2021年3月
第31卷㊀第3期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
March,2021
Vol.31㊀No.3
王泽凤，高强，朱煜，等.红景天苷调控FoxO1/β-catenin 通路对2型糖尿病骨质疏松大鼠的保护作用研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(3):55-60.
Wang ZF,Gao Q,Zhu Y,et al.Protective effect of salidroside on type 2diabetic osteoporosis rats by regulating the FoxO1/β-catenin pathway [J].Chin J Comp Med,2021,31(3):55-60.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.03.009
[基金项目]河南省医学科技攻关计划联合共建项目(2018020219)㊂
[作者简介]王泽凤(1979 )，女，本科，主管中药师，研究方向：中药药理㊂E-mail:
红景天苷调控FoxO1/β-catenin 通路对2型糖尿病
骨质疏松大鼠的保护作用研究
王泽凤1∗，高㊀强1，朱㊀煜2，赵建林3，霍光强4
(1.新乡市中心医院药学部，河南新乡㊀453000;2.新乡医学院第一附属医院药学部，河南新乡㊀453100;3.新乡市中心医院内分泌科，河南新乡㊀453000;4.新乡市市直机关医院内科，河南新乡㊀453000)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨红景天苷(SDS)对2型糖尿病骨质疏松(DOP)大鼠的保护作用及叉头框转录因子O 亚
族1(FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)通路的影响㊂方法㊀高糖高脂饲养8周,8周后腹腔注射30mg /kg 链脲佐菌素(STZ)，第10周无菌条件下去除卵巢构建DOP 大鼠模型，建模成功后随机分为模型组㊁SDS 组㊁FoxO1激动剂组，每组8只；正常组8只大鼠常规饲料正常饲养相同时间㊂造模成功后第2天予SDS 组灌胃36mg /(kg ㊃d)SDS,FoxO1激动剂组灌胃40mg /(kg ㊃d)白藜芦醇(Res)，连续11周㊂血糖
仪检测空腹血糖水平；苏木精-伊红(HE)检测大鼠股骨组织形态；双能X 射线吸收法测定股骨组织骨密度情况；活性氧(ROS)试剂盒㊁超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒㊁丙二醛(MDA)试剂盒㊁谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒检测血清中ROS㊁SOD㊁MDA㊁GSH-Px 水平；蛋白免疫印迹检测股骨组织中FoxO1㊁β-catenin 蛋白水平㊂结果㊀建模后给药前，与正常组相比，模型组㊁SDS 组㊁FoxO1激动剂组空腹血糖水平升高(P <0.05)㊂给药后，模型组骨小梁出现明显断裂㊁破坏严重㊁数量减少;SDS 组㊁FoxO1激动剂组骨小梁明显断裂，但空隙间隔有所缓解，数量有所增加㊂与正常组相比，模型组空腹血糖水平，血清中ROS㊁MDA 水平升高(P <0.05)；股骨组织骨密度，血清中SOD㊁GSH-Px 水平，股骨组织中FoxO1㊁β-catenin 蛋白水平降低(P <0.05)㊂与模型组相比,SDS 组㊁FoxO1激动剂组空腹血糖水平，血清中ROS㊁MDA 水平降低(P <0.05)；股骨组织骨密度，血清中SOD㊁GSH-Px 水平，股骨组织中FoxO1㊁β-catenin 蛋白水平升高(P <0.05)㊂结论㊀
SDS 可激活FoxO1/β-catenin 通路，增强抗氧化应激作用，实现对DOP 大鼠的保护㊂
ʌ关键词ɔ㊀红景天苷;2型糖尿病；骨质疏松；叉头框转录因子O 亚族1/β-连环蛋白通路ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)03-0055-06
什么醋最好Protective effect of salidroside on type 2diabetic osteoporosis rats by
regulating the FoxO 1/β-catenin pathway
WANG Zefeng 1∗,GAO Qiang 1,ZHU Yu 2,ZHAO Jianlin 3,HUO Guangqiang 4
(1.Department of Pharmacy,Xinxiang Central Hospital,Xinxiang 453000,China.2.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453100
关于七夕的传说3.Department of Endocrinology,Xinxiang Central Hospital,Xinxiang 453000
4.Department of Internal Medicine,Xinxiang Municipal Government Hospital,Xinxiang 453000)
㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀To investigate the protective effect of salidroside(SDS)on type2diabetic osteoporosis (DOP)rats and its influence on the forkhead box transcription factor O1(FoxO1)/β-catenin pathway.Methods㊀The rat model of DOP was established by feeding rats a high gluco and high fat diet for8weeks,injecting the rats with30mg/kg streptozotocin(STZ)intraperitoneally after8weeks,and then recting the ovaries under sterile conditions in the10th week.After successful modeling,the rats were randomly divided into model group,SDS group,and FoxO1agonist group, with eight rats in each group;the eight rats in the normal group were fed a normal diet for the same length of time as for the other groups.On the cond day after establishing the model,the rats in the SDS group were given36mg/(kg㊃d)SDS by gavage,and the rats in the FoxO1agonist group were given40mg/(kg㊃d)resveratrol(Res)by gavage,for11weeks.The fasting blood gluco concentration w
as measured using a glucometer.the morphology of the femur was evaluated by hematoxylin&eosin(HE)staining,and femoral bone mineral was measured by dual energy X-ray absorptiometry.the rum concentrations of reactive oxygen species(ROS),superoxide dismuta(SOD),malondialdehyde(MDA),and glutathione peroxida(GSH-Px)were detecte by ROS,SOD,MDA kits,respectively;and the concentrations of FoxO1 andβ-catenin proteins in the femur were detected by Western blot.Results㊀After modeling and before administration, compared with the normal group,the fasting blood gluco concentration was higher in the model group,SDS group and FoxO1agonist group(P<0.05).After administration,the bone trabeculae of rats in the model group showed obvious fracture,rious damage,and reduced number;the bone trabeculae of rats in the SDS group and FoxO1agonist group showed obvious fracture,but the trabecular space was reduced,and the trabecular number was incread.Compared with the normal group,the fasting blood gluco and rum ROS and MDA concentrations were higher in the model group(P< 0.05),while the femoral bone mineral density,rum SOD and GSH-Px concentrations,and FoxO1andβ-catenin concentrations in the femur were lower(P<0.05).Compared with the model group,the fasting blood gluco and rum ROS and MDA concentrations were lower in the SDS group and FoxO1agonist group(P<0.05),while the femoral bone mineral density,and rum SOD and GSH-Px concentrations,and femoral FoxO1andβ-catenin concentrations in the femur were higher(P<
0.05).Conclusions㊀SDS can activate the FoxO1/β-catenin pathway,enhance antioxidant stress,and protect DOP rats.
