国际生物制品学杂志 2()2()年12 月第 43 卷第 6 期Int J Biologicals，December 2()2(>，Vol. 43，No. 6
肠道病毒71型灭活疫苗（V ero细胞）接种
5年免疫持久性观察
鲁卫卫^孟繁岳2郭会杰1郝春生1毛群颖3高帆3卞莲莲3段凯4陈晓琦4
李新国4陈伟5陶红2张良豪5陈金华4李秀玲
鲁卫卫和孟繁岳对本文有同等贡献
1国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室，北京u m i i;2江苏省疾病预防控制中 心疫苗临床评价所，南京210009; 3中国食品药品检定研究院肝炎病毒室，北京102629; 4武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部430070; 5武汉生物制品研究所有限责任 公司医学事务部430070; 6上海生物制品研究所有限责任公司201403
通信作者：李秀玲，Email: 189****************
【摘要】目的观察肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)疫苗接种后5年的免疫持久性。方 法在DI期临
床试验免疫原性亚组中，对完成全程两针次免疫的、免前抗EV71中和抗体阴性人群进行 免疫后5年采血，并检测抗EV71中和抗体评价免疫持久性。完整检测时间点包括0、56 d和8、14、26、64个月。采用t检验和卡方检验分析数据。结果疫苗组和安慰剂对照组分别有235和255名受试 者具有全部检测点的中和抗体数据。接种后64个月，疫苗组抗EV71中和抗体几何平均滴度（369. 57) 高于对照组(55. 58)，且差异有统计学意义(t= 14. 28,P<0. 01)；分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定 标准，疫苗组抗体阳性率（l〇〇%、99. 57%、97. 87%)均高于对照组（69. 02%、61. 96%、59. 61%)且差异 有统计学意义(；1；2分别为1〇7.93、133.14、130.69，_?值均<0.()1)。疫苗接种后其他检测时间点的结果 与64个月类似。结论该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导较高的中和抗体水平和阳性率，在免 疫后5年依然保持较好的免疫持久性。
北京有名的胡同【关键词】肠道病毒71型灭活疫苗；中和抗体；免疫持久性
基金项目：国家科技重大专项“重大新药创制”(2016ZX09101120)
临床试验注册：美国临床试验注册平台，NCT01508247
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200706-00074
Five-year immunity persistence following immunization with inactivated enterovirus 71 vaccine (Vero
cell) Lu Weiwei1 , Meng Fanyue2 , Guo H uijie1, Hao Chunsheng', Mao Qunying3, Gao Fan3，Bian Lianlian3, Duan K ai4 , Chen Xiaoqi4, Li Xinguo4 , Chen Wei5 , Tao Hong2 , Zhang Lianghao5 , Chen Jinhua4，Li X iiding6
Lu Weivuei and Meng Fanyue contributed equally to the article
1 No.
2 Rearch Department National Vaccine& Serum Institute, Beijing 101111 , China；2Institute o f Clinical Evaluation o f Vaccines»J iangsu Provincial Center fo r Dia Control and Prevention , Nanjing 210009, China; 3Hepatitis Virus Rearch Department，National Institutes fo r Food and Drug Control，Beijing 102629，China; 4Rearch and Development Department，Wuhan Institute o f Biological Products Co.，L td.，Wuhan 430070，China; 3Medical A ffa ir s Department，Wuhan Institute o f Biological Products Co.，L td.，Wuhan 430070，China; 6Shanghai Institute o f Biological Products Co.，L td.，Shanghai 201403，China
Corresponding author:Li X iiding，Email: 189****************
【Abstract】Objective To investigate the 丨mmunity persistence five-year post vaccination of inactivated enterovirus 71 (EV71) vaccine. Methods Among the immunogenicity cohort in pha IE
•261••论著•
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trial, blood samples were collected from a subt of participants having fulfilled 2-do vaccination
protocol,and who rum EV71 neutralizing antibody (NAb) assay was negative on day 0. NAb was
tested to evaluate immunity persistence. The full ries of sampling time points included days 0 and 56, as
well as months 8，14，26，and 64. Data were analyzed by /-test and chi-square test. Results There were
235 subjects in vaccine group and 255 in placebo control group who had full ries of sampling points
奖金税怎么算results. At 64-month post vaccination, the geometric mean titer (GMT) of anti-EV71 NAb in vaccine
group (369. 57) was higher than that in control group (55. 58)，and the difference was statistically
significant = 14. 28, P <0. 01). By the cutoff NAb titer values of 8, 16, 32, at month 64, the
ropositive rates in vaccine group (100%, 99. 57%, 97. 87%) were higher than tho in control group
凉拌腐竹丝(69. 02%，61. 96%，59. 61 %)，and the differences were statistically significant (chi-square values were
107. 93, 133. 14, 130. 69, respectively；all P values <0. 01). The results at other obrved time points
post vaccination were similar with tho at month 64. Conclusion The EV71 vaccine induces a sustained
high level of NAb GMTs andropositive rates against EV71 for at least 5 years.
