国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期丨nterj Epidemiol Infect Dis，April 2021，Vol. 48, No.2
CPG1826X^t重组新型冠状病毒亚单位疫苗的
协同免疫增强效果研究
杨宏宏1沈钱通1李思奇1安彤1于鹏程2张月3徐凯3陈彦霖3陈刚1高孟1庄昉成1
1杭州医学院基础医学与法医学院310053; 2中国疾病预防控制中心病毒病研究所，北京 102206; 3浙江普康生物技术股份有限公司，杭州310053
岳母的故事通信作者：庄防成，Email:
【摘要】目的以CpG1826作为疫苗佐剂评价其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的新型冠状病毒（SARS- C〇V-2)亚单位疫苗免疫原性的协同增强效果。方法利用大肠埃希菌高效表达SARS-C〇V-2亚单位抗原，纯化 后加入CpG1826和铝佐剂。将BALB/c小鼠随机分成铝佐剂疫苗组、CpG+铝佐剂疫苗组和空白对照组，每组18 只，于0、7和14 d进行腹腔注射免疫。分别于首针免疫后7、14和28 d采血和取睥检测小鼠血清IgG水平、中和抗体水平以及小鼠脾细胞上清中IFN-7细胞因子水平。结果在首针免疫28 d后，3组小鼠的IgG、结合抗体 抑制率和中和抗体水平差异均有统计学意义（F=21.440、159.400和8.
470，P均<0.05)，其中CpG+铝佐剂疫苗组分别为6.91±0.20、（91.01±4.60)%和65.33±51.70，均高于铝佐剂疫苗组(仁2.892、2.441 和2.703，/3均<0.05)。在 首针免疫7、14和28 d后，3组的特异性IFN-7的效应T细胞数比较差异有统计学意义（F=25.360、36.990和 660.400，P均<0.01)，CpG+铝佐剂疫苗组分别为179.68±69.26、395.58± 139.64、563.50±43.79，均高于铝佐剂疫苗组U=3.%9、5.292和22.310，P均<0.01)。结论CpG1826能和铝佐剂协同增强大肠埃希菌表达的SARS-C〇V-2 亚单位疫苗诱导的体液及细胞免疫应答水平，显著提高其免疫原性，具有较强的临床意义。
【关键词】新型冠状病毒；CpG1826；重组亚单位疫苗；免疫保护
基金项目：浙江省自然科学基金应急重大项目（LED20C080002)
DOI ： 10.3760/cma.j331340-20201225-00372
Study on the synergistic immune enhancement effect of CpG1826 on the recombinant subunit vaccine of SARS-CoV-2
Yang Honghong1，Shen Qiantong1，Li Sigi1，An Tong1，Yu Pengcheng2，Zhang Yue3，Xu Kai3，Chen Yanlin3，Chen Gang1, Gao Meng1, Zhuang Fangcheng1
'School of Basic Medical Science and Forensic Medicine, Hangzhou Medical College, Hangzhou 310
053y China；2Institute of Virology，Chine Center for Dia Control and Prevention，Beijing 102206，China; 3 Zhejiang Pukang Biotechnology Co., Ltd., Hangzhou 310053, China
Corresponding author：Zhuang Fangcheng, Email：****************
【Abstract】Objective To evaluate the synergistic effect of CpG1826 and aluminum adjuvant on the immunogenicity of SARS-CoV-2 subunit vaccine expresd in Escherichia coli.Methods Escherichia coli was ud to efficiently express SARS-CoV-2 subunit antigen. CpG1826 and aluminum adjuvant were added after purification. BALB/c mice were divided into three groups including aluminum adjuvant vaccine group, CpG+aluminum adjuvant vaccine group and blank group with 18 mice in each group,and were injected at day 0,7 and 14 intraperitoneally. Blood and spleen were collected at day 7,14 and 28 after the first immunization to detect the rum IgG, neutralizing antibody，and IFN-7cytokine level in the supernatant of mou spleen cells. Results At day 28 after primary immunity,the levels of IgG,the inhibition rates of binding antibody and the levels of neutralizing antibody in three groups were significantly different (F=21.440, 159.400 and 8.470,P all<0.05)；and in CpG+aluminum adjuvant •论著•
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vaccine group were 6.91 土0.20, (91.01 ±4.60)% and 65.33±51.70，which were much higher than tho in aluminum
adjuvant vaccine group («=2.892,2.441 and 2.703,P all <0.05). At day 7,14 and 28 after initial immunity,the
numbers of specific IFN-7effector T cells in three groups were significantly different(F=25.360,36.990 and 660.400,
P all<0.01); and in CpG+aluminum adjuvant vaccine group were 179.68±69.26,395.58±139.64,563.50±43.79,
which were all much higher than tho in aluminum adjuvant vaccine group(^=3.969,5.292 and 22.310,P all <0.01).
