网络出版时间：2420-10-95：53网络出版地址：https：//kos.—kO oet/kcms/dwOO34.1465.R.2424W08.0843.416.htmi
幼羊颅骨缺损修复中LncRNA的差异性表达及作用孤独是常态
刘岩、，，，邵国12，*，张春阳、，，
摘要目的探讨长链非编码RNA(LocRNA)基因在幼羊颅骨缺损修复的差异性表达及改善颅骨缺损的作用。方法 将W只1月龄的小尾寒羊分成2组：原生骨组织组、新生骨组织组，每组6只。通过高通量测序检测两组骨组织内LocRNA的表达变化，通过Reol-Cme PCR验证测序LocRNA 表达量的变化。ELISA法检测血清中碱性磷酸酶(ALP)和钙调蛋白(OCN)；Western blel检测WoP-wPeoO的蛋白表达水平。结果与原生骨组织组相比，新生骨组织中LocRNA ODSM、LocRNA UCA1表达上调，LocRNA H16.LocRNA MEG3的表达下调；新生骨组织组幼羊血清中ALP、OCN的含量升高；新生骨内的W o PB蛋白的表达升高。结论LocRNA ODSM、UCA1可能调控Wot/-信号通路参与缺损部位颅骨组织的修复。
关键词长链非编码RNA；颅骨缺损^ot/d-cPeoO；碱性磷酸酶
2220-29-29接收
基金项目国家自然科学基金(编号：8W620W、8W62038)
作者单位：内蒙古科技大学包头医学院1第一附属医院神经外科、8神经外科疾病研究所(转化医学)，包头014042
彳内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心，包
头014242
作者简介：刘岩，男，硕士研究生；
张春阳，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E
mail：2山8；€：/110『8111_
*对本文具有同等贡献中图分类号R051
文献标志码A文章编号1004-1492(2421)41-0082-45 hoi：14t19445/L cnkit iss/1004-1492.2401.41.410
颅骨缺损修补是神经外科的一个难题，多种因素可以影响缺损区颅骨的生长。长链非编码RNA (Ony popcodOp RNA,LocRNA)能与DNA、RNA、蛋白质结合形成由LocRNA参与的复杂的基因表达调控网，
进而参与骨损伤后的修复［］。Bu el aX9］发现LocRNA th通过下调miR-30a-5y，促进颗粒诱导的成骨细胞凋亡。碱性磷酸酶(aOaOne p—sphata, ALP)是一种由骨细胞分泌的磷酸酯酶，在骨组织广泛存在。骨钙素(osteocaOO,OCN)可间接反映成骨细胞的活跃水平。ALP、OCN的含量反应机体骨组织的代谢情况。在颅骨组织损伤时，骨的吸收和代谢因子发生变化，如血清ALP、OCN等S/］。然而在幼羊颅骨缺损再生中ALP、OCN的表达情况还没有被明确。
该研究通过测序探究在原生、新生骨组织中LocRNA的差异性表达与其联系的MO/RNA、Wnt/ -调控骨生长的关系，确定差异性表达的LocRNA 在幼羊颅骨缺损修复表达调控的意义，为临床上颅骨缺损的治疗提供新的理论基础。
qaup,and HEL wpWowtP q/np.Cells of CM-Dil q/np were transplanted into zeOraUsh yold sac of HEL exper-imeotal q/np Up mic/injection,and PBS expe/oeotal q/np was injected with PBS.The three p/nys of zeOraUsh were c/ltured in an idc/Pator at34C,and whether the model was wtSOs/W s/ccessful l p was iOextified t—odph in o O c and in OC o p/liferation expe/oeols and in vive euo/scwce ok/ation；the s/ccessfullp Oeutified zebrafish were expod to cytaradine dap,divided Oto52,W0,200nmol d/q/np and model cont/i q/np,the p/-liferaCon and migration of OuPemia cells in xwoyaU tumor models afer dap exposure in each q/np were od-/ed.Resulis The p/liferaCon status of HEL cells in the CM-Dil q/np and the blank q/np was similar,and the diOerexce was not statisticall
