抗仔猪腹泻重组复合多价疫苗的抗原制备及其条件优化2021年第4期
盘锦美食抗仔猪腹泻重组
复合多价疫苗的抗原制备及其条件优化
张恒慧1，2，3，尤建嵩2，贺东亮1，邹栋良1，赵肖琼1，李晓宇2，李淑英3，徐永平2，3*
（1.太原工业学院环境与安全工程系，山西太原030008；
2.大连理工大学生物工程学院，辽宁大连116024；
3.大连赛姆生物工程技术有限公司，辽宁大连116023）
摘要：研究旨在探究重组复合多价抗腹泻疫苗主要抗原的制备工艺条件并进行优化。结果表明，采用优化后的提取和纯化方法能够有效提高疫苗抗原之一重组三价肠毒素的纯度和产率；使用改良Minca培养基能够使菌毛抗原产肠毒素大肠杆菌F4和F5菌毛蛋白表达量更高，等电点沉淀法可将菌毛蛋白纯度提至约100%。通过上述优化方法制备复合多价疫苗所需的重组肠毒素蛋白抗原和菌毛蛋白抗原纯度较高，可用于后期疫苗的制备。
关键词：仔猪腹泻；疫苗；重组三价肠毒素；菌毛；抗原制备
中图分类号：S859.79文献标识码：A文章编号：1672-9692（2021）04-0014-07
Optimization of antigens preparation process of
recombinant multivalent vaccine against piglet diarrhea
Zhang Henghui1,2,3,You Jiansong2,He Dongliang1,
请假条怎样写
Zou Dongliang1,Zhao Xiaoqiong1,Li Xiaoyu2,Li Shuying3,Xu Yongping2,3*
(1.Department of Environment and Safety Engineering,
Taiyuan Institute of Technology,Shanxi Taiyuan030008;2.School of Bioengineering,Dalian University of
Technology,Liaoning Dalian116024;3.SEM Bio-Engineering Technology Co.Ltd.,Liaoning Dalian116600)
Abstract:The study was to explore and optimize the preparation process of the main antigens of recombinant multivalent vaccine against piglet diarrhea.The results showed that the optimized extrac
tion and purification method could effectively improve the purity and yield of recombinant trivalent enterotoxin.The improved MINCA medium could increa the expression of F4and F5fimbria proteins,and the purity of fimbria proteins could be incread to about100%by isoelectric point precipitation method.The recombinant enterotoxin protein antigens and fimbria antigens needed for the preparation of composite multivalent vaccines by the above optimized methods have good purity and high yield,which can be ud for the preparation of vaccine in later work.
Key words:Piglet diarrhea;Vaccine;Recombinant trivalent enterotoxin;Fimbria;Antigens preparation
仔猪腹泻影响畜牧业的发展，我国每年因仔猪腹泻导致的死亡率约15%，造成的直接经济损失达10亿元[1-2]。饲料行业使用大量的饲用抗生素防治仔猪腹泻，导致一系列的细菌耐药性、抗生素残留等，从而影响国民健康和养殖业的高质量发展[3]。2020年，农业农村部已全面禁止饲料中添加抗生素药物。用于防治仔猪腹泻的新型“抗生素替代”方案的研究和应用已经迫在眉睫[4-5]。仔猪腹泻的发病机理是由于产肠毒素大肠杆菌依赖菌毛黏附在肠道继而大量增殖后分泌肠毒素引发的级联反应[6-7]。因此，以腹泻发生过程的两大类抗原肠毒素和菌毛为作用靶点，通过疫苗产生相应抗体的手段可以有效地阻断腹泻的发生，是替代抗生素防治仔猪腹泻的重要潜在方案之一[8]。
