目前，国内上市的乙型肝炎疫苗包括重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗、汉逊酵母乙型肝炎疫苗和乙型肝炎疫苗（CHO细胞），其均为乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）成分。乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力测定采用小鼠体内法，由于液体疫苗的有效期一般为2～3年，作为参考品在完成标定、适用性研究后，实际应用的时间较短。乙型肝炎疫苗（CHO细胞）标准品长期放置后，其效价降低至较低水平，不能作为参考品。因此，研制稳定性好的参考品成为乙型肝炎疫（CHO细胞苗）质量控制待解决的问题。由于液体疫苗制备的参考品稳定性较差，因此，我们在
披荆斩棘的意思基因项目：“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”十一五科技重大专项乙型肝炎疫苗质量控制及评价研究（2009ZX10004-
802）．
作者单位：1中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室（北京100050）；2华北制药金
坦生物技术股份有限公司（石家庄050035）；3北京华尔盾
生物技术有限公司（北京102307）；4北京天坛生物制品股
份有限公司（北京100024）．
通讯作者：胡忠玉，E-mail：huzy67＠163．com ·疫苗研究·
重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品的研制邱少辉1，方鑫1，何鹏1，梁争论1，张红霞2，张卫婷2，赵坤福3，李德桂3，周根喜4，郭玉芬4，钟熙1，胡忠玉1
【摘要】目的制备重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品，用于重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）原液，经协作标定表面抗原蛋白含量后，加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂，冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品，并按《中国药典》三部（2010版）要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力，采用Reed-Münch计算ED50值；将冻干参考品置4℃（8周）、37℃（4和8周）后分别检测疫苗效力，分析其稳定性，依据Q10法进行效期推测；并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定，分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定，小鼠ED50均值为0．183μg，CV为50．5％；该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg／ml，规格为10μg／0．5ml；冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力影响较小，冻干参考品在37℃放置不同时间，效力变化不明显，表明冻干参考品稳定性较好，有效期约为7年；10批疫苗中，不合格率为10％，表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力检定的质控参考品。
【关键词】乙型肝炎疫苗；CHO细胞；参考品禽兽之变诈几何哉
【中图分类号】R373．2＋1R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2012）11-1423-04
Preparation of freeze-dried recombinant hepatitis B vaccine（CHO cells）reference
QIU Shao-hui*，FANG Xin，HE Peng，LIANG Zheng-lun，ZHANG Hong-xia，ZHANG Wei-ting，ZHAO Kun-fu，LI De-gui，ZHOU Gen-xi，GUO Yu-fen，ZHONG Xi，HU Zhong-yu（*National Institutes for Food and Drug Control，Beijing100050，China）
【Abstract】Objective To prepare freeze-dried recombinant hepatitis B vaccine（CHO cells）reference for evaluation of potency of recombinant hepatitis B vaccine（CHO cells）．Methods Bulk of qualified recombinant hepatitis B vaccine（CHO cells）was －lected as the raw material of reference．After collaborative calibration of HBsAg content，the bulk was added with aluminium adjuvant and prervative，then lyophilized to prepared freeze-dried recombinant hepatitis B vaccine reference on which overall control tests were performed according to the requirements in Chine Pharmacopoeia（VolumeⅢ，2010edition）．The potency of the freeze-dried reference was determined by ten independent tests in mice，and the ED50value was calculated by Reed-Münch method．The freeze-dried reference was stored at4℃for8weeks and37℃for4and8weeks，and determined for potency，bad on which the stability was analyzed，and the validity period was
