CRISPR-Cas9全程实操教程：从gRNA设计到挑单克隆全程指导轻松科研 | 趣读⽂献 | 前沿资讯 | 实⽤技巧
特别鸣谢
感谢群友“逍遥”的分享！出米率
基本原理
CRISPR-Cas9是⼀种细菌获得性免疫，⽤于降解⼊侵的外源DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与
转录激活crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退⽕形成的复合物能特异性识别与其互补
的基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成DNA双链断裂，如下图所⽰。
通过基因⼯程⼿段对crRNA和tracrRNA进⾏改造，将其连接在⼀起得到sgRNA (single guide臣诚恐见欺于王而负赵翻译
RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，白羊座男生喜欢一个人的表现
将其转染细胞，便能够对⽬的基因进⾏基因操作，在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进⾏切割，如下书本拼音
图所⽰。
因此本实验的关键步骤是设计⼀对20bp（不包括NGG在内的）完全互补的oligo插⼊到如上图所
⽰的filler。另U6启动⼦需要5’端的G起始转录，因此若设计的oligo第⼀个碱基⾮G，需额外增加
⼀个G。
操作详细流程
1. 设计sgRNA
黄子韬生日关于sgRNA的设计我们有专门开过⼀篇⽂章《⼀⽂掌握gRNA的设计，常⽤⽅法汇总解析》[点
击此处阅读]
确定靶基因的序列，可通过在线⽹站设计(-engineering )，或根据靶基因
双子男处女女
的CDS序列⾃⾏设计，最⽅便的是在human KO Library sgRNA⾥选择。⽆论选择哪种⽅式，都
建议进⾏⼀下blast。
附上在线设计⽹页截图。输⼊基因的name，填写email address，设计结果稍后会发送到此邮
箱，选择序列的类型以及物种。如quence type选择unique region，⼀次只能输⼊23~500bp
的基因⽚段，最好⼀次只输⼊⼀个外显⼦，避免guide序列跨越内含⼦，都选择键⼊后点击提
交，关注邮箱或者在线等。
元日战争分析中，显⽰你所键⼊的基因序列⾥有36对可选的guide序列。
分析结束，点击Download as genbank查看结果，此时也会收到邮件。
选择分数较⾼的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下：oligo1：5’-
caccG CGTTCAAGTACCAGTTCGTG -3’; oligo2：5’- aaac
CACGAACTGGTACTTGAACGc。标红部分与经BsmBI酶切后的载体互补配对。BsmBI⼜名
BbsI。
※oligoDNA序列的第⼀个碱基必须是G，如选取的Guide序列的第⼀个碱基不是G，需⾃⾏添加
⼀个额外的G。
2. Oligo退⽕形成duplex
PCR仪 95℃ 5 min，缓慢降温⾄室温1h，1：200稀释duplex。
3. 质粒酶切
4. 胶回收
⼤⽚段约11kb 回收；⼩⽚段约2kb为切下来的filler，不要。
5. 连接
室温连接4-6 h。
6. 转化（Amp ），挑克隆，摇菌，抽提质粒，测序！
>英汉汉英词典