【Key words】Inactivated enterovirus 71 vaccine；Neutralizing antibody；Immunity persistence
Fund program：National Science and Technology Major Project for 44Major New Drug Innovation and
Development （2016ZX( )91 () 112())
Trial registration：v, NCT01508247
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-2()2()0706-()0074
肠道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71)属小 R N A病毒科肠道病毒属A型，是引起手足口病的 主要病原体之一[1]。EV7〗主要感染6月龄〜3岁婴幼儿，能引发多种临床症状，少数可引起严重并发 症[2]。近年来，手足口病已成为全球性传染病，给流 行国家和地区带来沉重的社会经济负担。目前尚无 有效的治疗EV71感染所致疾病药物，因此EV71 疫苗的研发至关重要。
全球范围内已有3种EV71疫苗上市，但有关 疫苗的长期免疫持久性数据较少。国药中生生物技 术研究院有限公司和武汉生物制品研究所有限责任 公司联合研发的e v7i疫苗在I一 m期临床试验中 显示了较好的安全性、免疫原性和有效性[>5]。免疫 后1年内对EV71感染所致手足口病保护效力为9().93%，对EV71所致的住院或重症病例的保护效 力达10()%™。免疫后2年内对手足口病、疱疹性 口腔炎和疱疹性咽峡炎等相关疾病保护率为%.57%[7]。该EV W疫苗于2016年被批准上市，目前正在进行IV期临床研究以观察其在大规模人群中 接种的安全性和保护效力。
本研究对DI期临床试验中EV71疫苗免疫后5 年内血清中抗EV71中和抗体水平变化情况进行观 察，以初步评价免疫后5年的免疫持久性。
1材料与方法
1.1疫苗和免疫程序
本次试验所使用的疫苗为含铝佐剂EV71灭活疫苗(V ero细胞），每剂320 U/0. 5 m l，由武汉生物 制品研究所有限责任公司生产，疫苗株为FY7VP5/ AH/CHN/2008 (C4亚型，基因库注册号：JXU25561)。安慰剂对照为不含EV71抗原的铝佐 剂。抗原含量由中国食品药品检定研究院以EV71 抗原国家标准品为标准进行测定。受试者按()、28 d 两针次免疫程序接种，12〜35月龄受试者接种于上 臂三角肌，6〜11月龄受试者接种于大腿前外侧。1.2试验设计
本研究是在6〜35月龄的健康人群中进行的一 项随机、双盲、安慰剂对照的IK期临床试验，于2012 年1月至2013年3月在中国4个研究中心(江苏省 东海县、邳州市、宝应县和北京市朝阳区）开展。受 试者共10 245名，随机抽取1 200名作为免疫原性 亚组人群在第一针免疫后〇d、56 d、8个月、14个 月、26个月采血，并对其免疫原性和免疫持久性进 行评价。此项研究仅对免疫原性亚组中免前阴性人 群进行采血检测抗EV71中和抗体，并且进行免疫 持久性评价。
江苏省东海县、邳州市和宝应县三个研究中心 人组受试者疫苗组436人、对照组55()人为免前阴 性，在本项研究中，免疫原性亚组的614名免前阴性 受试者完成了第一针免疫后5年血清采集，并送中 国食品药品检定研究院检测抗E V71中和抗体，评 价接种后5年免疫持久性。
本试验获得了江苏省疾病预防控制中心的伦理
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委员会的批准，受试者的监护人均签署了知情同意 书，并由江苏省疾病预防控制中心在赫尔辛基宣言 和临床试验管理规范的指导下实施本次临床研究。 1.3中和抗体检测
采集免疫原性研究亚组中免前阴性受试者血 清，送中国食品药品检定研究院，用文献[8-9]微量 细胞病变法检测抗EV 71中和抗体。1.4统计方法
