中国骨质疏松杂志 2020 年 12 月第 26 卷第 12 期 Ch$ J Osteoporo , December 2020, V0 26, No 12
1788 Published online doi ： 10. 3969/j.issn. 1006-7108. 2020. 12.013
-
论著-
雌二醇介导SIRT1-FOXO3#对成骨细胞自噬的作用和 机制研究
唐弊！蒋林 蒋成明 王惟达 周乾
长沙市一医院脊柱外科，湖南长沙410005
中图分类号：R681 文献标识码：A 文章编号：1006-7108( 2020) 12-1788-10
摘要：目的探讨雌激素是否能通过增强SIRTl 的活性进而对成骨细胞及其通路产生作用。方法17*-雌二醇(17*-E2)作
用于hFOB1. 19成骨细胞24 h ，应用荧光自噬检测试剂盒(MDC )检测成骨细胞自噬情况；应用蛋白免
疫印迹技术检测自噬相
关蛋白LC3的表达含量；应用蛋白免疫印迹技术检测AMPK 、磷酸化的AMPK &SIRT1蛋白活性的影响；在17*
-E2环境中，增强
或抑制SIRTl 的活性，通过电镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和关键蛋白质的改变；应用免疫印迹技术及实
时定量PCR 检测17*
-E2/SIRT1/AMPK/FOXO3a 对细胞自噬相关蛋白BCL-2、Bnip3、mTOR 及凋亡相关蛋白cespa-3的影响。
结果17*-E2( 10一8""。1/0,10一6""。1/0)增加成骨细胞的自噬，成骨细胞内LC3I I 蛋白活性增加；随着17*-E2浓度的增加,
SIRTl 蛋白表达量增加，且活性增强；17*-E2增加磷酸化AMPK 的水平，且AMPK 可以增加成骨细胞内SIRTl 的活性；SIRTl 激
动剂SRT1720及抑制剂Ex527可以干预17*-E2/SIRTl 对成骨细胞细胞凋亡的负调节作用；应用激光共聚焦显微镜和透视电
镜观察成骨细胞内17P-E2/SIRT1调节LC3蛋白，并发现SRT1720可增强成骨细胞内的双层膜结构的线粒体自噬小体的数量；
介导SIRTl 蛋白，17*
-E2可以增加自噬相关蛋白Bcl-2和Bnip3的表达，减低mTOR 的活性，增加FOXO3a 活性。结论SIRT1
在17*-E2介导的成骨细胞自噬作用中起到关键作用；17*-E2可能通过AMPK/SIRT1/F0X03a/mT0R 通路介导成骨细胞
自噬。
八角游乐园
关键词：17*-雌二醇；沉默信息调节因子1;5，-单磷酸腺Z 活化蛋白激酶；FOXO3基因编码的人类蛋白质；线粒体自噬
The effe/t and mechanism of estradiol mediated SIRT l -FOXO 3a on autophagy in osteoblasts
TANG Ye ! , JIANG Lin , JIANG Chengming , WANG Weida , ZHOU Qian Spine Surgery of Changsha First Hospital , Changsha 410005 , China
*
Corresponding author ： TANG Ye , Email : tangyecs@
Abstract ： Objectioe To investigate whether estrogen csn enhancs the activiy of Sirtl and then have an effect on osteoblasts and
their pathways. Methods Different concsntrations of 17*-E2 were applied to hFOB 1. 19 after 24 hours , the autophagy of
osteoblast% was detected by fluorescence autophagy detection kit (MDC ) ； The expression of autophagy related protein LC3 was detected by Western blotting ； The effect of AMPK , phosphorylated AMPK and SIRT1 on egg white activity was detected by
Western blotting ； SIRT1 was enhanetd or inhibited in 17*-E2 environment. The changes of cdl morphology and key proteins were
obrved by electron microscopy , confoctl lar microscopy and flow cytometry ； The effeett of 17*-E2/SIRT1/AMPK/FOXO3a
on autophagy related proteins Bcl-2, BNIP3, mTOR and caspass-3 were detected by immunoblotting and reel-time quantitative PCR.