Conclusions CpG1826 and aluminum adjuvant can synergistically enhance the level of humoral and cellular immune
respon induced by the SARS-CoV-2 subunit vaccine expresd in Escherichia coli,and improve the immunogenicity significantly, which have great clinical significance.
[Key words] SARS-CoV-2 ；CpG 1826； Recombinant subunit vaccine; Immune protection
Fund program ： Natural Science Foundation Monumental Emergency Project of Zhejiang Province挤奶的正确手法
(LED20C080002)
D01:10.3760/cma.j331340-20201225-00372
新型冠状病毒（SARS-C〇V-2)在全球范围内广泛传播，该病毒致病性强可引起重症肺炎并导致死亡，是当前严重的公共卫生问题而接种疫苗是目前针对新型冠状病毒防控的主要措施之一。在候 选疫苗中，重组亚单位疫苗因其具有安全性高、生 产成本低等优势而受到广大研究者关注，但该类疫 苗需要佐剂增强免疫原性[31。传统铝佐剂作为世界范 围内应用最广泛的人用疫苗佐剂|41，已经在抗HPV 和HBV疫苗中发挥重要作用15<。铝佐剂通过延缓抗原释放和降低抗原降解并刺激天然免疫细胞来发 挥佐剂作用然而铝佐剂更偏向诱导Th2型免疫应 答，而对诱导Th1类免疫应答的能力较弱\为了克服铝 佐剂疫苗的缺陷，考虑开发联合佐剂以提高疫苗的免疫效力。CpG 0DN是一种含非甲基化的寡聚脱氧 核苷酸基序，能够通过激活DC或巨噬细胞的Toll样 受体，提髙亚单位疫苗的T hl应答根据CpG
在线美颜基序 的不同，已有多种CpG被证明具有很好的免疫佐剂 作用，如1826和1018等。本研究旨在以CpG1826 作为协同佐剂，评价其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的SARS-CoV-2亚单位疫苗的协同免疫增强效果。
材料与方法
一、材料
原核表达载体PET28a和大肠埃希菌BL21 (DE3)感受态细胞由浙江省医学生物工程疫苗研究开发重点实验室保存；质粒提取、胶回收等常规分子生物学实验试剂盒以及辣根过氧化物酶（HRP)标 记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京 康维世纪生物科技有限公司；蛋白Marker购自上 海雅酶生物科技有限公司；CPG1826由北京擎科生 物技术有限公司合成（5'-TCCATGACGTTCCTGA CG TT-3、全硫代修饰）；铝佐剂（氢氧化铝）购自丹 麦的Croda公司；SARS-CoV-2的S蛋白兔单克隆抗 体购自北京义翘神州生物技术有限公司；竞争性 ELISA检测中和抗体试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；小鼠IFN-7酶联免疫斑点试验(ELISP0T)试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司；SARS-CoV-2的S蛋白多肽库由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Vero-E6细胞和SARS-CoV-2 毒种由中国CDC病毒病研究所保存；清洁级BALB/c 小鼠(试验动物合格证号：20170005023355) ,4〜8周 龄，所有动物在浙江中医药大学实验动物中心词养和实验[SYXK(浙)2018-0012]。
串串香的做法
二、大肠埃希菌表达的sRBD亚单位抗原的制备
根据GenBank SARS-CoV-2的基因序列（M N908947.3)，选取其刺突蛋白上的受体结合区（RBD)基因，按照大肠埃希菌密码子偏好进行优化，委托北京擎科生物进行人工基因合成，所得 合成基因在N端引入组氨酸标签后插人PET28a 表达质粒，得到重组表达载体pET28a-HIS-RBD，经热激法转人大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组表达菌株。所得重组表达菌株经IPTG