p signikcant(P>0.05).The y/liOraCon of HEL cells in zeOrafish was confivned Up tn00。and in vivo y/liferation expe/oeots;The nomber of zeOraUsh in the HEL expe/oeotal q/np was lower tPao that in the blank control q/np and PBS injection qaup(P<0.05).Compared with the model control q/np, the yaliferatiou of the three conceotratioos of cytaradine dap exposure yaup was lower(P<0.05).Conclusion Human ac/te e/tPaOxUemia HEL cells can be y/liOrated after transplantation into zeOraUsh emb/os,and the proliferative activity can be OmVwW Up cytaradine, confivniny the successful wtSds/mwt of the xwoyaft model. Key worOt zWafis—3(—0wyt—oOukwiia；x woyaft；2口1!^2e/tP/OxUemia cW O cytpSine
1材料与方法
16实验动物及试剂、仪器普通级雄性1月龄小尾寒羊3只，体质量（5.5±0.5）kg，来源于内蒙古科技大学包头医学院动物实验室［SCXK（蒙）K2912-P023］，无菌手术在内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院中心实验室［SYXK（蒙）K2005-0012］进行，动物实验由内蒙古科技大学包头医学院医学生物学研究所动物实验伦理审查委员会通
过，伦理审批IACUC号：203-033。
RITA裂解液及蛋白酶抑制剂（PMSF）购于上海碧云天生物技术有限公司（货号:P0018C,ST505）；
兔源Wot（货号：343243A9A）、pAatedin（货号：306309）、p-acUo（货号:ah8207-抗体购于美国Abeam公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号:A53025-购于美国Thermo公司;ECL化学发光显色试剂盒（货号:P1012）购于北京普利莱公司；反转录试剂盒、0DSM、UCA1、H3、MEG3和内参p-ac/n基因引物购于上海生物工程股份有限公司;Real-time PCR MasterMio荧光探针购于南京博尔迪公司；SYBR Green荧光染料（美国TaRaKa公司）；超声波破碎仪（型号:FB505220）购于上海睿安生物科技有限公司；全自动化学发光成像分析系统（型号：Tanoo 5590）购于北京中西远大科技有限公司；酶标仪（型号:MultishonFC-1实时荧光定量PCR仪（型号：ABI7600HT）、ABI7200荧光定量PCR扩增仪（型号:ABI7200HT FAST）购于美国Thermo公司。
16实验方法建立幼羊颅骨缺损模型，12只1月龄的小尾寒羊分成9组：原生骨组织组、新生骨组织组，每组5只，按照1mCkg的剂量给予幼羊注射戊巴比妥钠，待完全麻醉后，俯卧固定于手术台，去除表皮上的毛发，碘伏、乙醇消毒，在颅骨中线部位切开颅骨表面皮肤，暴露颅骨，分离骨膜，用铳刀在中线部位切一直径为3cm大小的颅骨，不要损伤硬脑膜，建立颅骨缺损模型（原生骨组只给予颅骨表面皮肤切开、，双氧水和庆大霉素反复冲洗手术区域防止感染，缝合头皮（图1）。术后每只羊给予青霉素320万U，早晚各1次肌肉注射，连续给药5~7 b后拆线。1个月后分别取缺损区新生的骨组织及其邻近的原生骨组织置于事先做好标记的冻存管中，储存在-89C的冰箱中备用。部分样品送至南京派森诺基因科技有限公司测序。
16ELISA检测血清ALP、OCN的含量使用酶联免疫吸附法在建立颅骨缺损模型前对2组幼羊进
图1幼羊颅骨缺损模型
行血清ALP、OCN含量的检测，模型组完成建立模型3个月后，再对9组幼羊进行ALP、OCN含量的检测。羊的颈静脉位于臂头肌和胸头肌构成的颈静脉沟内，对其周围进行去毛、消毒，入针点通常选择在颈部中部偏上。取血完毕后静置9h取上清液-89C冻存。进行后续检测。