收稿日期：2021-02-18
年轮梁晓声
作者简介：张恒慧，博士，研究方向为动物营养及疾病防治。
通讯作者：徐永平，博士，教授，博士生导师，研究方向为动物生物技术与营养。
基金项目：山西省高等学校科技创新项目资助（2020L0625）；山西省应用基础研究项目（201801D221279）；太原工业学院青年学术带头人支持计划资助
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现代畜牧兽医2021年第4期
本团队在前期的工作中将STa、STb和LTB3种主要肠毒素基因重组连接，去掉肠毒素基因中编码毒性结构域序列，有效保留表达免疫原性的序列，通过原核表达体系构建表达重组三价肠毒素SLS的重组菌[9]。本研究的在前期工作的基础上，研发包含重组三价肠毒素抗原及主要菌毛抗原的复合多价疫苗的抗原的制备工艺条件、提高疫苗中抗原的纯度以及降低抗原的制备成本，从而优化抗原的生产工艺，为疫苗后续的生产及临床免疫试验提供参考。1材料与方法
1.1菌种鸣翠湖
三价肠毒素STa-LTB-STb融合重组菌BL21由大连理工大学ABTNL实验室提供；大肠杆菌F4ac标准菌株C83902由中国兽药监察所提供；大肠杆菌F5标准菌株C83914由中国兽药监察所提供。
1.2试验试剂
改良Minca培养基（青岛海博生物技术有限公司）；TSB培养基（美国Sigma公司）；酵母粉、蛋白胨（英国Oxoid公司）；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（南京奥生化学技术有限公司）；N-三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、氨基乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、过硫酸铵（北京奥博星生物技术有限公司）；TEMED（美国Amresco公司）；尿素（ultra）（加拿大Bio Basic Inc.）；二硫苏糖醇（DTT）（中国医药上海化学试剂公司）；低分子量标准蛋白[宝生物（大连）有限公司]提供；硫酸卡那霉素（Kan）（浙江金华康恩贝生物制药有限公司）。
TE1缓冲液：10mmol/L Tris·Cl（pH值7.0）、1mmol/L EDTA；TE2缓冲液：50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0）、10mmol/L EDTA（pH值8.0）、100mmol/L NaCl、0.5% TritonX-100；TE3缓冲液：50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0）、1mmol/L EDTA（pH值8.0）、100mmol/L NaCl、4mol/L尿素；包涵体溶解缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0）、1 mmol/L EDTA（pH值8.0）、100mmol/L NaCl、8mol/L尿素、10mmol/L DTT；包涵体溶解缓冲液B：50mmol/L KH
2
PO
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、1mmol/L EDTA（pH值8.0）、50mmol/L NaCl。1.3试验仪器
TP600型PCR仪[宝生物工程（大连）有限公司]；10C 型电泳仪、31D型电泳槽、9405B型脱色摇床（北京六一仪器厂）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器）；
0.45μm滤膜（Φ10cm）（上海市新亚净化器件厂）；5804R 型低温冷冻离心机（德国Eppendorf）；303-4A型电热恒温培养箱（上海阳光实验仪器公司）；FA1004型电子天平（上海越平科学仪器公司）。
1.4试验方法
1.4.1菌毛蛋白PCR鉴定
根据表达ETEC主要菌毛抗原的基因序列，从结构基因中选取保守序列作为目的片段，同时参考文献报道，使用primer5.0设计F4菌毛蛋白基因和F5菌毛蛋白基因的PCR引物[10]。上述引物的合成均由宝生物工程（大连）有限公司完成。不同菌毛蛋白基因PCR引物见表1。
分别将采样的ETEC菌种和F4标准菌株进行纯培养，菌悬液经过离心和PBS洗涤后获得菌体沉淀，再加入超纯水吸混均匀，在100℃水浴锅中煮沸10min，迅速0℃冰浴5min，4℃10000r/min离心10min，取上清，制备DNA模板[11]。采用20μL PCR体系，以各菌株DNA为模板，分别采用F4菌毛蛋白和F5
