusions㊀The trivalent VP1protein vaccine was effective against EV71,CA16and CA10viral challenge,and could therefore be uful for the development of multivalent HFMD vaccines.
ʌKeywordsɔ㊀protein vaccine;enterovirus;immune protection
Conflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.
㊀㊀手足口病(hand,foot,and mouth dia,HFMD)是由多种肠道病毒引发的常见病毒性传染病，其主要传播途径为粪口传播，多发于婴幼儿及5岁以下儿童[1-5]㊂手足口病传染性强，通常是自限性的，但少数患儿可迅速发展为重症的神经系统并发症，如急性弛缓性麻痹㊁脑脊髓炎㊁无菌性脑炎㊁暴发性神经性肺水肿等，病死率较高[6-7]㊂2008年手足口病在我国开始暴发流行，此后发病病例呈逐
年上升趋势，到2014年至2016年累计已达730万例病例[8-11]㊂人类肠道病毒(human enterovirus)是手足口病的主要病原，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，为单股正链RNA病毒，由蛋白外壳和核酸组成㊂人类肠道病毒EV71(enterovirus71)和CA16(coxsackievirus A16)是手足口病的主要流行病原；近年来，由CA10 (coxsackievirus A10)㊁CA6(coxsackievirus A6)等病毒引起的手足口病病例有所增加[7-12]㊂其中,EV71和CA10感染都可引起严重的神经系统疾病，如无菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎，以及神经源性肺水肿和心肺功能障碍等，最终可能导致死亡㊂CA16感染症状虽多为轻症或无症状病例，但有研究表明EV71与CA16混合型感染更易导致中枢神经系统并发症[13]㊂
目前在我国已上市了针对EV71的灭活疫苗，然而EV71疫苗并不能预防手足口病的其他病原，如CA16和CA10[14-18]㊂因此，开发一种多价手足口病疫苗是更为有效的策略㊂由于肠道病毒感染可能与自身免疫性疾病有关[19-21]，灭活病毒免疫有引起自身免疫性疾病的潜在风险[22]；而重组蛋白疫苗可以去掉有害抗原表位，自由编辑㊁重组抗原蛋白，具有更好的灵活性㊂肠道病毒结构蛋白VP1含有主要的抗原决定簇，在EV71和CA16研究中都得到了证实㊂本文根据这一特性，将EV71㊁CA16和CA10病毒的VP1蛋白制成三价蛋白疫苗，每隔2周对ICR小鼠进行1次免疫，并定期检测小鼠血清中特异性抗体的组成及中和活性，鉴定T细胞的特异性免疫反应，并评估对乳鼠的免疫保护效果㊂结果表明：三价VP1蛋白疫苗能够有效地诱导出病毒特异的体液免疫和细胞免疫，能够保护乳鼠抵御EV71病毒感染，同时具有良好的安全性；从而说明该蛋白疫苗具有进一步开发的可能性㊂
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1㊀材料与方法
火柴人实验室1.1㊀材料
1.1.1㊀实验动物
110只6周龄SPF级ICR小鼠，其中雌性90只，雄性20只，体重约为25g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司ʌSCXK(京)2019-0008ɔ㊂于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室(ABSL-2)中进行实验ʌSYXK(京)2019 -0014ɔ㊂饲养环境：室内温度22~25ħ，湿度40% ~70%,12h光照/黑暗循环㊂动物在笼内自由摄食饮水㊂本实验得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准(批准号:LJN20013)㊂本实验所用的EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10 (GenBank accession number:HQ712020),CA16病毒为shzh05-1毒株(GenBank accession number: 262658),CA10病毒毒株(GenBank accession number:MF688814.1)㊂EV71VP1蛋白㊁CA10VP1蛋白经设计由北京义翘神州科技有限公司合成，蛋白浓度分别为0.57mg/mL和0.21mg/mL㊂CA16 VP1蛋白购自北京义翘神州科技有限公司，纯度大于85%㊂
1.1.2㊀主要试剂与仪器
弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich,F5881-10ML)，弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich,F5506-10ML)，山
羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(Abcam,ab6789)，山羊抗小鼠IgM mu chain(HRP)(Abcam,ab97230)，单组分TMB显色液(Solarbio,PR1200),PMA+Ionomycin 淋巴细胞刺激物(达优,20304210),Mou IFN-
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gamma ELISpot PLUS(ALP),strips(MabTech,3321-4AST-2),PROCARTAPLEX11PLEX(Invitrogen, PPX-11),TRIzol TM Reagent(Ambion,15596018) QuantiTect Probe RT-PCR Kit(Qiagen,204443), RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific TM,K1622),TB Green Premix Ex Taq TM II (Takara,RR820A)㊂
多功能发光分析仪(FLUOstar Omega，德国), Mabtech IRIS ELISPOT读板仪(Mabtech，瑞典), T100TM Thermal Cycler(Bio-rad，美国),QuantStudio TM 3Real-Time PCR System,96-well,0.2mL(Applied Biosystems TM，美国)
1.2㊀方法
1.2.1㊀动物分组及免疫
6周龄ICR母鼠随机分为5组，每组16只㊂三价VP1蛋白疫苗组按照不同剂量分为3组,CV-2.5组㊁CV-5组和CV-10组：经腹腔免疫EV71㊁CA16㊁CA10三种VP1蛋白等比混合的三价VP1蛋白疫苗(每种VP1蛋白2.5㊁5㊁10μg)㊂阴性对照组：腹腔免疫生理盐水㊂阳性对照组：腹腔免疫EV71㊁CA16㊁CA10
三种等比混合的阳性疫苗㊂各组在免疫后的14㊁28d时加强免疫，初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫时用弗氏不完全佐剂㊂在每次免疫前采血分离血清，免疫后的35d无菌取脾㊂血清用于细胞因子㊁病毒特异性抗体㊁中和抗体效价检测，脾用于细胞免疫反应检测㊂每组的部分小鼠在14d 免疫后与雄鼠按2ʒ1进行合笼㊂
1.2.2㊀细胞因子检测
采用Luminex法检测血清中细胞因子的水平㊂收集小鼠血液于EP管中，分离血清，按照试剂盒说明进行IFN-γ㊁TNF-α㊁IL-1β㊁IL-2㊁IL-4㊁IL-5㊁IL-6㊁IL-10㊁IL-12㊁IL-13细胞因子的检测㊂
1.2.3㊀抗体阳性检测
采用间接ELISA的方法进行检测，用包被液(0.05mol/L,PH=9.6的碳酸盐缓冲液)稀释抗原，并加入到酶标板中(每孔100μL),4ħ过夜；弃去包被液，洗涤后加入含有1%BSA的PBST封闭1h；之后加入稀释好(1ʒ100/1ʒ1000)的血清37ħ孵育2h；弃去孔内液体，洗涤后加入100μL HRP标记的羊抗鼠抗体,37ħ孵育1.5h；洗涤后加入100μL TMB显色液37ħ显色5min，加入50μL2mmol/L 的H2SO4终止显色，酶标仪测定A450㊂根据P/N的值来判断抗体是否为阳性,P/N值(阳性孔/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性;P/N值小于2.1，但大于1.5为可疑;P/N值小于1.5为阴性㊂1.2.4㊀中和抗体水平检测
采用体外微量中和试验进行检测㊂将血清放入56ħ的金属浴加热30min，灭活补体后的血清从23开始进行2倍系列稀释，分别与100TCID50的病毒进行等体积混合,37ħ中和80min，将孵育好的混合液加入到长有80%RD细胞的培养板中，正常RD 细胞作为空白对照组，病毒感染对照组加入100μL 的100TCID50病毒液；将细胞培养板置于CO2培养箱中37ħ培养3d，在显微镜下观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)，并按照Reed-Muench法计算中和抗体的滴度㊂
1.2.5㊀脾中特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞检测
第3次免疫后7d，每组随机抽取6只小鼠，无菌取脾并制备细胞悬液，按照每孔3ˑ105个细胞放入96孔板中，并加入PMA+Ionomycin淋巴细胞刺激剂㊁灭活的EV71病毒㊁灭活的CA16病毒㊁灭活的CA10病毒刺激24h，按照ELISpot试剂盒说明书检测细胞分泌IFN-γ时生成的斑点数㊂