predicted by Q10method．Ten batches of vaccine manufactured by two manufacturers were determined for potency and analyzed for suitability．Results All the quality indexes of prepared reference met the relevant require－ments，of which the mean ED50value to mice was0．183μg，with a CV value of50．5％．The protein content of the reference was 20μg／ml，while the specification was10μg／0．5ml．Neither prervative nor lyophilization procedure showed significant influence on the potency．After storage at37℃for various weeks，the potency of reference showed no significant change，indicating high sta－bility．The validity period of the reference was about7years．Of the ten batches of vaccines，10％were unqualified，indicating that the reference was suitable for the potency control of hepatitis B vaccine（CHO cells）．Conclusion The prepared freeze-dried refer－ence may be ud for potency control of recombinant hepatitis B vaccine（CHO cells）．
【Key words】Hepatitis B vaccine；CHO cells；Reference
酿酒酵母乙型肝炎疫苗冻干参考品研制成功的基础上［1］，通过优化冻干保护剂，研制出乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品，用于其效力评价。
1．材料与方法
1．1疫苗原液、对照品及参考品
检定合格的重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）原液、乙型肝炎疫苗（CHO细胞）小鼠效力对照品（批号：007）均由华北制药金坦生物技术股份有限公司提供；乙型肝炎疫苗（CHO细胞）国家参考品（液体疫苗930101批）由中国食品药品检定研究院肝炎室提供。乙型肝炎疫苗原液由中国食品药品检定研究院（实验室1）、华北制药金坦生物技术股份有限公司（实验室2）、北京天坛生物制品股份有限公司（实验室3）采用相同的标准操作程序（SOP）、相同的蛋白质标准品测定，并按照《中国药典》三部（2010版）中重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）原液检定［2］要求进行检定。
1．2实验动物
SPF级BALB／c小鼠，雌性，4～6周龄，体重16～18g，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所。
1．3冻干参考品的制备
1．3．1参考品的半成品制备：在原液中加入适量氢氧化铝佐剂、生理盐水，加入冻干保护剂（蔗糖、明胶），制备半成品。
1．3．2冻干参考品制备：半成品经分装、冻干后，制备乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力冻干参考品，
并按照《中国药典》三部（2010版）中重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）成品检定要求进行效力检定，同时对水分、分装均一性等进行测定。
1．4冻干参考品的协作标定
1．4．1原液中间品表面抗原蛋白含量测定：原液经稀释后得到原液中间品，经3个实验室按照《中国药典》三部（2010版）中Lowry法规定［2］，进行3次蛋白含量独立标定。
1．4．2冻干参考品效力测定：3个实验室采用统一的SOP分别对冻干参考品进行10次小鼠效力独立标定，具体方法为：将冻干参考品经0．5mg／ml铝佐剂稀释至浓度为10μg／ml，进行4、16、64、256倍稀释，分别经小鼠腹腔注射，1．0ml／只，每组10只，免疫后28d，采集血清检测抗HBs抗体，经Reed-Münch法计算ED50。
1．4．3冻干参考品的稳定性和适用性检测：将冻干参考品和同批疫苗分别置4℃（8周）、37℃（4和8周）后，测定疫苗效力，并分析保护剂、冻干前后、热加速对小鼠效力的影响，同时依据稳定性预测方法Q10法［3］，按Q10＝3，进行效期推测。
有效期＝放置天数×Q10n
式中n＝温度差／10。
将标定后的冻干参考品分发给2个疫苗生产厂家，并以企业乙型肝炎疫苗（CHO细胞）小鼠效力对照品作为对照，对2个生产企业10批疫苗进行效力测定，每批测定12次，分析其适用性。
2．结果
2．1参考品的检定
2．1．1原液的检定：各项指标均符合《中国药典》三部（2010版）规定，见表1。
表1原液检定结果
Tab1．Control tests on bulk
项目检测结果无菌检查符合规定支原体检查符合规定蛋白含量（μg／ml）167
特异蛋白带符合规定牛血清白蛋白残留量（ng／剂）3
CHO细胞DNA残留量（pg／剂）＜10
CHO细胞蛋白残留量（％）0．006
N端氨基酸测序N／A
纯度（HPLC，％）100．0
满洲里2．1．2冻干参考品检定：各项指标均符合《中国药典》三部（2010版）规定，见表2。
表2冻干参考品检定结果
Tab2．Control tests on freeze-dried reference
项目检测结果
鉴别试验符合规定
外观符合规定pH5．7
铝含量（mg／ml）0．25
游离甲醛（μg／ml）22
无菌检查符合规定
异常毒性检查符合规定
细菌内毒素检查（EU／ml）＜10
庆大霉素残留量（ng／剂）0．3
水分（％）＜3．0
分装变异系数（％）＜1
2．2冻干参考品的协作标定
2．2．1原液中间品的蛋白含量：检测结果显示，原液
中间品的蛋白含量均值为83．8μg／ml（95％可信限为77．7～89．8μg／ml），总CV为1．5％，见表3。该批参考品中抗原蛋白含量为17μg／ml。见表4。