菌毛蛋白基因的特异性引物进行反应，PCR反应体系成分见表2。
为降低非特异性扩增，提高引物结合率，对PCR反应条件进行了优化，具体PCR反应条件见表3。
PCR结束后，通过琼脂糖凝胶电泳来对结果进行观察。每个样品取5μL PCR扩增产物与1μL6×loading buffer混匀后，上样至1.5%的琼脂糖凝胶，在100V恒压下电泳40min。以DNA Marker DL2000为参照，紫外灯下观察扩增片段的大小并分析结果。
1.4.2重组三价肠毒素蛋白（SLS）的诱导表达、粗提和纯化
将冻存的重组菌BL21接种于含卡那霉素（Kan）浓度为25mg/L的LB培养基在37℃恒温摇床中活化培养12h；将活化后的种子液以2%的接种量接种于含Kan（终浓度25mg/L）的LB培养基中37℃振荡培养至菌悬液
表1不同菌毛蛋白基因PCR引物
Tab.1PCR primers of different fimbria genes 引物
F4 F5F
R
F
R
序列（5'→3'）
5'-ATGAAAAAGACTCTGATTGC-3'
5'-TCCACTGAGTGCTGGTAGTT-3'
5'-ATGAATACAGGTACTATTAACTTC-3'
5'-TTACATATAAGTGACTAAGAAGGA-3'
产物大小/bp
817
480
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2021年第4期
Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine
OD 600nm 为0.6左右时，根据培养液体积加入IPTG 至终浓度为1mmol/L，继续培养菌体5h 左右，进行重组蛋白的诱导表达[12]。将重组蛋白诱导表达完全的菌液离心收集菌体细胞，加入等体积PBS 缓冲液洗涤菌体，重复操作3次后在菌体沉淀中加入原菌液体积1/50倍的TE1缓冲液，吹打均匀至没有凝块，在冰水浴中将菌悬液超声破碎30min （破碎5s、暂停5s ），将破碎混合液冷冻离心收集沉淀，即为SLS 重组蛋白粗提物。在重组蛋白粗提物中加入TE2缓冲液进行洗涤纯化，用移液枪吹洗均匀至没有凝块，在摇床上振荡洗涤20min，之后4℃、7000r/min 离心20min，收集沉淀；在沉淀中加入TE3缓冲液，在摇床上振荡洗涤20min，随后4℃、7000r/min 离心20min，收集纯化后的重组蛋白沉淀[13]。
1.4.3重组蛋白空间（三级及以上）结构和抗原性的恢复和方法优化
经过重组表达的蛋白质，在原核表达系统中以包涵体
的形式存在，其天然构象被破坏，如若发挥重组肠毒素蛋白的免疫原性，需要经过体外变性和复性处理来恢复其空间结构和天然构象。将纯化后的重组蛋白沉淀重悬至包涵体溶解缓冲A 液中，漩涡振荡
混合均匀，于37℃摇床振荡孵育使重组蛋白颗粒变性溶解；加入3倍体积的包涵体溶解缓冲B 液，用10mol/L KOH 调节pH 值至9.8，室温下静置30min 用浓HCl 将溶液pH 值调至8.0，室温下静置40min 将溶解液离心取上清，4℃保存待用。包涵体蛋白
在含有8mol/L 尿素的溶解缓冲A 液的作用下，分子内氢键被破坏，二级以上空间结构发生改变，从而变性溶解。为恢复重组肠毒素的天然构象，需要除去其中添加的变性剂[14]。
本试验分别对比研究常规透析方法以及多重优化方法对重组蛋白复性的效果。首先根据文献报道，采用常规透析方法进行重组蛋白的复性，将变性溶解的重组蛋白溶液稀释至0.5g/L，依次加入尿素浓度为2.0、1.0、0.5、0mol/L 4个梯度的透析液中，4℃下透析复性，每个梯度持续12h；最后两次透析复性液中不加甘油，最终获取纯化、复性后的重组蛋白溶液，SDS-PAGE 验证并检测纯化、复性后重组蛋白及其纯度，并用BCA 法测取蛋白浓度[15]。
重组蛋白复性效果的好坏关系着重组蛋白能否有效恢复空间构象以及蛋白的纯度、浓度和得率，直接影响后
续疫苗使用的效果。在常规透析方法的基础上，本试验对复性条件进行优化，建立稀释-透析-超滤离心多重去除尿素的方法，对重组蛋白进行复性，以提高重组蛋白的纯度和得率。将重组蛋白稀释溶液依次加入尿素浓度为6、4、2、1、0mol/L 5个梯度的透析液中，4℃下透析复性，前4个梯度持续12h，
最后1个梯度持续24h，再用截留分子量为3kDa 的超滤离心管在4℃、5000r/min 条件下对透析液离心处理10min，检测重组蛋白的纯度和浓度。1.4.4F4菌毛蛋白的表达、提取和纯化
本试验分别采用改良Minca 培养基、TSB 培养基和LB 培养基分别培养F4+标准菌株，考察培养基类型的不同对
