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蓝道行肌萎缩侧索硬化患者特异性iPS细胞系的建立及线粒体功能的
扼臂啮指>李完用初步研究
第一部分 ALS患者特异性i PS细胞系的建立目的利用仙台病毒将ALS患者外周血T细胞重编程为iPSC,建立无外源基因整合的患者特异性的iPS细胞系。方法利用Ficoll离心法分离ALS患者4mL外周血单个核细胞,在CD3和rIL-2的作用下选择性激活并扩增T细胞。培养T细胞5天后用携带OCT3/4,SOX2,Klf4和c-Myc基因的含温度敏感突变的仙台病毒转染T细胞。转染后的T细胞种植在饲养层MEF 上培养得到TiPSC。对重编程得到的TiPSC进行碱性磷酸酶染色,多能性标志物鉴定和核型鉴定。用PCR检测不同时期细胞内仙台病毒及4个重编程因子情况。结果iPSC的诱导效率达0.45%。仙台病毒转染T细胞10天左右出现多个细胞聚集,约15天左右出现iPSC克隆。这些iPSC碱性磷酸酶染色阳性,表达多能性标志物,传至30代后仍核型正常,且无外源基因整合。结论仙台病毒可以将ALS病人少量外周血T细胞重编程为iPSC,重编程效率高,且获得的iPSC无外源基因整合。第二部分ALS患者特异性iPSCs定向分化为脊髓运动神经元的研究目的在一系列小分子的作用下将ALS患者特异性的iPSCs定向分化为脊髓运动神经元方法选择生长状态良好的ALS-iPSCs进行分化。第一步:在T-GFβ/BMP信号通路抑制剂 DMH1(2μM)、SB431542(2μM)和 Wnt 信号激动剂 CHIR99021(3μM)的6天诱导下将iPSC分化为神经上皮祖细胞;第二步:加入尾侧化(视黄酸,RA 0.1μM)和腹侧化(SHH激动剂,Purmorphamine0.5μM)分子并降低CHIR99021浓度至3μM,培养6
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天,将神经上皮祖细胞分化为脊髓运动神经元祖细胞。第三步:撤掉在T-GFβ/BMP信号通路抑制剂和Wnt信号激动剂,调整RA浓度至0.5μM,Purmorphamine浓度至0.1μM,悬浮培养7天得到有丝分裂后运动神经元;第四步:有丝分裂后运动神经元贴壁培养,在notch信号抑制剂Compound E的作用下10天成熟化为成熟的神经元。同时我们尝试用一种强效的SHH激动剂,Smoothened Agonist(SAG)代替Purmorphamine 进行诱导分化。结果iPSC分化第6天得到SOX1 +,HOXA3+的神经上皮祖细胞,第12天得到Olig2+,NKX2.2-的脊髓运动神经元祖细胞(效率>95%),第19天得到HB9+,Tuj1+的有丝分裂后运动神经元,第29天得到Map2+,Chat+的成熟运动神经元(效率约90%)。而SAG诱导产生的神经元祖细胞共表达Olig2和NKX2.2,代表的可能是介于运动神经元祖细胞和中间神经元祖细胞的一种中间状态细胞。结论ALS-iPSC在特定浓度,特定顺序T-GFβ/BMP信号通路抑制剂、Wnt信号激动剂,视黄酸,SHH激动剂和notch信号抑制剂的作用下,1个月内即可高效率地分化为脊髓运动神经元。而SAG代替Purmorphamine的浓度尚需进一步摸索。第三部分ALS患者线粒体功能及相关机制的初步探究目的用ALS患者特异性iPSC分化的脊髓运动神经元对ALS患者线粒体功能及相关机制的初步探究方法将携带SOD1 D90A突变的ALS患者iPSC分化为脊髓运动神经元,选取SOD1 D90A iPSC经TALEN基因矫正后的89 iPSC分化的脊髓运动神经元作为对照组,用透射电镜观察运动神经元内线粒体、内质网等超微结构;用mitotraker green/red荧光染料标记线粒体,测量线粒体数量、长
度,观察线粒体运动;用calcein-AM荧光探针标记,观测线粒体膜通道孔开放情况;用Dilc(5)荧光染穿新衣
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山野乡村料标记,测量线粒体膜电势;用荧光蛋白标记内质网,观察内质网和线粒体相互作用情况。结果与89 iPSC 分化的运动神经元相比,D90A iPSC分化的运动神经元内线粒体肿胀,结构模糊;线粒体分布异常,数量减少,长度减短,运动减少。线粒体膜通道开放,线粒体电势降低。这可能是由于D90A运动神经元内质网片段化,与线粒体形成复合物,两者之间距离变小,线粒体内钙过度累积所致。结论ALS发病初期甚至潜伏期运动神经元便出现线粒损伤及功能异常,这可能是ALS发病的重要原因之一。