采用SPSS 17.()软件对结果进行统计分析，受 试者人口学年龄和性别分布分别采用Z 检验和卡方 检验，抗体滴度经对数转换进行z 检验，中和抗体阳 性率比较采用卡方检验，P <〇. 05为差异有统计学 意义。血清抗体水平的阳性界值定为8，同时分别 以8、16、32为血清阳性标准进行血清阳性率的统计 分析，中和抗体滴度<8和>1 024的检测值分别以4 和1 ()24进行统计。
2
番茄种子结果
2.1受试者人口学
共614名受试者完成首针免疫后5年免疫持久 性血样采集并获得抗EV 71中和抗体检测结果，其 中490名受试者同时具有(）d 、56 d 、8个月、14个 月、26个月、64个月抗EV 71中和抗体检测数据，疫 苗组和对照组分别为235和255名，疫苗组和对照 组年龄分布(《 = (). 92,P = (). 92)和性别分布（f 二
0. 68，P = 0. 41)均衡可比，见表1。2. 2
免疫后5年抗EV 71中和抗体滴度
E V 71疫苗免疫后第56天和8、14、26、64个 月，疫苗组的抗E V 71中和抗体几何平均滴度 (geometric mean titer ,G M T )均高于对照组，且差 异有统计学意义G 值分别为57. 53、31. 36、38. 45、 23.39、14. 28;P 值均<0. 01)。由各检测时间点检 测结果可知，E V 71疫苗接种后的5年内抗E V 71中 和抗体G M T 水平较为稳定，接种后8个月GMT 下降约50%，在26个月显著增高；随着时间的推 移，对照组抗E V 71中和抗体G M T 增高，26个月后
增高较为明显，但仍低于疫苗组，见图1。
图1肠道病毒71型疫苗免疫后疫苗组和对照组抗肠道
病毒71型中和抗体滴度变化情况
2. 3免疫后5年抗EV 71中和抗体阳性率分别以抗EV 71中和抗体滴度8(x2分别为
816. 84、575. 40、581. 52、336. 82、107. 93)、16(；^2 分 别为 842. 90、642. 78、655. 04、343. 88、133. 14)、32 (X 2 分别为 748. 72、498. 68、562. 56、339. 49、 130. 69)作为阳性判定标准，E
V 71疫苗免疫后56 d 、 8个月、14个月、26个月、64个月，疫苗组抗EV 71 中和抗体阳性率均高于对照组（P 值均<().()1)。由 各检测时间点检测结果可见，疫苗组抗EV 71中和 抗体阳性率维持在一定水平，对照组抗EV 71中和 抗体阳性率随时间的推移明显增高，在第26个月后 增高较为明显。具体结果见表2。2. 4
不同年龄亚组免疫后5年抗EV 71中和抗体 阳性率和GMT
免前阴性人群6〜11月龄（z 2分别为76. 00、 174. 05、188. 98、107. 52、39. 65)和 12〜35 月龄亚组 (X 2 分别为 157. 19、4()1. 32、393. 33、194. 19、68. 87) 免疫后56 d 、8个月、14个月、26个月、64个月，疫苗 组抗EV 71中和抗体阳性率均高于对照组且差异有 统计学意义（P 值均<〇. ()1)，在26个月对照组抗 EV 71中和抗体阳性率显著增高，在64个月达到最 高值，见表3。6〜11月龄（《值分别为34. 90、 26.09、29. 85、18. 52、12. 29)和 12〜35 月龄亚组 U 值分别为 46. 30、17. 37、25. 89、14. 90、7. 34)免疫后
表1
肠道病毒71型疫苗受试者人口学基本情况组别接种疫苗时年龄/月
人数（比例/%)
台湾旅游景点
人奴
•T ± S 范围
中位数
女
男
疫苗组23517. 1土7.96〜3516.096(40. 9)139(59. 1)对照组25517.0 ±7. 66〜3515.0118(46. 3)137(53.7)总计
490
17. 0±7.8
6〜35
15.5
214(43.7)
276(56.3)
• 264 •
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时间/月
56 d 、8个月、14个月、26个月、64个月疫苗组抗
EV 71中和抗体G M T 均高于对照组且差异有统计
