中国口岸科学技术
双重RT-PCR快速检测水仙普通潜隐病毒和尼润潜隐病毒陈细红*1蔡伟1肖颖1李敏1高芳銮2沈建国”
摘要目的：针对水仙上水仙普通潜隐病毒（/Varc/ssus com m on/atent Wrus,NCLV )和尼润潜隐病毒（ZVer/ne M ent Wrus,NeLV)建立同时检测两种病毒的双重RT-PC R方法..方法：参照G enB ank上已报道的N C LV和NeLV C P基因序列设计特异性引物，在单一 RT-P C R检测方法的基础上，通过对P C R反应体系和反应条件的优化，建立了可以同时检测NCLV 和N eLV的双重RT-P C R方法，并对其特异性、灵敏度进行了测定，同时应用于水仙实际样品的检测。结果：建立的双重RT-P C R检测方法具有良好的特异性和灵敏度，能够有效区分水仙上NCLV、N eLV两种病毒，并且检测灵敏度不低于单一RT-PCR，水仙实际样品检测结果与单一 RT-PC R检测结果相符：结论：建立的NCLV、NeLV双重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、准确性好，适用于口岸及农业生产上NCLV、N eLV的快速检测。
关键词水仙普通潜隐病毒；尼润潜隐病毒；双重RT-PCR
Rapid D etection of Narcissus Common Latent Virus and Nerine Latent Virus by D uplex R T-P C R CHEN Xi-Hong1CAI Wei1XIAO Ying1LI Min1GAO Fang-Luan2SHEN Jian-Guo1*
A b stra c t This paper aim s to develop a rapid, nsitive and specific duplex R T-PC R method to sim
ultaneously detect N a rcissu s com m on la te n t viru s(NCLV) and N e rin e la te n t viru s(NeLV). Two pairs of specific prim ers were designed from the conrved regions of C P gene in the published NCLV and NeLV quences from GenBank. A duplex R T-PC R assay was established and optim ized for sim ultaneous detection of the two virus bad on single R T-PC R. The specificity and nsitivity were also determ ined. In addition, this assay was applied to detect narcissus sam ples. The established duplex R T-P C R method can effectively distinguish NCLV and NeLV on narcissus which showed high specificity and nsitivity. The method dem onstrating nsitivity is not lower than that of single R T- PCR. The result obtained from the duplex R T-PC R assay is consistent with tho of single PCR assays. It is concluded that the duplex R T-P C R assay reported here is highly specific, nsitive and accurate, which could be applied to the rapid detection of both NCLV and NeLV at port and agricultural production.
K ey w o rd s N arcissus com m on la te n t v iru s；N e rin e la te n t v iru s；duplex R T-PC R
基金项目：国家重点研发计划（2016YFF0203203 )
第一作者：陈细红U989-)，女，汉族，福建泉州人，学士，农艺师，主要从事植物病毒研究，E-mail: **********************通讯作者：沈建国（1978—），男，汉族，安徽芜湖人，博十，研究员，主要从事植物病毒及其防治研究，E-mail: *****************
1. 福州海关技术中心福州350001
2. 福建农林大学植物病毒研究所福州350002
1. Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 350001
2. Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 3v50002
43
CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY
水仙属于石蒜科（Amaryllidaceae )水仙属(JVara'ssus)多年生草本植物，是我国重要的传统出 口名花，兼具观赏和药用价值气病毒病是水仙生产上最主要的病害之一，且多数呈复合侵染％受病 毒侵染的水仙往往表现为鱗球茎退化、花枝减少、香 气变淡、植株矮化等症状，导致水仙产量和品质大幅 下降，对水仙生产造成严重影响水仙普通潜隐病毒(Nardssus common /atent Wrus,N C L V)和尼润潜隐 病毒（Aferine Ment virus,NeLV )是水仙上的两种重 要病毒，都属于乙型线状病毒科（56[3此；^1>/也6)、香石竹潜隐病毒属（Car;aWrus )成员。N C L V和 N e L V病毒基因组为正义单链R N A，含有6个开放阅 读框，全长分别约8539 nt和8281 nt【4_5!。N C L V和 N e L V病毒粒子形态为线状，侵染水仙后，通常表现 为隐症，很难从症状上鉴定和K分两种病毒，在口岸 及农业生产检测中容易漏
检。广告管家
水仙病毒病的防治十分困难，目前没有有效的防 治手段，因此，加强水仙N C L V和N e L V的早期检测 和日常监测，对于控制这两种病毒的发生、传播和扩 散，以及保护水仙安全生产具有重要意义。利用R T- P C R技术检测植物病毒具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的优点，其中，在R T-P C R基础上改进的多 重R T-P C R能够一次检测多个靶标病毒，检测效率显 著提高，近年来已广泛用于植物病毒的检测鉴定
但截至目前，关于N C L V、N e L V双重R T-P C R检测 方法未阽报道本研究根据N C L V、N e L V的C P基因 序列设汁特异性引物，经过反应体系和反应条件的优 化，建立了同时检测两种病毒的双重R T-P C R方法，旨在为水仙上N C L V、N e L V的快速检测提供技术支持1材料与方法
1.1材料
水仙样品为口岸截获和田间采集，共计80份：水仙普通潜隐病毒（N C L V)、尼润潜隐病毒（NeLV )毒源为本实验室保存
RNeasy Plant Mini Kit，Q I A G E N 公司产品；
D N A M a r k e r、大肠杆菌D H5a感受态细胞、D N A快 速纯化回收试剂盒，天根生化科技有限公司
产品；Random Hexamer Primer,Thermo Fisher s c i e n t i f i c公司 产品；反转录酶、R N A酶抑制剂，Promega公司产品；T a q D N A聚合酶、p M D-18T,TaKaRa 公司产品；A B1 VeritiPCR仪，美国应用生物系统公司产品；G:B O X F3凝胶成像系统，Syngene公司产品
1.2方法
预产期的计算方法
1.2.1引物设计与合成
参照美国国家生物技术信息中心（National Center f o r Biotechnology Information, NCBI ) GenBank 上已 J艮道的N C L V和N e L V的C P基因序列设计2对特异性 引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合 成引物名称、序列、长度及预期扩增目的片段大小 见表la
1.2.2总R N A的提取
根据RNeasy Plant Mini Kit说明书提取水仙样品 的总R N A，保存于-80°C的冰箱中备用。俄语英文
1_2_3 c D N A合成
在P C R管中加人待测样品总R N A 3 (X L、100 |x mol/L Random Hexamer Primer 1 |x L,RNa-free ddH2〇7 (x L,70°C水浴lOmin，随后迅速置于冰上5
表1引物名称、序列、长度和预期目的片段大小
Table 1Primer name, quence, length and expected product size
引物名称引物序列（5’-3’）引物长度/bp预期目的片段大小/bp NCLV-F CCTGACCCCAGCAATCCTT19479
NCLV-R GGCCTCCGAATTAACCCCTC20
NeLV-F GTCCCGCCTGAATCAATAGCA21218
NeLV-R TTCGTCCCAATCATGTAGTTCC22
44
中国口岸科学技术
min，瞬离，再加人下列试剂：5x RTBuffer5(xl,、10 mmol/L dNTPs 2 |x[,、200 U/(j l L 反转录酶 1L、40 U/j j l L R N A酶抑制剂 1 (x L 42 °C 水浴 60 min, 70°C水浴10 m i n后冷却至室温，合成c D N A
1.2.4 单一RT- P C R扩增
在P C R管中加入步骤12.3合成的c D N A1(X U
按每管力I]5 U/i j l L Taq D N A聚合酶 0.5 L、2.5 mmol/ L dNTPs 1 |x L、10 x P C R Buffer 2.5 |x L、25 mmo l/ L M g C l., 1.5 |x L、10 jimol/L 上游引物 0.5 i j l L、10 txmol/L 下游弓j物 0.5 |x L、ddH.,0 17.5 ixL，反应总 体积为25 p L；混合后的反应液置于P C R仪上，设 置反应程序94°C预变性3min，94°C变性30 s，54°C 退火45 s，72°C延伸45 s，共35个循环，最后一个 循环结束后，72°(：继续延伸1〇111!11；取？〇[?反应产 物10(1 U用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝 胶成像系统上观察并记录试验结果
1.2.5 P C R产物的克隆和测序
利用D N A快速纯化回收试剂盒回收目的片段，连接于P M D-18T连接载体，连接产物转化到大肠杆 菌D H5a感受态细胞中，挑取阳性克隆子送生工生 物工程（上海）股份有限公司进行测序，测得的序列 在N C B I上进行BLAST —致性比对