ʌKeywordsɔ㊀salidroside;type2diabetes mellitus;osteoporosis;forkhead box transcription factor O1/β-catenin pathway
㊀㊀2型糖尿病性骨质疏松(diabetic osteoporosis, DOP)属全身性骨骼疾病，是糖尿病严重时的骨骼并发症，会导致骨重减少㊁骨组织微结构改变㊁骨骼脆性增加[1]；发病率㊁致残率呈逐年上升趋势，大大降低患者生活质量，造成沉重的经济负担㊂目前DOP的治疗以控制血糖㊁抗骨质疏松为主，寻找更为安全有效的DOP药物仍是目前治疗重点[2]㊂红景天苷(Salidroside,SDS)具有抗炎㊁抗疲劳㊁抗氧化㊁抗细胞凋亡㊁抗骨质疏松和降血糖等功效，但药理作用机制尚不明确[3]㊂叉头框转录因子O亚族1 (Forkhead box transcription factor O1,FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)通路在维持成骨细胞凋亡和氧化应激中发挥作用，抑制FoxO1/β-catenin通路可影响氧化应激从而促进凋亡基因介导的细胞凋亡㊁DNA修复基因生长停滞㊁促进DNA损伤蛋白表达[4]㊂推测SDS可能通过FoxO1/β-catenin通路实现对DOP的保护㊂因此，本文构建DOP大鼠模型，探究SDS对DOP大鼠的影响㊂1㊀材料和方法
1.1㊀实验动物
41只12周龄SPF级健康雌性SD大鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司[SCXK(京) 2019-0004]
，动物饲养于新乡医学院实验动物中心[SYXK(豫)2019-0016]，体重(200ʃ10)g㊂所有大鼠在温度(24ʃ1)ħ㊁光照/黑暗(12/12)h㊁正常饮水饮食IVC系统下暂养㊂符合动物伦理学3R原则㊂1.2㊀主要试剂与仪器
高糖高脂各组分比例：胆酸钠0.1%㊁猪油10%㊁基础饲料61.9%㊁蔗糖20%㊁蛋黄粉8%；链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)(美国Sigma公司，批号: S0131);SDS(原料药，大连美仑生物技术有限公司，纯度ȡ98%，批号:K06437)；白藜芦醇(Resveratrol, Res)(格鲁斯生物科技公司，批号:501-36-0)；苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒㊁EDTA脱钙液(上海生工生物技术公司，批号: E607318㊁E671001)；活性氧(Reactive oxygen species,ROS)试剂盒㊁超氧化物歧化酶(Superoxide
dismuta,SOD)试剂盒㊁丙二醛(Malondialdehyde, MDA)试剂盒㊁谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxida,GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为:E004-1-1㊁A020-2-2㊁A003-1-2㊁A005-1-2)；一抗兔抗FoxO1㊁β-catenin㊁β-actin，二抗羊抗兔IgG(英国Abcam公司，批号:ab39670㊁ab32572㊁ab8227㊁ab6721)㊂
血糖仪(上海罗氏制药有限公司，型号:ACCU-CHEK)；双能X射线密度仪(上海硕舟电子科技有限公司，型号:CB3351MD)；光学显微镜(德国徕卡公司，型号:DM500)；蛋白凝胶成像系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号:iBright CL750)㊂1.3㊀实验方法
1.3.1㊀动物分组及给药处理