1.2.6㊀新生乳鼠的病毒感染实验
经免疫的雌鼠产生的1日龄ICR小鼠30窝，每窝8~10只，分别经腹腔注射LD50剂量的EV71㊁CA16或CA10病毒，观察组共观察14d，期间记录临床评分㊁生存率㊁体重；解剖组在3~5d时取小鼠血液和后肢肌肉用于病毒载量的检测㊂
1.2.7㊀RNA的提取以及qPCR检测病毒载量
仰卧起坐的好处
血液与后肢肌肉采用TRIzol法进行总RNA的提取，经CA16感染的小鼠样本需在提取RNA后利用反转录试剂盒进行反转，并利用染料法qPCR制备的标准曲线测定样本中CA16病毒核酸的拷贝数㊂经EV71或CA10感染的组织样本利用探针法qPCR制备的标准曲线测定其EV71或CA16病毒核酸的拷贝数㊂
1.3㊀统计学分析
所有数据均使用IBM SPSS23和GraphPad Prism8软件处理，两组间的比较采用独立样本t检验，实验数据以平均值ʃ标准差( xʃs)表示，以P<0.05表示差异具有显著性㊂
2㊀结果
2.1㊀三价VP1蛋白疫苗能够诱导产生病毒特异性的中和抗体
本实验采用6周龄ICR 雌鼠对三价VP1蛋白疫苗(EV71㊁CA16和CA10三种病毒的VP1蛋白混合疫苗)进行评价，蛋白疫苗按照剂量分为2.5μg (CV-2.5)㊁5μg(CV-5)和10μg(CV-10)3个实验组，并以EV71㊁CA16和CA10三种灭活病毒混合形成的疫苗作为阳性对照(PC)㊁以生理盐水作为阴性对照(NC)㊂初次免疫后，分别在14㊁28d 进行第2次和第3次加强免疫㊂一免后14㊁28㊁35d 分别检测血清中IgG㊁IgM 抗体水平㊂
三价VP1蛋白疫苗初次免疫后，在14~35d 的检测期内VP1蛋白特异的IgG 和IgM 抗体均为阳性，同时抗体能与灭活病毒进行特异性的结合(表1)㊂选取免疫后35d 的血清来检测抗体的中和滴度(neutralization titer,NT)㊂从结果可见(图1A)：三价VP1蛋白疫苗的免疫血清对CA10病毒
的中和活性最高,3种剂量都超过了26；对EV71病毒中和活性次之,NT 在25~26之间；对CA16病毒的中和能力较差，均不到25㊂与PC 组相比，蛋白疫苗免疫血清中和活性均下降约4倍㊂以上结果证明，三价VP1蛋白疫苗诱导产生的抗体具有中和活性，对EV71和CA10病毒的中和作用尤为明显；同时，三价VP1蛋白疫苗的不同剂量并未使疫苗血清的中和活性发生显著性的差异㊂
表1㊀三价VP1蛋白疫苗三次免疫血清中抗体持续阳性情况检测结果
Table 1㊀Test results of continuous positive antibodies in the three immunized rums of the trivalent VP1protein vaccine
组别Groups 特异性IgG 抗体Specific IgG antibody
特异性IgM 抗体Specific IgM antibody EV71VP1蛋白EV71VP1protein
EV71病毒EV71virus CA16VP1蛋白CA16VP1protein
CA16病毒CA16virus CA10VP1蛋白CA10VP1protein
CA10病毒CA10virus EV71VP1蛋白EV71VP1protein
EV71病毒EV71virus CA16VP1蛋白CA16VP1protein
CA16病毒CA16virus CA10VP1蛋白CA10VP1protein
CA10病毒CA10virus NC
------------CV-2.5++++++++++++CV-5
++++++++++++CV-10+
+
+
+
+
+
+
运动会音乐+
+
+苏州必去的三条街
+
+
PC
++++++++++++注:-表示3次免疫抗体持续阴性;+表示3次免疫抗体持续阳性；阳性判断标准：以P /N 值(阳性孔/阴性孔OD 值)大于或等于2.1为阳性;P /N 值小于2.1，但大于1.5为可疑;P /N 值小于1.5为阴性㊂
Note.-.Indicates that the third immunization antibody continues to be negative.+.Indicates that the third immunization antibody continues to be positive.Positive judgment standard.P /N value (positive
hole /negative hole OD value)is greater than or equal to 2.1as positive,P /N value is less than 2.1,but greater than 1.5is suspicious,P /N value is less than 1.5as negative.