1.2.6 双重 RT-P C R
c D N A合成同1.2.3。在单一 R T-P C R的础上，通 过对M g"浓度、引物浓度、
d N T P浓度、T a q D N A聚 合酶浓度、退火温度和循环数的筛选和优化，确定反 应体系和反应条件，建立同时检测N C L V和N
e L V的 双重RT-P C R方法
1.2.7特异性测定
分别以N C L V、N e L V及两种病毒混合的水仙样品为材料进行双重RT-P C R，测定其特异性。
1.2.8灵敏度测定猥琐的意思
将N C L V、N e L V及两种病毒模板等量混合后，分别依次稀释至原液的10-1倍、10。倍、10-f倍、10-4倍、10-5倍和1〇<；倍，随后进行单一 RT—P C R和双重R T-P C R灵敏度的测定
1.2_9双重R T-P C R的应用
选取口岸截获和田间采集的水仙样品共80份，利用建立的双重R’l'-PCR方法进行检测，同时采用单 一 R T-P C R方法进行验证^
2结果与分析
果松2.1双重RT-PCR扩増
优化后的P C R反应体系为25 (jl L:cD N A1 (jl U 5 U/|jl L Taq DNA聚合酶 0_5 |x L、2_5 m m ol/L dNTPs 0.125 |x L,10 x P C R B uffer2.5 j j l L,25 m m ol/ L MgCl。1.5 |x L、10叫m o l/L上下游弓丨物（共2对弓丨物，分别为N CLV-F/R、N eLV-F/R)各 0.5 ixL、(1(1142〇 17.375|〇^；反应条件为94°(：预变性31^11,
然后94°C变性30 s,54°C退火45 s,72°C延伸45 s,
共30个循环，最后一个循环结束后，72°C继续延伸 10 m i n双重R T-P C R扩增结果显示，该方法能够从 阳性对照及两种病毒混合的样品中同时检出N C L V和 NeLV(见图 1 )。
M1 2 3 4
bp
1000
500
300
100
M: DNA 分子H：标准（100 bp >; 1：阳性对照；2: NCLV、NeLV混合的样品；3：阴性对照；4：空白对照
图1双重RT-PCR扩增
Fig. 1Amplification result of duplex RT-PCR
2.2特异性测定结果
利用优化的双重R T-P C R方法检测N C L V、NeL\及两种病毒混合的水仙样品，结果显单一■的N C L V、N e L V样品分别在479 b p、218 b p处出现单一明亮的D N A条带，两种病毒混合的样品同时在
45
CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY
479 b p、218 b p处出现明亮的D N A条带，而从阴性 对照上未扩增到任何特异性D N A条带。序列测定结 果显示，获得的N C L V、NeLV目的片段序列分别与 G e nBank已报道的N C L V、N e L V的C P基因序列高度 一致，一致性均达到98%以上。上述结果表明，本 研究建立的双重R T-P C R方法具有良好的特异性（见 图2) 0N C L V，单一 R T-P C R和双重RT-P C R均能够检测到 稀释至10-4倍的模板，但单一 RT-P C R条带较亮；对于N e L V，单一 R T-P C R能检测到稀释至10-M咅的模板，而双重R T-P C R最低检测到稀释至10-M音的 模板，但稀释至1〇_2倍后条带较淡。
M 1 2 3 4 5 6 7 8
b p
1000-
soa
300-
ioa
M: DNA分子量标准（100 b p) ; 1：原液；2: 10-1稀释；3: 10-稀释；4: 10-:<；稀释；5: 10-4稀释；6: 10-5稀释；7: 1胪稀释; 8：阴性对照-
图4 NCLV单一RT-PCR灵敏度
Fig.4 Sensitivity test of singal RT-PCR of NCLV
病毒是怎么来的
图2双重RT-PCR特异性测定
Fig.2 Specificity test of duplex RT-PCR
2.3灵敏度测定结果
对优化的双重R T-P C R方法进行灵敏度测定，并 与单一 R T-P C R进行比较，结果见图3 ~图5。对于
M 1 2 3 4 5 £ 7 S
bp
1000
500
300
100
M: DNA分子量标准（lOObp) ; 1：原液；2: 10-1稀释；3: 10 ，释；4: 10'5稀释；5: 10-4稀释；6: 10'「>稀释；7: 10~« 稀释; 8：阴性对照。
图3双重RT-PCR灵敏度
Fig.3 Sensitivity test of duplex RT-PCR b p
1000-
蜘蛛目5〇a
300-
10a
起的成语M: Marker; 1：原液；2: 10 1稀释；3: 10-2稀释；4: 10-3稀释；5: 1CH稀释；6: 10-「>稀释；7: 10—’•稀释；8：阴性对照
图5 NeLV单一RT-PCR灵敏度
Fig.5 Sensitivity test of singal RT-PCR of NeLV
2.4双重RT-PCR的实际应用
应用建立的双重R T-P C R方法对80份水仙实际 样品进行N C L V、N e L V两种病毒的检测，同时以单
一R T-P C R方法进行验证。结果检出N C L V阳性的样 品11份、N e L V阳性的样品32份，该检测结果与单
一 R T-P C R方法检测结果完全相符，说明本研究建立 的双重R T-P C R方法有效可靠。
46