学意义（P 值均<〇.()1)。2个亚组中，疫苗组抗 EV 71中和抗体G M T 均在免疫后26个月、64个月 明显增高，对照组均在64个月显著增高，见图2。
3
讨论
EV 71灭活疫苗（V ero 细胞）I —I 期临床试 验显示了较好的安全性和免疫原性，M 期临床试验 中对EV 71感染所致手足口病保护效果达到90% 以上[6]，同时对不同基因亚型EV 71的交叉免疫原 性检测结果也表明，EV 71疫苗免疫后对B 1、B 4、
B 5、
C 4a 等亚型有良好的交叉中和作用[”M 1]。I
D 期 临床延期1年观察结果显示，该疫苗免疫后第二年
高一语文试卷
依然具有较好的免疫持久性和保护效果，但是有关 该疫苗长期的免疫原性和保护效果缺乏研究数 据[7]。在n 、in 期临床研究中，该疫苗两针免疫后
28 d 中和抗体达到最高值，免疫后半年中和抗体滴 度下降约一半，免疫后1年疫苗组抗E V 71中和抗 体滴度为130.77，中和抗体阳性率在90%以上；该 疫苗免疫后2年抗E V 71中和抗体滴度为551. 18, 中和抗体阳性率在95%以上，E V 71疫苗组中和抗 体水平和阳转率均显著高于安慰剂组[3’6]。EV71 疫苗免疫后2年中和抗体水平相较于1年增高，提 示E V 71自然感染的加强作用。在完成临床方案规 定的2年期随访后未进行后续随访观察，在5年后 仅进行了血清采集，未收集其他数据。对此期间的疫
表2肠道病毒71型疫苗接种后不同时间疫苗组和对照组抗肠道病毒71型中和抗体阳性人数（阳性率/%)
组别56 d 8个月14个月26个月64个月
抗体滴度>8疫苗组235(100. 00)233(99. 15)234(99. 57)228(97. 02)235(100. 00)对照组8(3. 13)51(20. 00)48(18. 82)80(31. 37)176(69. 20)抗体滴度>16疫苗组234(99. 57)226(96. 17)231(98. 30)228(97. 02)234(99. 57)对照组4(1.57)24(9.41)27(10.59)78(30. 59)158(61.96)抗体滴度>32疫苗组225(95. 74)202(85. 96)213(90. 64)227(96. 60)230(97. 87)对照组
4(1.57)
23(9. 02)
22(8. 63)
眼线的画法78(30. 59)
153(59.61)
表3不同年龄亚组免疫后抗肠道病毒71型中和抗体阳性(抗体滴度>8)人数（阳性率/%)
什么睡姿容易入睡组别
56 d 8个月14个月26个月64个月6〜n 月龄
疫苗组(n = 72)72(100. 00)71(98.61)71(98.61)70(97. 22)72(100. 00)对照组(n = 72)
1(1.39)17(23.61)11(15.28)19(30. 59)48(66.67)12〜35月龄
疫苗组(n= 163)163(100.00)162(99. 39)163(100. 00)158(96. 93)163(100. 00)对照组〇|=181)
7(3.87)
34(18. 78)
34(18.78)
61(33. 70)
129(71.27)
图2不同年龄亚组免疫后抗肠道病毒71型中和抗体几何平均滴度变化A 6〜11月龄B 12〜35
月龄
国际生物制品学杂志 2020 年丨2 月第 43 卷第6 期Int J Biologicals，December 2()2()，Vol. 43，No. 6• 265 •
苗组的疫苗加强、自然感染加强影响无法评估，这也 是本研究的局限性。
本临床研究中，每批次中和抗体检测试验均有 质控血清，所有检测结果均在质控血清成立的情况 下进行判定。对照组免前阴性人群受试者随年龄增 长，抗EV71中和抗体阳性率和抗体水平逐年升高，疫苗免疫后5年血清中和抗体阳性率达到69. 02%，中和抗体滴度为55. 58，提示我们EV71隐性感染