Results 17*
-E2 ( 10"8 mmolF , 10"6 mmolL ) incread the autophagy of osteoblastt and the activity of lc3ii protein in
osteoblasts ； With the incree of 17*
-E2 conccntration, the expression of SIRT1 protein increed and the activity increed ； 17*-
E2 increed the level of phosphorylated AMPK , and AMPK increed theactivity of SIRT1 in osteoblasts ； SRT1720, SIRT1
agonist , and ex527, an inhibitor of SIRT1 Pt could interfere with the negative regulation of 17*-E2/SIRT1 on the apoptosit of
o,teobaat ； U,ing aaeeconfocaamiceo,copy and peepectiveeaecteon miceo,copy to ob,eevetheLC3 peotein eeguaated by 17*EE2 F SPRT1 in o,teobaat , SRT1720 wa,found Ptcouad enhancetheautophagy mediated by 17*EE2, inceeaetheautophagy bodie,in ce a , and inceeaethemitochondeiaaautophagy bodie,with doubaemembeane,teuctuee ； Ptcouad mediateSPRT1 peotein , 17*EE2 could incree the expression of autophagy related proteins Bcl-2 and BNIP3, reducc the activity of mTOR and incree the activity
of FOXO3a. Conclasion SIRT1 plays a key rola in 17*
-E2 mediated autophagy of osteoblasts ； 17*-E2 may mediate autophagy of
通信作者：唐~,Ema$：tangyecs@ 163wcm
osteoblasts through AMPK/SIRT1/FOXO3a/mTOR pathway.
Key words：17
*-E2；SIRT1；AMPK；FOXO3a；mitochondriaa autophagy
绝经后女性出现骨质疏松症是因为绝经之后女性卵巢功能减退进而导致雌激素水平降低，从而引起体
内成骨细胞和破骨细胞数量失衡，进而产生骨形成与骨吸收失衡［1］，造成绝经后女性骨量减少、骨质强度降低)雌激素的减少被认为是造成绝经后骨质疏松症的关键因素之一-2］)研究雌激素对成骨细胞的作用通路及相关基因，有利于进一步探讨绝经后骨质疏松症发生的机制，并且可以引导该疾病治疗做出更好预测方法、诊断方法和防治措施)沉默信息调节因子1(SIRT1%可通过抑制氧化应激诱导的损伤来纠正绝经后骨质疏松症的表型［3］。有研究［4］表明，17*-雌二醇(17p-E2%能够促进乳腺癌细胞的自噬，还可通过自噬抑制人脐静脉的衰老［5］。但17P-E2是否能通过AMPK/SIRT1途径引起成骨细胞自噬并起到保护作用的机制还需要进一步研究。
1材料和方法
1.1材料和分组
实验细胞分组：空白对照组和10「6mmol/L、10" mmol/L、10"mmol/L17
*-E2组。另外，根据实验分组加入激活剂或抑制剂：激活剂SRT1720(1$mol/ L)或抑制剂Ex527(400nmol/L)加入细胞预处理2 h后，加入10「6mmol/L17
*-E2，然后将细胞培养24 h，用PBS冲洗后备用。
1.2方法
1.2.1细胞自噬免疫荧光染色(荧光抗体标记): hFOB1.19细胞调整细胞密度，接种于六孔板中，待细胞贴壁后，加入相应的干预处理，具体步骤如下:①免疫荧光：细胞固定；通透；封闭；一抗孵育；二抗孵育；染核；观察。②细胞自噬检测MDC法：贴壁细胞在24孔板内爬片至所需要的密度，加入处理因素培养24h；MDC染色工作液配制；在所需的孔板内加入100$L的MDC染色工作液，室温避光染色20 a40min，弃去染色液，以1xWash Buffoo覆盖细胞爬片，观察细胞，计数，拍照；与EB双染色。