菌毛表达量的影响并且优化F4菌毛的表达；菌毛的提取和纯化采用热振荡法和等电点沉淀法，经过提纯获得纯化的F4菌毛蛋白。将F4+标准菌株依次接种于3种培养基，37℃培养36h 后离心收集菌体，用无菌PBS 溶液洗涤菌体，重复操作3次后将洗涤完成的菌液在60℃水浴中温浴30min，之后立即漩涡振荡10min，于11000r/min 离心15min 后取上清，用0.22μm 滤膜过滤，收集滤液即为F4菌毛粗提物[16]。用2.5%柠檬酸将菌毛粗提物调pH 值至3.92，4℃静置2h；4℃、11000r/min 离心30min，弃上清，用无菌PBS 溶解沉淀，重复操作3次后用SDS-PAGE 检测提取液中菌毛蛋白的含量及纯度[17]。1.4.5F5菌毛蛋白的表达、提取和纯化
采用F4菌毛蛋白优化后的方法研究F5菌毛蛋白的表达和提取过程。菌毛蛋白纯化过程中，调节F5菌毛蛋白粗提液pH 值为9.75，再静置离心收集沉淀，最后用无菌PBS 溶解沉淀获得F5菌毛蛋白提取液，并检测溶液中菌毛蛋白的含量及纯度[18]。
表2
PCR 反应体系成分
Tab.2
PCR system components
试剂DNA 模板
2×Taq EX primer
10μmol/L Forward primer （特异性引物）10μmol/L Rever primer （特异性引物）无菌ddH 2O 反应体系总体积
Taq DNA 聚合酶挨打的故事
10×PCR buffer 4×dNTPS MgCl 2
体积/μL 2.0
10.0
0.50.57.020.0
表3
PCR 反应条件
Tab.3
PCR reaction conditions
反应温度/℃9594507272
反应时间5min 30s 20s 40s 5min
备注
30个循环
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现代畜牧兽医
2021年第4期2结果与分析
2.1
菌毛类型的PCR 检测结果（见图1、图2）
由图1可知，采用F4菌毛基因引物对几株大肠杆菌进行PCR 扩增，电泳结果显示F4+菌株在分量子约为817bp 处出现目的条带，而F5+菌株却未出现扩增产物，表明此基因为表达F4菌毛蛋白抗原的基因，且为F4菌株独有的特异性抗原。由图2可知，使用F5菌毛基因引物进行PCR 扩增后，电泳结果显示F5+
菌株在480bp 处扩增出目的条带，
F4+
菌株未出现扩增产物，表明此基因为表达F5菌毛蛋白
抗原的基因，且为F5+菌株独有的特异性抗原。2.2
SLS 诱导表达及提纯的SDS-PAGE 检测（见图3、图4）
由图3可知，对比IPTG 诱导表达前后的全菌电泳图谱，外源基因经IPTG 诱导表达后重组蛋白得到大量表达，通过超声破碎获得的重组蛋白以非水溶性的包涵体形式存在，含量占粗提物总蛋白的39.6%；采用常规方法对粗蛋白进行提纯复性后重组蛋白水溶性增加，但是获得的重组蛋白含量较低，经Gel-Pro Analyzer 4.0分析复性后的蛋白溶液中目的蛋白含量仅为11.2%，提纯方法有待优化。
五年级周记400字由图4可知，泳道6采用优化后的提纯方法，重组蛋白的纯度非常高且无杂带，Gel-Pro Analyzer 4.0分析结果为接近100%，而且同体积菌悬液中重组蛋白的得率也比常规方法有所提高。
2.3F4菌毛的表达和纯化（图5~图7、表4）
在菌毛蛋白抗原的制备过程中，菌毛蛋白的表达量是
影响蛋白收率的重要因素。由图5可知，F4菌毛蛋白出现在全菌SDS-PAGE 电泳的28.1kDa 条带处，经Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析，在相同条件下使用改良Minca 培养基培养的F4+标准菌株的F4菌毛表达量要高于LB 培养基，计算得目的条带的累积光密度（IOD 值）在改良Minca 培养基全菌液中为9.44%高于LB 培养基中的6.61%；菌毛蛋白经温浴、振荡脱落离开菌体，获得粗蛋白溶液，电泳结果显示，改良Minca 培养基培养的菌体制的粗提液中菌毛蛋白含量要远高于LB 培养基。由图6可知，相同条件下改良Minca 培养基中全菌液目的蛋白含量为59.3%高于TSB 培养基中的48.0%，而且粗提物中菌毛蛋白的含量也更高。因此在改良Minca
培养基中生长的
注：M 为DNA Marker DL2000；1、2为采样菌种；
3为F5标准菌株；4为F4标准菌株。
图1F4菌毛基因扩增结果
Fig.1Results of PCR with F4gene
primer
注：M 为DNA Marker DL2000；1为采样菌种；2为F5标准菌株；3为F4标准菌株。
图2
F5菌毛基因扩增结果
Fig.2
Results of PCR with F5gene
primer
注：M 为低分子量蛋白标准；1为未加IPTG 的原菌液；2为IPTG 诱导后的