表3原液中间品蛋白含量协作标定
Tab3．Collaborative calibration of protein content in intermedi－ate bulk
标定次数
123 186．188．886．287．01．8 284．682．583．183．41．3 379．882．180．980．91．4
合计／／／83．81．5
表4参考品半成品配伍
Tab4．Formulation of final bulk of reference
北京传统文化
组分含量
氢氧化铝佐剂（0．81mg／ml）2300ml 生理盐水630ml 冻干保护剂1330ml 原液1070ml 半成品总体积5330ml 最终疫苗中抗原蛋白含量17μg／ml
2．2．2冻干参考品效力：3家实验室标定的小鼠ED50均值为0．183μg，CV为50．5％。见表5。
表5冻干参考品效力协作标定结果
Tab5．Collaborative calibration of potency of reference
实验室次数稀释度ED50（μg）CV（％）总CV（％）1152．50．19127．2
291．20．110
356．20．178
2163．10．15853．8
271．50．140
328．60．35050．5 31106．40．09466．6
275．00．133
378．90．127
428．60．350
2．2．3冻干参考品的赋值：综合蛋白含量和小鼠效力标定结果，将CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg／ml，规格为10μg／0．5ml，按照《中国药典》三部（2010版）规定，在使用时，同规格疫苗供试品与同次试验的参考品ED50比值应不低于1．0。2．3冻干参考品的稳定性及适用性
2．3．1冻干效果及参考品稳定性：检测结果显示，冻干参考品在37℃放置不同时间，效力变化不明显；而同批疫苗的小鼠效力随着放置时间的延长而
出现显著下降。表明冻干保护剂、冻干工艺对CHO 细胞乙型肝炎疫苗的效力影响较小，见表6。2．3
．2效期推测：依据稳定性考核中37℃放置8周仍保持稳定的结果，计算冻干参考品4℃保存有效期为2102d，即有效期约为6年。
2．3．3冻干参考品的适用性：检测结果显示，有1个批次不合格，不合格率为10％，表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力质控。见表7和表8。
表6不同温度放置对疫苗和参考品ED50（μg）的影响
Tab6．Influence of storage at various temperatures on ED50（μg）values of bulk and reference
37℃
4周8周冻干参考品0．160．050．16同批疫苗0．262．951．59参考品冻干前0．20N／A N／A CHO疫苗液体参考品（批号：930101）0．66N／A N／A
表7冻干参考品对厂家1乙型肝炎疫苗的适用性（稀释度）Tab7．Suitability（dilution）of freeze-dried reference to hepati－tis B vaccine manufactured by manufacturer1
朋辈心理辅导>正方体折纸批号冻干参考品对照品样品比值（样品／参考品）128．5736．6335．001．2 163．1025．1286．791．4 228．5736．6333．041．2 263．1025．1263．101．0 327．6641．2931．621．1 427．6641．2955．652．0 527．6641．2928．981．0
表8冻干参考品对厂家2乙型肝炎疫苗的适用性（稀释度）Tab8．Suitability（dilution）of freeze-dried reference to hepatitis B vaccine manufactured by manufacturer2
批号冻干参考品对照品样品比值（样品／参考品）1106．444．084．70．8 275．058．384．71．1 378．937．579．31．0 478．937．591．41．2 528．647．064．02．2
3．讨论
乙型肝炎疫苗效力是评价疫苗质量稳定性和免疫原性的重要指标。研究表明，不同来源的乙型肝炎疫苗在体外相对活性、临床母婴传播阻断保护率、诱导抗-HBs抗体水平、细胞免疫应答、关键有效成分糖基化程度及特异性蛋白条带等方面均存在差异［4-8］，无法应用相同的效价参考品进行质控。WHO 在近期的关于乙型肝炎疫苗质量、安全和效力保证样品4℃
实验室均值（μg／ml）CV（％）
手指肚脱皮的建议中也提出，在乙型肝炎疫苗效力测定时，应使用产品特异性的参比品［9］。
英语单词大全现有的酿酒酵母乙型肝炎疫苗冻干参考品历经十年使用仍有良好的体内外反应及稳定性，但其复溶后黏度较大，适宜在25℃环境下使用。因此，本实验在后续参考品的制备中对冻干保护剂的配方进行了优化。制备的冻干参考品经检定，其水分及分装均一性均符合国家参考品的要求。
作为参考品评价的重要指标，其关键有效成分蛋白含量和动物效力均经过各实验室的协作标定。在参考品动物效力协作标定中，我们发现，不同次试验中参考品稀释度结果存在较大差异，这在多种疫苗的小鼠效力试验中出现［10-11］，表明影响动物实验因素较多，结果波动性较大，因而在小鼠效力评价实验中需要使用同质参考品进行同源比较。
本实验根据蛋白质含量和小鼠效力结果，将乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力冻干参考品蛋白含量定为20μg／ml，规格为10μg／0．5ml。使用标定的冻干参考品对2个疫苗生产厂家的各5批疫苗进行适用性研究，结果表明本参考品可用于乙型肝炎疫苗（CHO细胞）的效力检定。
依据本实验室积累的数据，乙型肝炎疫苗（CHO 细胞）液体参考品在4℃放置过程中效力不断下降。本实验制备的乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品在37℃放置8周后，效力仍保持稳定，未见明显下降，推测其有效期约为6年；同时其同批疫苗小鼠效力结果出现明显下降，表明冻干参考品相对液体参考品具有保存时间长、稳定性好的优势。
综上所述，乙型肝炎疫苗（CHO细胞）冻干参考品的活性及稳定性均优于液体参考品，可作为乙型肝炎疫苗（CHO细胞）效力评价的参考品。
参考文献
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（收稿日期：2011-12-19）
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