33只大鼠建立DOP模型，高糖高脂饲养8周, 8周后禁食12h腹腔注射30mg/kg STZ，第10周无菌条件下去除卵巢，摘除卵巢72h检测空腹血糖含量,ȡ16.70mmol/L即为DOP模型建立成功[5]㊂33只大鼠模型成功24只，成功率72.73%㊂24只大鼠随机分为模型组㊁SDS组㊁FoxO1激动剂组，每组8只；正常组8只大鼠常规饲料饲养相同时间㊂造模成功后第2天SDS组灌胃36mg/(kg㊃d)SDS[6], FoxO1激动剂灌胃40mg/(kg㊃d)Res[7]，灌胃体积均为10mL/kg，正常组和模型组灌胃等体积的生理盐水，连续11周㊂
1.3.2㊀样本采集
血液采集：造模结束和给药结束均禁食大鼠12 h，一次性注射器腹腔采血，部分置于抗凝管中检测血糖水平；部分室温4000r/min离心15min，分离血清，置于-20ħ冰箱保存待用㊂
双侧股骨采集：给药结束后剥离股骨双侧肌肉和结缔组织，取下双侧股骨，左侧置于4%多聚甲醛中固定，右侧置于-80ħ冰箱㊂
1.3.3㊀血糖仪检测空腹血糖水平
血糖仪检测腹腔血中空腹血糖水平㊂
抒情散文600字
1.3.4㊀HE检测大鼠股骨组织形态
股骨组织于4%多聚甲醛中固定24h后，放入20倍体积EDTA脱钙液中脱钙处理，脱钙组织用大头针轻刺，大头针可轻易穿过骨组织，则脱钙良好㊂按照HE染色试剂盒经苏木精染色㊁伊红复染，显微镜下观察股骨组织形态㊂构建近义词
1.3.5㊀双能X射线吸收法测定股骨组织骨密度情况
取出股骨组织，室温放置直至解冻，双能X射线密度仪检测各组股骨密度㊂
1.3.6㊀试剂盒检测血清中ROS㊁SOD㊁MDA㊁GSH-Px水平
分别按照ROS㊁SOD㊁MDA㊁GSH-Px试剂盒说明书检测血清中ROS㊁SOD㊁MDA㊁GSH-Px水平㊂1.3.7㊀蛋白免疫印迹检测股骨组织中FoxO1㊁β-catenin蛋白水平
股骨组织立即浸入液氮中，迅速研磨至细粉㊂按5g/L组织加入RIPA强效裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂)，冰上匀浆30min,4ħ离心机15000r/min离心20min，吸取上清即为股骨组织总蛋白㊂相同蛋白量上样㊁凝胶电泳分离，转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭；分别加入一抗FoxO1㊁β-catenin㊁β-actin(稀释比均为1ʒ2000)后4ħ孵育过夜；加入对应二抗(1ʒ5000)室温孵育1 h㊂凝胶成像系统对条带进行灰度分析㊂
1.4㊀统计学方法
SPSS25.0软件对所有数据进行统计学分析，计量数据均采用平均数ʃ标准差( xʃs)表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验㊂P<0.05，差异有统计学意义㊂
2㊀结果
2.1㊀SDS对大鼠空腹血糖的影响
又一本建模后给药前，与正常组相比，模型组㊁SDS组㊁FoxO1激动剂组空腹血糖水平升高(P<0.05)㊂给药后，与正常组相比，模型组空腹血糖水平升高(P< 0.05)；与模型组相比,SDS组㊁FoxO1激动剂组空腹血糖水平降低(P<0.05)㊂见表1㊂
表1㊀4组大鼠空腹血糖水平比较( xʃs,mmol/L)
Table1㊀Comparison of fasting blood gluco levels
in4groups of rats
组别
Groups
建模后给药前
After modeling and
before administration
给药后
After administration
正常组
Normal group 6.98ʃ0.86 6.96ʃ0.81
模型组
Model group19.25ʃ3.21#20.18ʃ4.15#
SDS组
SDS group19.35ʃ3.18#14.48ʃ2.18∗FoxO1激动剂组
FoxO1agonist group19.27ʃ3.14#15.44ʃ3.11∗F39.08829.645
P<0.001<0.001
注：与正常组相比,#P<0.05；与模型组相比,∗P<0.05㊂Note.Compared with the normal group,#P<0.05.Compared with the model group,∗P<0.05.