诱导表达后，离心收集菌体，在冰浴下超声破碎
菌体，提取包涵体沉淀。所得包涵体沉淀用尿素
溶液变性重悬溶解后，经Ni-NTA纯化系统纯化，用透析液进行透析、过滤除菌，即为所需SARS-CoV-2 RBD(sRBD)重组抗原。
三、sRBD亚单位抗原的免疫印迹鉴定
将纯化的重组S RBD蛋白经SDS-PAGE分离后，通过电转印法转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶 粉封闭后加人SARS-C〇V-2的S蛋白兔单克隆抗
体（1:1 000)，37 t孵育1h后洗膜3次，加人HRP 标记羊抗兔抗体（1:1 000),37 t孵育30 min后洗 膜3次，最后加E C L显色、拍照。
四、动物小鼠免疫
将BALB/c小鼠随机分成3组，铝佐剂疫苗
组（sRBD蛋白20 pg/只，氢氧化铝佐剂250 |xg/只）、CpG+铝佐剂疫苗组（SRBD蛋白20 pg/只，CpG1826 10 pg/只，氢氧化铝佐剂250 (jig/只）、空白对照
组（CpG1826 10 (xg/只，氢氧化铝佐剂250 |j L g/只），每组18只小鼠，雌雄对半。具体免疫程序为间隔1周腹腔免疫，共免疫3针。在首针免疫7、14和28 d 后，每组分别取免疫小鼠6只（雌雄对半），取血分 离血清，同时处死取脾淋巴细胞。
五、 间接ELISA法测定小鼠血清结合抗体效价兽医站
用包被液稀释至终浓度1Ix g/mL的sRBD蛋白包被96孔板，4丈包被过夜。洗板后用含有1%牛血 清白蛋白（BSA)的磷酸盐吐温缓冲液封闭。将血清 用含1% BSA的磷酸缓冲盐溶液（PBS)按梯度3倍 稀释，每个稀释度血样作3个复孔加至96孔板中，同时以稀释液作为阴性对照。37 T孵育1h，洗板3次 后加人HRP标记的羊抗鼠IgG酶标抗体（1:30 000)，37 t孵育30 min，洗板3次后加TMB显色液显色。用 酶标仪测定各孔〇D450值，以阴性对照OD450均值的 2.1倍为cut-off值，以OD43〇均值高于cut-off值的最 大稀释倍数作为血清结合抗体效价。
六、 竞争性ELISA法测定小鼠血清结合抗体水平
所得小鼠血清稀释150倍后，参照竞争性ELISA中和抗体检测试剂盒说明书，与等体积HRP偶联的SARS-CoV-2 RBD蛋白混合，37 t孵育30 min。随后将混合液加人预包被ACE-2蛋白的96 孔板，每个小鼠血清设置2个复孔,37 t孵育15 min，同时以稀释液作为阴性对照。酶标仪于450 nm处 测定各孔0D值。小鼠血清结合抗体水平通过血清抗体对RBD蛋白与ACE-2细胞受体蛋白之间结合能力的竞争性抑制来实现，具体计算方法如下：血 清中和抗体=(1-样品孔0D均值/阴性对照孔0D 均值)x l00%。
七、 活病毒血清中和抗体的测定
小鼠血清用含DMEM培养基作连续倍比稀释[1:(4~256)]，分别与SARS-CoV-2 病毒液(2x l03CCIDs/mL)按体积比 1:1 混匀,37 t孵育 1h。所得病毒抗体混合液分别接种于长满单层Ver〇-E6 细胞的％孔板中，每个血清稀释度设置2个复孔，同时设置病毒原液阳性对照孔及DMEM培养液的阴性对照孔，用显微镜观察各孔细胞病变情况。抗 体效价以能中和相应病毒而阻止细胞病变的血清最高稀释度计算。
八、 免疫小鼠特异性IFN-*y检测
对小鼠实施颈椎脱白，无菌条件下取睥脏制备淋巴细胞悬液并稀释至5x l06个细胞/mL。将制备的 淋
巴细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100 pL，用SARS-CoV-2 RBD多肽作为刺激物，按ELISP0T 试剂盒说明书检测小鼠脾淋巴细胞中特异性分泌IFN-7的效应T细胞数。
九、统计学分析
采用GraphPad Prism 8.2.1软件处理相关数据，符合正态分布的计量资料采用表示，组间差异用 单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法进行统 计学分析,P<〇.〇5为差异具有统计学意义。
键盘图片字母位置
结 果
一、重组蛋白sRBD的表达、纯化与鉴定