1.6Western blot检测Wnt、0-catenin蛋白的差异性表达研磨每组的骨组织，加入裂解液及蛋白酶抑制剂，于冰上裂解30mio,BCA法对其进行蛋白定量，计算每孔的加样体积,8%SDS-TAGE凝胶电泳2h，将样品转移至PVDF膜上,5%的脱脂牛奶封闭2h，剪出目的条带及内参，加入一抗Wot.p-catv-nm、p-actio（1:1000、工作液于4C过夜，第9天加入HRP标记的羊抗兔二抗于室温孵育9U,ECL化学发光显示蛋白条带，使用Image J计算蛋白条带灰度值。
16荧光定量PCR验证差异性表达取出冻存的骨组织，研磨后，用TRIzot法提取总的RNA,Nanodup2000测定OD230、OD260、OD250的值计算纯度，OD262/°D280在48~2.2之间，OD220/OD230在9-0~ 9.0之间可用于实验。按照试剂盒进行反转录，采用ABI7200型荧光定量PCR仪，SYBR Green荧光染料（美国TaRaKa公司、为PCR反应原料，反应体系参考说明书。利用P/ov5软件设计定量PCR所需引物及内参序列，引物序列UCA1：（上游）51 TATGCTTGAGCCTTGA，,（下游）5,-4TTGCC
TGAA ATACTTG-3,-MEG3：（上游-5-ATAGCGCCCCCTAT TCATGCA-（下游）5，-GGGAGCAGCTATGGATCA CCA-H12：（上游）5'-CGTAGCAGTGACGAATGTG GA,（下游）5'-TCTCATTGCCGAACACCTA'-ODSM:（上游）5'-GCUCUCUCCCUGACUGUUATTA-（下游-5-UAACAGUCAGGGAGAGAGCTTA-p-actib：（上游）5'-TGGCGTGTAAAGTCACCACC-3-（下
游)5, O GAGCTCTGAGC A CTGGAGAC ，，弓 | 物由上海 生物工程科技有限公司合成，以P-actin 为内参, 2「mt 方法计算相对差异表达。
1.6统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计 学分析，实验数据用x 土p 表示，组间比较采用t 检
验，以P <0. 05为差异有统计学意义。
2结果
2.1原生骨、新生骨组织样品间LncRNA 表达水 平相关性检测 样品间L/cRNA 表达水平相关性是
检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标, 在做差异表达分析之前，应先检查样品间L/cRNA
的表达水平相关性。本研究用皮尔逊相关系数表示 样品间L/cRNA 的表达水平相关性，相关系数大于
0. 9，见图7o 提示样品间L/cRNA 的表达水平相关
性较好。
新生骨组织
原生骨组织
图2样品相关性检验
1.000.990.980.97
0.96
0.95
0.94
0.93
2.2
LncRNA 差异分析结果 采用DESep 对 L/cRNA 表达进行差异分析，筛选差异表达基因条
件为I -02 (表达量差异倍数)丨〉1且P<0.05。不 同分组之间的L/cRNA 差异表达统计结果显示，在
原生骨组织组与新生骨组织组中共计有08个基因 发生变化，其中有75个L/cRNA 被上调,76个Ln-
cRNA 被下调。
2.3 LncRNA 表达差异分析比较在所有表达差
异的 L/cRNA 中，选取 L/cRNA ODSM 、L/cRNA HO 、L/cRNA UCA)L/cRNA MEG8 等差异明显的
基因进行验证RNA 的表达量,RTOCR 检测的结果
显示，与原生骨组织组相比，新生骨组织组中La
cRNA ODSM 的表达升高且差异有统计学意义(=
5. 000 ,P < 0. 01 -、L/cRNA UCA1 表达上升且差异 具有统计学意义(=5. 205,P <0. 01 -(图3A 、3B )。
而与原生骨组织组相比，新生骨组织组中L/cRNA
H17的表达降低且差异具有统计学意义(=2.412,
P<0.01)、L/cRNA MEG8表达降低且差异具有统
计学意义(=6. 482,P <0.01)(图 3C 、3D )。Renl-
time PCR 结果与咼通量测序结果相符。
B
.08
6
06
O.02
.00
O..1O
.O8
3
3
O.O.O.O.L —.02.00
«
故略夜
天毘曲
蒯
Ivon
*
原生骨组织组新生骨组织组原生骨组织组新生骨组织组
c i i f s s
'原生骨组级组新生骨组织组 原生骨组织组新生骨组织组
图 3 Real-time PCR 检测 lncRNA 表达
A ： LncRNA 0DSM 表达；
B ： LncRNA UCA1 表达；
C : LncRNA
到开头的四字成语HO 表达;D ： LncRNA MEG5表达；与原生骨组织组比较：* P<9. 93
2.4 MicrrRNA 表达变化的分析通过之前的测 序结果显示miRNAA84b-Cp 的表达在两组实验中