全菌；3为超声破碎前菌液；4为破碎后上清液；5为破碎后沉淀-重组蛋白粗提物；6为经过洗涤后的包涵体；7为复性后的重组蛋白。
图3
重组三价肠毒素蛋白SLS 诱导表达及常规方法提纯的电泳结果
Fig.3SDS-PAGE results of inducible expression and
purification of SLS in routine
method
注：M 为低分子量蛋白标准；1为未加IPTG 的原菌液；2为IPTG 诱导后的
全菌；3为超声破碎前菌液（浓缩后）；4为破碎后沉淀-重组蛋白粗提物；
5为纯化后剩余杂蛋白；6为纯化后的重组蛋白。
图4重组三价肠毒素蛋白诱导表达及提纯的优化结果
Fig.4SDS-PAGE result of inducible expression and
purification of SLS in optimized method
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2021年第4期
Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine
ETEC 菌株菌毛蛋白的表达量要高于LB 培养基和TSB 培养基，而且更利于菌毛蛋白的提取。
经过热振荡法制得的菌毛蛋白粗提液，采用等电点沉淀法对其进行纯化。F4菌毛蛋白纯化过程的SDS-PAGE 结果见7。
由图7可知，F4菌毛蛋白粗提液在pH 值为等电点4.0下沉淀纯化后，获得纯度很高的菌毛蛋白溶液，电泳结果显示几乎只有目的条带。利用Gel-Pro
Analyzer 4.0软件对F4菌毛蛋白纯化前后的SDS-PAGE 结果进行分析，结果见表4。F4菌毛蛋白目的条带大小约为28.1kDa，而且目的蛋白的纯度由纯化前的43.0%上升至纯化后的约100%，纯化效果良好。
2.4F5菌毛的表达和纯化（见图8）
根据几种表达菌毛培养基的优化筛选结果，选用
改良Minca 培养基培养F5+标准菌株来制备F5菌毛蛋白抗原。利用热振荡法获得的F5菌毛蛋白粗提液，在其等电点9.75下进行沉淀纯化。由图8a 可知，改良Minca 培养基中生长的F5全菌电泳结果显示，F5菌毛蛋白的含量为20%，菌毛表达比较丰富；由图8b 可知，等电点沉淀法获得的F5菌毛蛋白纯化效果较好，制备了纯度较高的F5
抗原蛋白。对教育的认识
注：M 为低分子量蛋白标准；1为LB 培养基中生长的F4+全菌液；
2为改良Minca 培养基中生长的F4+全菌液；3为LB 培养基得到F4菌毛粗蛋白；4为改良Minca 培养基得到F4菌毛粗蛋白。
图5改良Minca培养基和LB培养基表达F4菌毛蛋白的对比效果
Fig.5Comparation of F4proteins expresd in modified Minca broth and LB
broth
注：M 为低分子量蛋白标准；1为改良Minca 培养基中得到的纯化菌毛蛋白；2为TSB 培养基中得到的纯化菌毛蛋白；3为TSB 培养基中得到的菌毛粗蛋白；4为改良Minca 培养基中得到的菌毛粗蛋白；5为改良Minca
培养基中得到全菌液；6为TSB 培养基中得到的全菌液。
图6改良Minca培养基和TSB培养基表达F4菌毛蛋白的对比效果
Fig.6Comparation of F4proteins expresd in modified Minca broth and TSB
broth
注：M 为低分子量蛋白标准；1为F4菌毛粗蛋白；2为纯化后的F4菌毛蛋白。
图7F4菌毛蛋白的纯化（改良Minca 培养基）
Fig.7Purification of F4protein cultured in modified Minca broth
表4
Gel-Pro Analyzer 4.0对F4菌毛蛋白纯化分析结果
Tab.4
Analysis of purification of F4protein with Gel-Pro Analyzer 4.0
项目条带123456IOD 总和
目的条带百分比/%
泳道1
分子量/kDa
42.228.119.413.3
43
IOD 172.23187.253.8172.29
435.58
泳道2
分子量/kDa
28.1
100
IOD 30.70
30.71
泳道3
分子量/kDa
97.266.444.329.020.114.3
IOD 67.8565.0862.1480.90114.48174.97
565.41
图8改良Minca培养基培养标准F5+菌株以及菌毛蛋白的纯化
Fig.8F5+ETEC cultivated in modified Minca broth and F5protein purified
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