2.2㊀三价VP1蛋白疫苗能够诱导病毒特异的T 细胞反应
根据动物实验和临床数据,EV71㊁CA16的灭活病毒疫苗能够有效的激活细胞免疫反应[23-24]；在本研究中PC 组也得到了相似的结果，三种病毒特异的T 细胞反应都得到了有效的诱导(图1B㊁C)㊂同时，发现三价VP1蛋白疫苗对T 细胞也具有活化作用：相对于阴性对照，接种过蛋白疫苗的小鼠有更多的脾细胞产生IFN-γ；其中EV71VP1蛋白的诱导作用最为突出，检测到的IFN-γ阳性点均超过130；三种蛋白剂量中CV-5剂量组相对于NC 组，在不同病毒刺激下其表达的IFN-γ均具有显著性差异，说明其激活病毒特异的T 细胞反应更为稳定(图1B㊁C)㊂研究表明，重组蛋白疫苗可通过被抗原递呈细胞(巨噬细胞㊁DC 细胞)吞噬㊁加工，再递呈给T 细胞，产生特异的T 细胞反应㊂本实验中的中剂量三价VP1蛋白疫苗能诱导出有效的㊁病毒特异的T 细胞反应，其中5μg 的蛋白剂量表现更好；以EV71VP1蛋白效果最佳,CA16VP1蛋白次之；但是蛋白疫苗均未达到灭活病毒疫苗的诱导活性㊂
2.3㊀三价VP1蛋白疫苗免疫未引发炎症反应疫苗的安全性是疫苗研究的重要部分，由于在
假虞灭虢EV71感染引起的脑干脑炎㊁肺水肿并发症的患者体内，炎症细胞因子水平明显升高[25-26]，因此在疫苗的开发使用中有必要考虑细胞因子的变化情况㊂
基于以上考虑，灭活EV71疫苗的研究中增加了对免疫前后的炎性细胞因子的检测[27]，结果表明接种疫苗引起的免疫应答中未产生炎症反应，从而支持了疫苗的安全性㊂同理，检查了三价VP1蛋白疫苗免疫后小鼠血清中10种炎症相关细胞因子的变化情况(图2)㊂蛋白疫苗组血清中大部分炎症相关细胞因子(IFN-γ㊁TNF-α㊁IL-1β㊁IL-4㊁IL-5㊁IL-6㊁IL-10㊁
IL-12p70)的水平与同期采集的阴性对照组无显著
注:A：免疫35d后小鼠血清的中和抗体滴度变化情况,n=3;B：免疫35d后小鼠脾细胞中病毒特异性T细胞免疫反应分泌IFN-γ结果,n= 4;C：免疫35d后小鼠脾细胞中病毒特异性T细胞免疫反应分泌IFN-γ结果；与PC组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001；与NC组相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001㊂
图1㊀三价VP1蛋白疫苗免疫血清中中和抗体滴度变化情况及病毒特异性T免疫细胞反应检测结果Note.A.Changes of neutralizing antibody titers in mou rum after35d of immunization,n=3.B.IFN-γcreted by virus-specific T cell immune respon in mou spleen cells after35d of immunization,n=4.C.The results of IFN-γcreted by virus-specific T cell immune respon in mou spleen cells after35d of immunization,n=4.Compared with the PC group,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001.Compared with the NC group, #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.
Figure1㊀Changes of neutralizing antibody titers in the immune rum of the trivalent VP1
protein vaccine and the detection results of virus-specific T immune cell respons
性差异;CV-2.5组的IL-2在14d时有短暂的升高，而到35d时又恢复到免疫前水平;IL-13作为抑制炎症的细胞因子，在蛋白免疫组(CV-2.5组㊁CV-10组)检测到了高水平的表达㊂PC组免疫后IFN-γ和TNF-α的水平有短暂的升高，但最终降回至阴性对照水平㊂此外，在免疫后的小鼠日常观察中未发现