1.2.2实时定量PCR技术检测成骨细胞中相关蛋白mRNA的表达:①细胞干预：按照各组实验目的处理细胞，然后测量各组成骨细胞表达的SIRT1 mRNA、Boc/n-1mRNA、BCL-2mRNA、FOXO3a mRNA、caspa3mRNA的含量表达；②细胞收集：上述处理后的细胞，弃除细胞的培养液。将需要暂时保存的的样本冻存在-80O冰箱中，备用提取RNA；③细胞RNA的提取；④RNA纯度的测定；⑤实时定量PCR的检测。
1.2.3蛋白免疫印迹技术检测成骨细胞中SIRT1等相关蛋白的含量：在TBST内清洗,10min/次，共需洗3次。在避光条件下按照1:1的比例混合A 和B两种发光液，均匀的滴加在条带上，然后开始荧光检测，将整理好的图像用Image J软件分析，明确灰度值以及半定量分析目标蛋白质，数据统计并记录形态、数目情况，拍摄照片。
1.2.4流式细胞仪检测：采用AV/PI双重染色的FCM分析细胞凋亡，成骨细胞用膜联蛋白V-EITC 试剂盒
处理，用于膜联蛋白V-FITC/PI双重染色。流式细胞仪(BD FACS Aoa IIu)用于分析成骨细胞凋亡细胞，并且以低流速和最少1u105细胞。
1.2.5透射电镜：细胞取材；固定；脱水；包埋；固化；切片；3%乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色；使用日立HE-800型透射电子显微镜进行观察和拍摄。1.3统计分析
所有数据均表示为平均值士标准差(SD)。方差检验的均质性检验通过Loven检验进行。通过单向方差分析(ANOVA)和最低显着性差异(LSD)检验确定特定组之间的差异。％<0.05认为差异有统计学意义。借助于SPSS22.0软件进行统计分析。
忙的英文2结果
2.117p-E2在体外细胞实验中增强成骨细胞自噬和SIRT1活性
2.1.117
*-E2对成骨细胞内LC3I I蛋白活性的作用：用不同浓度的17P-E2作用成骨细胞24h或10-5mmol/P浓度作用不同时间，应用蛋白印记技术观察自噬相关蛋白LC3表达的变化。17p-E2引起成骨细胞自噬改变，具有浓度依赖性和时间依赖性(图1)。检测LC3蛋白表达及LC3II/PC3I比值，与对照组相比，作用相同时间中10「6mmol/P浓度组及相同浓度作用24h组的结果差异最明显，具有统计学意义(%<0.05)。
2.1.2MDC检测17
*-E2对成骨细胞自噬的影响：不同条件下的17P-E2作用于成骨细胞24h，用细胞自噬检测试剂盒检测成骨细胞自噬强度的变化，用
(o .二 u o u p o d ) u o =«.c o x d s o l {d C J
图1 17*-E2对成骨细胞内LC3II 蛋白活性的作用
A ：浓度依赖性；
张翠芝B ：时间依赖性。注:! %<0. 05。
Fig.1 The effect of 17*-E2 on LC3II protein activity in osteoblasts
A : cencentration dependeni ；
B : time-dependeni.
荧光显微镜观察结果。结果中10 mmol/L 组荧光 强度明显高于对照组，具有统计学意义（％＜0. 05 ）。
见图2。
control
17p-E2（10 8 mmol/L ）
17P-E2 (10^ mmoVL) + 3-MA
17^-E2 (10-6mmol/L)
(e h U O J p c d )
M .E
.E K J S
a
JS
l I l l o J n H
.X I 517卜E2 ( IO"mmol/L) -
+
长期股权投资分录17p-E2( 10-6mmol/L )-
-
+ +3-MA ・
・
・ +
图2 MDC 检测17*-E2对成骨细胞自噬的影响
注:! %<0. 05。
Fig.2 The effect of 17 *-E2 on autophagy of osteoblasts
detected by MDC
2・2 17*；2增强成骨细胞内SIRT1活性
记忆作文不同浓度的17 *；2处理成骨细胞后提取
SIRT1蛋白，结果用蛋白印迹法检测。随着17*
清风微凉-E2
浓度的增加,SIRT1蛋白表达含量增加，其中10Q
mmol/L 组的含量明显高于对照组，结果具有统计学 意义（％＜0.05 ）。实时定量PCR 检测SIRT1 mRNA
的含量，其中10「6mmol/L 组含量明显高于对照组 （%＜0.05）。见图 3。2.3