所得重组菌经IPTG诱导在相对分子质量为28 000处有一条特异性条带，相对分子质M大小与 理论值相符（图1)，免疫印迹结果显示该特异性条带能被SARS-CoV-2的S蛋白兔单克隆抗体特异性 识别（图2)。
相对分子质量（xlO3)
20
：二—一
M I 2 3 4 5 6 7 8注:SA R S-C oV-2：新型冠状病毒；R B D：受体结合区；M为标志 物；1为诱导前；2为诱导后；3为破菌液；4为破菌上清；5为破菌沉 淀;6为纯化上样；7为纯化流穿；8为纯化洗脱
图1SARS-CoV-2重组蛋白RBD在大肠埃希菌中表达的
SDS-PAGE 分析
相对分子质量(xlO3)
20•
M 12
注：S A R S-C o V-2：新型冠状病毒；R B D：受体结合区；M为标志物；1为诱导前;2为诱导后
图2 SA R S-C oV-2重组蛋白RBD的W estern印迹法分析
二、CPG1826对免疫小鼠血清结合抗体效价的影响
1.采用间接ELISA检测免疫小鼠血清结合抗体效价
表1可见，首针免疫7、14和28 d后，3组小鼠 特异性血清IgG水平的差异均有统计学意义（F= 7.643、10.010 和 21.440，尸均<0.01 )。在首针免疫 14 d 后（即二针免疫7 d后），铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐 剂疫苗组的特异性结合抗体水平均高于对照组（t= 3.877和5.534, P均<0.01)，但是铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组之间的结合抗体水平差异没有统计学意义“=1.583, /M).05)。在首针免疫28 d后 (即三针免疫14d后），CpG+铝佐剂疫苗组的特异性结合抗体水平高于铝佐剂疫苗组Q=2.892,P< 0.05)。
表1免疫后小鼠特异性血清Ig G水平检测
PJS 不同免疫天数的小鼠特异性
组别’、血清IgG水平
美文朗读
(H)7 d 14 d 28 d
铝佐剂疫苗
组(lg)
6 1.41±l.lla 6.18±0.21a 6.51 ±0.30*
CpG+铝佐剂
疫苗组(lg)
6 2.56±0.36a 5.93±0.25a 6.91±0.20a b
对照组60.00±0.000.00±0.000.00±0.00
F值7.64310.01021.440
P值<0.01<0.01<0.01
注:a与对照组比较，P<0.01 ;b与铝佐剂疫苗组比较，/^<0.05
2.竞争性ELISA法测定小鼠血清结合抗体水平结果
如表2所示，在首针免疫7、14和28 d后，三组 间差异均有统计学意义（F=15.790、19.920和159.400，均<0.01)；其中首针免疫7 d后，铝佐剂 疫苗组和对照组均未产生结合抗体，而CPG+铝佐 剂疫苗组已产生结合抗体，与铝佐剂疫苗组存在显著差异(仁4.185，P<0.01)；首针免疫14 d后（即二针 免疫7d后），铝佐剂疫苗组和CP G+铝佐剂疫苗组 的结合抗体水平均高于对照组（f=6.823和5.251，
P均<0.01)，且CpG+铝佐剂疫苗组的结合抗体水平高于铝佐剂疫苗组U=3.267，P<0.01)；首针免疫28d后（即三针免疫14d后），铝佐剂疫苗组和CP G+铝佐剂疫苗组的结合抗体水平均随时间推移而提升，且两者差异有统计学意义U=2.441，P<0.05)。
表2免疫后小鼠血清结合抗体抑制率的测定
不同免疫天数的小鼠血清结合
^抗体抑制率(％)
(只）-----------------------------------------------------------------
7 d 14 d 28 d
铝佐剂疫苗组 6 4.70 ± 3.53 18.01 ± 4.49a75.64 ±14.73a
CpG+铝佐剂 6 12.22 ±2.62a42.21 ± 17.58* 91.01 ± 4.60s*1疫苗组
对照组6 4.34 ± 1.78 4.28 ± 2.02 4.45 ± 2.06
F 值15.790 19.920 159.400
P 值<0.01 <0.01 <0.01
注:a与对照组比较，/^(^丨^与铝佐剂疫苗组比较，
一年级下册语文
P<0.05~
国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期丨nterj Epidemiol Infect Dis, April 2021. Vol. 48,No.2•97.