2.2㊀SDS 对大鼠股骨组织形态学影响
正常组骨小梁数目和形态正常；模型组骨小梁出现明显断裂，破坏严重㊁数量减少;SDS 组骨小梁明显断裂，但空隙间隔有所缓解，数量有所增加;FoxO1激动剂组骨小梁明显断裂，间隙稍有所增加，但不明显㊂见图1㊂
2.3㊀SDS 对大鼠股骨组织骨密度影响
与正常组相比，模型组股骨组织骨密度降低(P <0.05)；与模型组相比,SDS 组㊁FoxO1激动剂组股骨组织骨密度升高(P <0.05)㊂见表2㊂2.4㊀SDS 对大鼠血清中ROS ㊁SOD ㊁MDA ㊁GSH-
Px 水平的影响
与正常组相比，模型组血清中ROS㊁MDA 水平升高(P <0.05),SOD㊁GSH-Px 水平降低(P <0.05)；与模型组相比,SDS 组㊁FoxO1激动剂组血清中ROS㊁MDA 水平降低(P <0.05),SOD㊁GSH-Px 水平升高(P <0.05)㊂见表3㊂
2.5㊀SDS 对大鼠股骨组织中FoxO1㊁β-catenin 蛋白水平的影响
与正常组相比，模型组股骨组织中FoxO1㊁β-catenin 蛋白水平降低(P <0.05)；与模型组相比,SDS 组㊁FoxO1激动剂组股骨组织中FoxO1㊁β-
catenin 蛋白水平升高(P <0.05)㊂见图2㊁表4㊂
表2㊀4组大鼠股骨组织骨密度比较( x ʃs )Table 2㊀Comparison of bone mineral density of femoral
tissue in 4groups of rats
组别Groups 骨密度(g /cm 2)Bone density 正常组Normal group 0.29ʃ0.06模型组Model group 0.17ʃ0.01#SDS SDS group 0.24ʃ0.03∗FoxO1激动剂组FoxO1agonist group
0.22ʃ0.01∗F 16.794P
<0.001
注：与正常组相比,#P <0.05；与模型组相比,∗P <0.05㊂
Note.Compared with the normal group,#P <0.05.Compared with the model group,∗P <0.
05.
图1㊀4组大鼠股骨组织形态学变化(HE 染色)
Figure 1㊀Morphological changes of femur in 4groups of rats (HE staining)表3㊀4组大鼠血清中ROS㊁SOD㊁MDA㊁GSH-Px 水平比较( x ʃs )
Table 3㊀Comparison of ROS,SOD,MDA,GSH-Px levels in rum of 4groups of rats
组别Groups
ROS(IU /mL)SOD(U /mL)MDA(mmol /L)GSH-Px(pmol /L)正常组Normal group 225.15ʃ30.15137.65ʃ20.66 5.13ʃ0.8679.86ʃ9.14模型组Model group 435.23ʃ51.38#63.41ʃ11.24#12.43ʃ1.15#40.18ʃ5.77#SDS 组SDS group
286.38ʃ41.44∗115.47ʃ8.26∗7.56ʃ1.45∗66.14ʃ6.83∗FoxO1激动剂组FoxO1agonist group
298.61ʃ38.42∗
109.76ʃ9.16∗
8.11ʃ0.97∗64.18ʃ5.91∗
F 37.27744.13257.85043.847P
产品经理英文<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
注：与正常组相比,#
P <0.05；与模型组相比,∗
P <0.05㊂
Note.Compared with the normal group,#P <0.05.Compared with the model group,
∗
P <0.05.
注:A：正常组;B：模型组;C:SDS组;D:FoxO1激动剂组㊂
图2㊀4组大鼠股骨组织中FoxO1㊁β-catenin蛋白表达情况Note.A,normal group.B,model group.C,SDS group.D, FoxO1agonist group.
Figure2㊀FoxO1andβ-catenin protein expression in femoral
tissues of4groups of rats
表4㊀4组大鼠股骨组织中FoxO1㊁β-catenin
油烟机十大品牌蛋白水平比较( xʃs)
Table4㊀Comparison of FoxO1andβ-catenin protein
levels in femoral tissues of4groups of rats
组别
Groups FoxO1β-catenin
正常组
Normal group0.93ʃ0.110.76ʃ0.09
模型组
Model group0.24ʃ0.04#0.15ʃ0.04#
SDS组
SDS group0.53ʃ0.05∗0.39ʃ0.04∗FoxO1激动剂组
FoxO1agonist group0.58ʃ0.04∗0.37ʃ0.03∗F143.940167.760
P<0.001<0.001
注：与正常组相比,#P<0.05；与模型组相比,∗P<0.05㊂Note.Compared with the normal group,#P<0.05.Compared with the model group,∗P<0.05.