17*；2通过激活AMPK 并促进成骨细胞中SIRT1活性
在体外细胞实验中，将不同浓度的17P-E2应
用于成骨细胞，并检测细胞中p-AMPIK 和e-AMPIK
的蛋白质含量。结果表明：与相对比例相比，10Q mmol/L 17 *-E2可以明显增加p-AMPIK 的活性，而
不增加总AMPIK 的含量，具有统计学意义（％＜
0. 05），见图 4 A 。
用 Ex229 （ AMPK 激活剂,10 nmol/L ），化合物 C
（Compound C ,10 $mol/L , AMPIK 抑制剂）预处理成
骨细胞，并添加10-mmol/L17*E2培养细胞。检测
SIRT1蛋白的含量，结果表明相对于对照组,Ex229 可以明显增加SIRT1的含量，而化合物C 可明显抑
制SIRT1的表达（图4B ）。统计分析具有统计学意
义（%＜0. 05 ）。
2.4激活SIRT1增强17P-E2诱导的成骨细胞自噬
水平
2. 4.1 Fite-EC3 B 激光共聚焦显微镜观察17*-E2/
SIRT1对成骨细胞自噬的影响:
在体外细胞胞实验
图317*-E2对成骨细胞内SIRT1基因表达和蛋白活性的作用
A：蛋白印迹法检测；B：实时定量PCR检测SIRT1mRNA的含量)注：！%<0.05) Fig.3The effects of17*-E2on SIRT1gene expression and protein activity in osteoblasts A:Western blot method；B:real time quantitative PCR te deteet SIRT1mRNA centent・
p-AMPK
t<AMPK
P-actin
卩・actin
EX229-
2HCL-
图417*-E2/SIRT1对细胞内AMPK蛋白活性的影响。
注:!%<0.05)
Fig.4The effect of17*-E2/SIRT1on the activity of AMPK protein
中，用SRT1720（SIRT1激活剂）或Ex527（SIRT1抑制剂）预处理细胞2h，并添加了10-6mmol/L17* E2作用24h，来观察SIRT1活性的增强和减弱对17*E2中成骨细胞自噬的影响）本研究用免疫荧光抗体标记自噬相关蛋白LC3B蛋白（绿），DAPI染色剂染细胞核（蓝），并用激光共聚焦显微镜观察细胞自噬（图5A）。与空白对照组相比,10'6mmot/ L17p-E2可以增强自噬相关蛋白LC3的表达，而SRT1720可以强化17P-E2此作用（%<0.05）o
2・4.2流式细胞仪检测17P-E2/SIRT1对成骨细胞凋亡的影响：为了检测用17P-E2/SIRT1对成骨细胞凋亡的影响，本研究采用17p-E2、SRT1720
女孩的英文名
及
A DAPI overlay
control
LC3
17f-E2
17P-E2
+
SRT1720
17P-E2
EX527
u
女性特质
o
'c
l
q
-
c
o l
l
d
s
o
q
d8
」
*
17p-E2・+++
SRT1720--4--
EX527---+
图5Fite-LC3B激光共聚焦显微镜观察17*-E2/SIRT1对成骨细胞自噬的影响
A：激光共聚焦显微镜观察细胞自噬；B：自噬相关蛋白LC3的表达。注：!%<0.05)
Fig.5Effect of17*-L2/SIRT1on autophagy of osteoblasts obrved by Fite-LC3B lao cenfocel microscepe A:Obrvetion of autophagy by lao cenfocel microscepy；B:Expression of autophagy related protein LC3.
EX527分别处理细胞，通过V-FITC/PI双重染色检测凋亡率。结果显示（图6%,17P-L2组可降低细胞凋亡率，而SRT1720明显增强此作用（％＜0.05）o 2.4.3电镜观察细胞内17P-L2/SIRT1对细胞内线粒体自噬影响：进一步使用电子显微镜观察细胞的微观自噬状态（图7）,17P-L2可以增加细胞内自噬的线粒体小体数量，而SRT1720更加明显的增加了细胞内自噬的线粒体小体数量，但Ex527可以抑制此结果°结果表明，激活成骨细胞内SIRT1，可以增强细胞内线粒体自噬水平。
2.517p-L2介导的成骨细胞中SIRT1-FOXO3a-mTOR通路诱导成骨细胞自噬
在体外细胞实验中，添加10'6mmol/P17
*-L2，并添加SRT1720或Ex527以观察激活或抑制
SIRT1