有差异，根据img 2(表达量差异倍数)丨〉1且P<
0. 05进行筛选表明miRNAA84bCp 表达量有差异,
再进行RT-CCR 验证，结果显示原生骨组织中miR- NAOCObOp 的相对丰度值为(0. 095 ±0. 010)，新生
骨组织中miRNAA87b-Cp 的相对丰度值为(0.02 ±0.036)。新生骨组织内的miRNAO39bOp 的表
达水平高于原生骨组织(i=9- 399, P = 0. 000 2)。
2.4血清ALP 、OCN 表达结果分别对两组幼羊
进行血清ALP 、OCN 含量的检测，结果显示，原生骨猪肉英文
组织中ALP 的含量为(59. O ± 10. 09)、OCN 的含量
浙江象山为(79. 29 ±9. 36)，在建立颅骨缺损模型前,2组幼
羊的血清ALP 、OCN 含量差异不具有统计学意义(P
>0- 05)，而模型组建立3个月后，比较血清ALP 、 OCN 的含量：与原生骨组织组相比，新生骨组织组
血清的ALP 含量(85.73 ±10. 25)升高且差异具有
统计学意义(i = 4. 420, P < 0. 01)，新生骨组织组血
清的OCN 含量(108. 57 ± O. 90)升高且差异具有统 计学意义(i=3.965, P<0.01)o
2.4骨组织中Wnt 、p-trtenin 蛋白表达 WxWm blot 检测表明，与原生骨组织组相比，新生骨组织组
中Wa 蛋白的表达升高且差异具有统计学意义(= 4.038，卩<0.01)。与原生骨组织组相比，
新生骨组
原生骨组织组新生骨组织组
织组中p-catenin 蛋白的升高且差异有统计学意义(i=7.033, PV0.21)。见图 4o
图4 Westeri blot 检测 Wnt 和0280x 0蛋白表达
与原生骨组织组相比较：* P<0. 05
3 讨论
近年来，临床关于幼年儿童颅骨缺损是否修补
仍存在争议，在广泛缺血性脑卒中、重型颅脑损伤
(TBI )和颅内出血((FH )患者均行减压开颅术，以治
疗或避免顽固性颅内高压的严重后果。去骨瓣减压 手术能有效地缓解和降低颅内压，能及时地防止脑 疝等急重症的发生。临床研究［］表明，对于重度的
颅脑损伤的病人，及时行去骨瓣减压术能有效地促
进患者神经功能的恢复，且术后并发症也相对较少。
研究⑷表明，非编码RNA 在骨组织、软骨组织 的生长调节中扮演了很重要的角色。有研究［2］表
明LocRNA ODSM 的靶向过表达可在体内和体外调 节成骨细胞功能。同时，Liu et a/5］发现沉默Lo-
cRNA MEG3可调节Wnt/p-catenm 信号通路来治愈
胫骨损伤。在与骨疾病相关的代谢中GAS8-AS1可
打疫苗作文能通过下调致癌LocRNA UCA1抑制骨肉瘤细胞迁 移和侵袭［］。而H19通过与之竞争的miRNA 调控
STAT9，在ADSC-软骨分化过程中发挥其调节作
用叫 MNuRNAA89Ay 通过靶向ELK1并与Ln- cRNA ODSM 相互作用来调节成骨细胞的分化和凋
亡［1 ］，同时 MicuRNAA9bAy 通过与 LocRNA H10 相互作用促进BMSC-的细胞增殖和成骨分化J 0 ］。
本研究表明在幼羊颅骨缺损区域新生的骨组织中检
测到05个基因的上调及76个基因的下调，通过对
骨组织进行PCR 的验证显示，与原生的骨组织相 比，新生骨内LocRNA 0DSM 、UCA1表达上调，H3、
MEG3的表达下调，表明在新生的骨组织中LocRNA
的变化参与了新生骨的调节。
Wot 蛋白会通过旁分泌与自分泌的方式与细胞
膜上的卷曲蛋白受体(FZD )和低密度脂蛋白受体
(LRP-)相结合并激活下游散乱蛋白(Dsh )解除下游
糖原合成酶激酶-30、轴抑制蛋白1，抑制p-catenin
降解使其在胞质中不断积累，浓度的升高加速
p-catenin 入核，激活相关靶基因，并发挥相应的生
物学效应⑴〕。该通路主要在细胞的增殖、分化、迁
移以及凋亡中发挥作用。骨特异性碱性磷酸酶
(bone specific alkaline phosphata, BALP )、OCN 作
为骨形成的标志物在骨的生长过程中扮演了很重要
的角色,BALP 是成骨细胞的一种细胞外酶，其主要
作用是在成骨过程中水解磷酸酶，为羟基磷灰石的
沉积提供磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形 成的抑制作用，有利于成骨「⑷。临床研究表明,
ALP 的水平与成骨细胞呈线性关系，且对于ALP 的
检测已经成为临床上检测成骨细胞活跃的标志。有
研究［17］显示在成骨细胞MC3T3-C1中，PS-GOS 通
过调节Wnt/p-catenin 信号通路上调了 BMPA 和 Ru/xP 的mRNA 和蛋白表达水平，并伴有ALP 和 OCN 活性的增加。与先前的研究一致，该研究显示