三、CpG1826对免疫小鼠血清中和抗体水平的影响
对首针免疫28 d后（即三针免疫14 d后）的小 鼠血清进行活病毒中和试验，结果显示，3组间差异 有统计学意义（F=8.470,PcO.01)；与对照组相比，铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组的小鼠活病毒血清中和抗体几何平均滴度（GMT)分别为8.00± 5.06和65.33±51.70，均能诱导小鼠产生明显的中和 抗体U=3.873 和 3.095, P均<0.05)，且 CPG+铝佐剂 疫苗组的中和抗体水平高于铝佐剂疫苗组=
2.703, P<0.05)o
四、CpG1826对免疫小鼠特异性丨FN-7水平的影响
通过ELISPOT检测免疫后小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-7分泌水平，结果如图3所示，首针免疫 7、14和28 d后（即首针免疫7 d后、二针免疫7 d 后、三针免疫14 d后），三组间效应T细胞数均存在 显著差异（F=25.360、36.990、660.400，P均<0.01)，3 次检测中CpG+铝佐剂疫苗的小鼠脾淋巴细胞产生的特异性IFN-7效应T细胞数分别为179.68±69.26、395.58±139.64、563.50±43.79，均高于铝佐剂疫苗组 («=3.969、5.292 和 22.310，P均<0.01)。随着免疫次 数的增加，相较于铝佐剂疫苗组，CpG+铝佐剂疫苗 组小鼠脾淋巴细胞产生特异性IFN-7的效应T细 胞数上升更快，增加更加显著。
图3 ELISPOT检测免疫小鼠特异性IFN-7水平
讨 论
CpG ODN作为一种良好的疫苗佐剂，其在体内 被Toll样受体9(TLR9)识别后，通过一系列信号级联放大反应，直接或间接刺激各种免疫细胞分泌细胞因子，促进T h l型为主的免疫应答，调节体液和细胞免疫水平||2_13]。D〇u等M发现CpG 0DN作为佐 剂与禽白血病病毒抗原gp85配伍后免疫实验动物后，相比弗氏佐剂，CPG 0DN能够显著提高其血清 中禽白血病抗体水平，为CPG ODN的体液免疫效 应提供了科学依据；？11等[151认为不同序列的CPG ODN作为佐剂能够有效提高灭活的H5N1型禽流 感病毒疫苗的细胞免疫应答，可显著提高IL-6、IL-12和TNF-a等T h l型细胞因子相对表达量，为 CpG ODN增强细胞免疫应答提供了理论基础。目前 已有CpG丨018作为佐剂成功应用于上市的乙型肝炎疫苗，这为CpG ODN的临床安全性奠定了良好的基础|161。
本研究表明，将SARS-C〇V-2亚单位疫苗与自 行设计的对免疫细胞有刺激作用的CPG1826、铝佐 剂配伍后免疫小鼠，小鼠血清的IgG水平、结合抗体 水平、中和抗体水平均显著高于单用铝佐剂的疫苗组，且其小鼠血清的结合抗体水平上升早于单用铝佐剂的疫苗组，说明CPG1826作为协同佐剂，其与 铝佐剂对大肠埃希菌表达的sRBD亚单位抗原的协 同免疫增强作用，可以加速机体对抗原的免疫应答，缩短sRBD蛋白结合抗体的产生时间，有效提高 机体的中和抗体水平。同时，CpG1826特有的免
疫 刺激途径，能在短时间内（首针免疫7 d后）激活机 体产生高水平的T h l型细胞免疫应答，显著提升机体产生针对sRBD的特异性IFN-7的效应T细胞水 平。T h l途径免疫应答的激活，能增强机体的细胞免 疫反应，能刺激产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞 杀伤反应，这对清除宿主体内已感染病毒的细胞很有意义。
综上所述，增强免疫刺激、平衡ThlATh2型免 疫应答的CpG1826可以弥补单纯应用铝佐剂的不足。CpG1826有望成为一种SARS-CoV-2亚单位疫 苗的候选佐剂，提升疫苗的免疫增强效果，提高机 体的抗感染保护作用，然而CpG1826作为SARS-C〇V-2亚单位疫苗佐剂真正应用于临床还有很长的 路要走，包括符合药用辅料级别的C PG1826
的制