的作用。新加坡进行的EV71血清学调查研究发 现，2岁以上儿童血清阳性率以每年12%速率逐年 增加，在5岁及以上年龄儿童中EV71血清阳性率 维持在约50%[12]。泰国学者对泰国东北部省抗不 同亚型EV71中和抗体在不同年龄儿童中的血清流 行病学研究表明，在1〜11岁人群中抗EV71中和 抗体阳性率由13%升高至82%，中和抗体滴度由8 升高至48，其中1〜3岁血清阳性率有明显升高，但 仍低于50%[13]。在中国台湾进行的一项不同年份 血清EV71中和抗体相关研究也发现，在7〜11月龄婴幼儿中，抗EV71中和抗体阳性率较低（0%〜15%)，此后随后年龄的增长，中和抗体阳性率逐年 增高，在6岁及以上儿童中维持在较稳定水平(50%)[u]。中国大陆地区进行的类似研究也表明 抗EV71中和抗体阳性率随儿童年龄的增长逐年上 升，在6岁以后达到较稳定水平。其中，在安徽省六 安市区进行的不同年龄儿童的血清流行病学研究表 明,2006年和2007年此地区5〜7岁和8〜11岁儿 童抗EV71中和抗体阳性率分别在40. 5 %和60. 9%以上[15]；另一项相关研究结果也基本相似，上海地 区2014—2016年手足口病流行病学研究结果也发 现，6月龄〜1岁婴幼儿抗EV71中和抗体阳性率较 低，随后逐年升高，3〜5岁健康儿童50%以上血清 抗EV71中和抗体阳性，6〜18岁阳性率达到60%以上，提示EV71隐性感染的作用[16]。以上研究均 表明，EV71隐性感染在人群中普遍存在，与本研究 结果基本一致。
在对该疫苗免疫后5年的免疫持久性研究中表 明，该EV71疫苗免疫后第5年抗EV71中和抗体 阳性率疫苗组和对照组分别为1()()%和沾.()2%，中和抗体滴度分别为369. 57和55. 58，在EV71自然 感染的
作用下，虽然对照组阳性率和中和抗体滴度 有明显的升高，但依然低于疫苗组。在D1期临床试 验中，探索性研究结果初步表明抗EV71中和抗体 滴度16或32可能作为该疫苗的有效性免疫替代终点指标，因此，我们分别以抗EV71中和抗体滴度 8、16和32为阳性判定标准，分析结果趋势基本一 致，疫苗组阳性率均高于对照组。对不同年龄亚组 受试者进行分析，结果显示，EV71疫苗免疫后5年 6〜11月龄和12〜35月龄亚组的疫苗组中和抗体 阳性率均为1(>〇%，对照组分别为66. 67%和 71. 27%;6〜11月龄和12〜35月龄亚组的疫苗组 抗EV71中和抗体滴度分别为367. 14和37〇.M，对照组分别为63. 66和53. 43。疫苗组抗EV71中和抗体滴度较EV71疫苗免疫后2年略有下降，但 仍维持在较高水平，且抗EV71中和抗体阳性率和 中和抗体滴度疫苗组均显著高于对照组。该结果提 示，该EV71疫苗免疫后EV71的自然感染有明显 的加强作用，该疫苗免疫后5年依然具有较好的免 疫持久性和保护效力。
北京科兴生物制品有限公司的研究结果显示，EV71疫苗免疫后2年内对EV71感染所致疾病保 护率可达94%以上，抗EV71中和抗体滴度为56.3，依然高于对照组（14. 6)[5]；同时，5年的免疫 持久性观察结果显示，该疫苗免疫后5年内抗EV71中和抗体阳性率维持在一定水平，第5年阳 性率可达到94. 34%，作者认为EV71疫苗基础免 疫后暂时没有加强免疫的必要性[n]。中国医学科 学院医学生物学研究所的研究表明，EV71疫苗两 针免疫后4周抗EV71中和抗体滴度达到峰值(170. 6)，在免疫后半年下降至88. 3，但抗体阳性率 依然保持在较高水平(98%)，同时该项研究表明，该 疫苗两针免疫后第4周
和6个月，6〜23月龄和 24〜71月龄受试者中和抗体滴度无明显差异，提示 在EV71疫苗受试者中，血清阳性率和中和抗体滴 度在不同年龄组中相对稳定[~。另一项EV71疫 苗临床研究也表明，疫苗免疫后2年抗EV71中和 抗体阳性率仍在95%以上，且中和抗体滴度和阳性 率均显著高于对照组[19]。有关EV71疫苗这些研究结果均提示，EV71疫苗具有较好的免疫原性和 保护效果，与我们的研究结果较为相似。
本研究结果显示，该EV71疫苗两针基础免疫 后5年抗EV71中和抗体仍保持在较高水平，提示 该疫苗具有良好的免疫持久性。试验为EV71疫苗 接种后的长期免疫持久性提供了研究数据，同时对 我国大规模应用EV71疫苗的免疫策略制定具有指 导意义。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