建立颅骨缺损模型3个月后，与原生骨组织相比，新
生骨组织Wo/p-catenin 蛋白的表达升高，ALP 及 OCN 的表达也升高，数据表明Wnt/p 信号通路蛋白
表达的增加能促进ALP 、OCN 的上调而修复缺损部
位骨组织的生长。
测序及PCR 实验表明，与原生骨组织组相比, 幼羊颅骨缺损部位LocRNA 表达量存在差异，上调
的及下调的LocRNA 可能通过调控骨生长代谢过程
女生的排卵期是什么时间段中经典的Wnt/p 信号通路而起作用,4种LocRNA
可作为调节骨代谢、骨生长的新靶点，其具体的调控
通路及所涉及的机制仍有待研究。该研究以幼年小
尾寒羊为研究对象，此大动物模型接近幼年儿童颅 骨损伤修复过程，其中涉及的基因与幼年儿童颅骨
损伤修复过程中的基因更接近。该研究可为指导临
床幼儿颅骨损伤的外科修补治疗提供实验依据。
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Differextiai expression and roie of LncRNA i the repaie
of young sheee's skull defect
Lio丫001，，,Snao Gpo1^6^6,Zhany Ckudysy、，，
(1Depi of,TU c Firsi Hospital of Baotou Medical Collegc,
2Instituto of Neurosurgicai。0€(!怒of Baotoo Medical Collegc,Translationai
//^厂Moogolia U ti O eu P u of Sdenca ang Tecanolofy,Baotoo010444;5Engineering Tecanolofy Centcegoe B ouc TO suc Regeneratiou ang Injura RepaO'Sa Onrhe Mongolia Autonomoui Repioo,Baotoo010440)
Abstroct Objective To idvestigate the differential expression of Ony dodcodiny RNA(LncRNA)pene in the/-qexeration of s/ull defects in yonny sheep and its eWects in imp/viny s/ull defects.M ethons Twel
海洋用英语怎么说ve 1-month-old small-taiOd Hao sheep were diviPed into the prima/bone Oss/e y/np and the s/ul l defect y/np,with6in each yanp.High-tP/uphyut xueocing was ud to detect the expression chanyes of LncRNA O the too q/ups of bone tissues,and Real-time PCR was ud to ve/fp the chanyes in the expression of swuwcOp LncRNA.The swam al-kalipq pUos/Uata(ALP)and osteocalcin(OCN)were detected Up ELISA.The p/tein expression levels of Wot and—-catenin were detected Up W estea UOk Resulis The expressions of LncRNA ODSM and LncRNA UCA1 were up-reyulated,while the expressions of LncRNA H10and LncRNA M EG3were down-reyulated in the new bone tissue;the conOol of ALP and OCN in swam of the new bone q/up iocaosW;the expression of WnO/y/-Oin in bone ioc/sW compared with the o/ginal bone kss/e q/up.Conclusion LncRNA ODSM and UCA1map reyulale WnO-signaliny ppUway and pptOipPe in the/ywoPOn of s/ull tissue al the defect site.
Key WOrOs LncRNA；s/ull defect;WnO/-catenin；alkaline phosphata