中国口岸科学技术
3结论
目前，水仙上已报道的香石竹潜隐病毒属病毒仅 有N C L V、N e L V两种病毒，关于两种病毒的检测方 法研究报道甚少。采用传统的植物病毒检测方法，如鉴别寄主测定、电镜观察和E L1S A检测方法检测 N C L V、N e L V，存在检测周期长、灵敏度低和需要专 门的隔离设施或昂贵的设备等不足™。由于水仙病毒 种类多，且同一植株常常携带多种病毒，单凭感病症 状不易区分，因此，加强病毒检测，建立同时检测水 仙多种病毒的快速、准确的检测方法，对于缩短检测 周期、提高通关效率和及时采取防控措施具有重要意 义。H e等™建立了同时检测水仙黄条病毒、水仙潜 隐病毒和水仙花叶病毒的多重R T-P C R方法，其灵敏 度与单一 R T-P C R相当。本研究针对N C L V、NeLV 两种病毒，根据病毒C P基因保守序列分别设计特异 性引物，在单一 RT-P C R方法基础上，将两对特异性引物组合，并通过反应体系和反应条件的优化，建立 了可同时检测N C L V、N e L V的双重R T-P C R方法，一次试验即可实现对N C L V、N e L V两种病毒的同时 检测，能准确鉴定N C L V、N e L V是单一还是复合侵染，显著提高了检测效率
特异性和灵敏度测定结果表明，建立的双重RT- P C R检测方法能够有效K分N C L V、N e L V两种病毒，并且检测灵敏度不低于单一 RT-P C R方法。应用建立 的双重RT-P C R方法实际检测口岸截获和田间采集的 样品，结果80份样品中检出N C L V 11份阳性、NeLV 32份阳性，并且检测结果与单一 RT-P C R验证结果一 致，进一步验证了该方法的有效性。综上所述，本研究 建立的双重RT-P C R方
法特异性强、灵敏度高、准确性 好，在口岸检疫和农业生产上具有广泛的应用前景
【该文经C N K I学术不端文献检测系统检测，总 文字复制比为9.2%。】
参考文献
[1】臧颖.严纯，戴凯新，等.水仙病毒病研究进展[J].北方园艺，2019, (05): 153-160.
[2] Anbari S, Tohidfar M, Hosini R, et al. Somatic embryogenesis induction in Narcissus papyraceus cv. Shirazi[J]. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 2007, 17(1)： 37-46.
[3】JIN J, SHEN J G, CA1 W, et al.Narcissus yellow stripe vims and Narcissus mosaic virus Detection in Narcissus via multiplex TaqMan-bad rever transcription-PCR assay[J】. Journal of Applied Microbiology, 2017, 122(5): 1299-1309.
[4] CHEN J, SHI Y H, LU Y W, et al. Narcissus symptomless virus： a new carlavirus of daffcxiils[J]. Archives of Virology, 2006,151(11)： 2261-2267.
[5] ZHENG H Y, CHEN J, Adams M J, et al. Complete nucleotide quence and affinities of the genomic RNA of Narcissus common latent virus (genus Carlavirus)[J]. Archives of Virology, 2006, 151(8)：1667-1672.
[6] KUMAR R, JEEVALATHA A, BASWARAJ R, et al. A multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of five virus in potato[J]. Journal of Plant Pathology, 2017, 99(1)： 37-45.
[7] 杜真真，刘艳，王锡锋.双重R T-PC R法同步检测单头舁沙叶蜱携带的两种小麦病毒[J].植物保护，2020, 46(03): 175-179, 187.
[8] VINAYARANI G, MADHUSUDHAN K N, DEEPAK S A, et al. Detection of mixed infection of tobamovirus in tomato and bell pepper by using RT-PCT and duplex PCR[J]. International Journal of Plant Pathology, 2011, 2(2)： 89-95.
[9] 陶源，吴兴泉.植物病毒检测方法的研究进展[J].分子植物f f种，2017, 015(007): 2901-2906.
[10] HE Y P, GAO F L, SHEN J G, et al. A multiplex RT-PCR method for the simultaneous detection of Narcissus yellow stripe virus, Narcissus latent virus and Narcissus mosaic virus[J]. Canadian Journal of Plant Pathology, 2019, 41(1)：115-123.
(文章类别：CPST-C)
47