3㊀讨论
糖尿病和骨质疏松都为常见代谢类疾病，糖尿病随着发病时间的延长，血糖长时间异常㊁胰岛素缺乏或不足㊁降糖药物使用等影响骨重量和骨质量，导致骨质疏松[8]㊂研究表明糖尿病患者并发骨质疏松达50%以上，造成致残率升高[9]㊂因此治疗DOP对于糖尿性患者意义重大㊂SDS是从红景天中提取的活性成分，属植物中广泛存在的酚苷类化合物，具有调节免疫系统㊁抗氧化㊁抗衰老作用[10]；在应激性高血糖中具有抗氧化应激和保护应激高糖心肌细胞作用[11]㊂本研究发现，建模后给药前，与正常组相比，模型组㊁SDS组㊁FoxO1激动剂组空腹血糖水平升高，说明DOP模型建立成功㊂给药后，与正常组相比，模型组空腹血糖水平升高，股骨组织骨密度降低，骨小梁出现明显断裂，破坏严重㊁数量减少，提示长时间处于高血糖状态可降低骨密度，表现为骨小梁结构破坏㊁数量减少，骨骼脆性增
加㊂与模型组相比,SDS组㊁FoxO1激动剂组空腹血
糖水平降低，股骨组织骨密度升高，骨小梁结构有
三岁宝宝所缓解，提示SDS与FoxO1激动剂功能类似，均可
缓解DOP空腹血糖水平升高现象，从而增加骨密
度，实现对DOP的保护㊂
正常情况下机体ROS的产生与消除处于动态
平衡中，但当长时间处于高血糖水平时该平衡被打
破，机体内产生过多的ROS，抗氧化能力下降，破骨
细胞在细胞水平上产生一系列损伤导致大部分细
胞的增殖㊁分化受阻，促进凋亡[12]㊂SOD是机体抗氧化功能核心，可清除机体内氧自由基，减少组织
损伤;GSH-Px可催化过氧化氢酶的分解，降低过氧
化氢氧化损伤;MDA反映机体氧化损伤情况[13-15]㊂本研究发现，与正常组相比，模型组血清中ROS㊁MDA水平升高,SOD㊁GSH-Px水平降低，提示DOP 中抗氧化与氧化平衡被打破，机体氧化能力增强㊁抗氧化能力减弱，导致机体处于氧化应激状态㊂与模型组相比,SDS组㊁FoxO1激动剂组血清中ROS㊁MDA水平降低,SOD㊁GSH-Px水平升高，提示SDS 与FoxO1激动剂功能类似，均可改善ROS㊁MDA㊁SOD㊁GSH-Px水平，纠正抗氧化与氧化不平衡状态，从而减少对机体的损伤㊂
FoxO1作为叉头框转录因子之一，几乎在所有组织中表达，调控生长发育㊁细胞老化㊁氧化应激等过程[16]，过表达Foxo1可减弱糖尿病引起的肾近端肾小管细胞间质纤维化㊁ROS产生和凋亡增加现象，从而实现对高糖诱导的糖尿病肾病的保护[17]㊂在SDS中，增强SIRT1-FoxO1途径介导的自噬可预防氧化应激导致的内皮损伤[18]㊂β-catenin作为Wnt信号通路重要蛋白，可维持骨重建，缺失将导致骨病发生[19]㊂在DOP中上调FoxO1转录活性增加β-catenin水平，增强机体抗氧化作用防止骨丢失，从而影响成骨细胞的增殖和分化，实现对DOP的保护[20]㊂本研究发现，与正常组相比，模型组股骨组织中FoxO1㊁β-catenin蛋白水平降低，提示DOP中机体FoxO1水平降低对β-catenin作用减弱，导致机体抗氧化与氧化平衡破坏，从而加速骨密度降低，加重疾病㊂与模型组相比,SDS组㊁FoxO1激动剂组骨组织中FoxO1㊁β-catenin蛋白水平升高，提示上调FoxO1转录活性增加β-catenin水平可增加机体抗氧化作用防止骨丢失，实现对DOP的保护，且SDS 与FoxO1激动剂功能类似，推测SDS可能通过激活
