肠外营养相关胆汁淤积小鼠ABC蛋白基因表达变化
李菁1，龚一鸣2，吴江3，邬文杰2，蔡威2,3,
1．上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心新生儿科；2．上海交通大学医学院附属新华医院小儿外科；3.上海交通大学医学院附属新华医院临床营养中心
Authorship: Li Jing1; Gong Yi-ming2;Wu Jiang3; Wu Wen-jie2; Cai Wei2,3,*
Institution: 1 Neonatal intensive care unit, Shanghai Children’s Medical Center, affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. 2 Department of pediatric surgery, Shanghai Xin Hua Hospital, affiliated to Shanghai Jiao Tong University School Medicine. 3 Clinical nutrition Center, Shanghai Xin Hua Hospital, affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
* Correspondence to: Cai Wei, Ph.D. No. 1678 Dongfang Road, 200127.
Telephone:86-021-********Fax:86-021-********E-mail:************** Supportive foundations: 1. The National Natural Science Foundation of China, No. 30772270. 2. Shanghai Municipal Health Bureau Rearch Fund for Natural Science, No. 2009072.
目的：观察肠外营养相关胆汁淤积（PNAC）模型小鼠肝组织ABC转运蛋白基因表达变化，探讨本组基因在PNAC发病机制中的作用。方法：雄性6-8周龄C57BL/6J小鼠，经麻醉后行颈静脉插管，使用自制旋转输液装置，微泵持续输注生理盐水，术后24小时存活的小鼠被随机分为两组：PN组和生理盐水组（对照组）。实验小鼠7天后被过量麻醉处死，取血样和肝组织分别进行血清肝功能指标分析、肝组织病理检查和肝组织ABC转运蛋白家族基因（bp、mdr1a/1b、mdr2和mrp2）mRNA表达检测。结果：PN组小鼠血清转氨酶（ALT、AST）、直接胆红素（Dbil）和胆汁酸（BA）水平明显高于对照组（P<0.05），病理学检查也显示PN组小鼠出现肝细胞变性坏死、胆汁淤积，且两组之间病理评分差异有统计学意义，提示本组PN小鼠存在PNAC和PNALD病变。同时，PN小鼠肝组织ABC转运蛋白家族基因表达下降，而小鼠肝组织ABC转运蛋白家族基因表达水平与其病理评分有相关性。结论：小鼠肝组织ABC转运蛋白家族基因表达水平与PNAC病变程度呈负相关，在PN小鼠本组基因表达下降，这有助于进一步研究PNAC的分子发病机制。
ABC gene expression of parenteral nutrition associated
cholestasis in mice
五香毛蛋Abstract：Objectives：To investigate canalicular adenosine triphosphate-binding castte (ABC) transporter gene expression of parenteral nutrition associated cholestasis in mice model.Methods：
C57BL/6J male mice (6 - 8 weeks) were anesthetized, and intubated a jugular vein catheter. 24hr post-operation of central vein cannulation and intravenous infusion with normal saline, vigorous mice were divided randomly into two groups, parenteral nutrition (PN) group and normal saline (control)group. 7 days after continuous infusion with PN solution or normal saline, mice were sacrificed. The blood samples and liver tissues were collected; liver histopathology, rological indicators, and hepatic ABC transporter family gene (bp, mdr1a/1b, mdr2 and mrp2) mRNA expression level were evaluated. Results：The rum transamina(ALT, AST), direct bilirubin(Dbil), and bile acid(BA) concentration of PN group were significantly higher than control group(P<0.05). The histopathological examination showed hepatic steatosis, necrosis, and cholestasis in PN group, and normal histopathologic morphology in control group. Pathologic scoring between the two groups was statistically significant difference, suggesting PNAC and PNALD lesions in PN group mice. Meanwhile, the ABC transporter family gene expression correlated with hepatic pathological injury verity was down-regulated
in PN group mou.Conclusions：ABC transporter family gene expression was negatively correlated with the histopathology verity of PNAC in mice. In PN group, ABC transporter expression was down-regulated, which helps to understand the pathogenesis of PNAC.
肠外营养（parenteral nutrition,PN）可以明显改善肠功能衰竭患者的营养状况和预后，但问世后不久就有肠外营养相关肝损害（parenteral nutrition- associated liver dia, PNALD）报道，与成人不同，婴幼儿PNALD主要表现为胆汁淤积（parenteral nutrition-associated cholestasis, PNAC），这与多种因素相关，如低出生体重、PN应用时间及败血症的发生次数等，但其发生机制仍不清楚。而文献报道，胆汁淤积与位于肝细胞小管膜侧的转运蛋白——ATP结合盒（ATP binding castte, ABC）的突变密切相关[1]。本实验旨在观察PNAC模型小鼠肝组织ABC蛋白家族基因表达变化。
材料和方法
1．实验小鼠：雄性、6-8周龄的C57BL/6J小鼠，体重20～25g。
2．手术过程：小鼠经水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧固定于小型手术台上。消毒 铺巾后，在小鼠右颈作0.5cm切口，分离出右颈静脉，在静脉分支汇入后的近心端作V型切口，将肝素化的1.9F PICC管（美国B-D公司）插入约0.8cm，进入上腔静脉后固定，关闭切口。在PICC管外套上自制塑料装置，经皮缝合固定于小鼠背侧。
3．分组：颈静脉置管成功后经24小时存活的小鼠被随机分为两组：①PN组（完成13只）禁食，经颈静脉置管输入静脉营养液；②对照组（完成10只）经颈静脉置管输入0.9%生理盐水，并自由进食进水。小鼠均为单笼饲养，环境温度25～28℃ ，通过电子微泵24h持续输注静脉营养液或生理盐水， 7
d后秤重，过量麻醉致死，自小鼠左颈静脉取血，采集肝组织部分切块固定于10%福尔马林以备病理切片检查，其余置-80℃冻存备检基因表达水平。 4．营养液配制：营养液采用“全合一”(all in one)方式，在无菌条件下配制，持续输注，24h更换新鲜配制的营养液，配方组成成分见表1，脂肪占总热卡的30.72%，热氮比为285.71。表1 营养液配方
成分 容量（ml） 热卡（kcal） 热卡百分比（%） 50%葡萄糖 4 8 61.44
8.5%氨基酸溶液 3 1.02 7.83
20%中长链脂肪酸 2 4 30.72
10%氯化钠 0.3
10%氯化钾 0.1
10%葡萄糖酸钙 0.05
水溶性维生素 0.05
脂溶性维生素 0.05
合计 9.55 13.02
5．检测项目：
① 肝病理检查：小鼠肝组织在光镜下观察有无脂肪变性、胆汁淤积和纤维化等病理表现，采用盲法请同一位病理科医生按照下列等级对所有病理切片作出评分[2,3]，每张切片取五个观察点：0分——正常结构形态；1分——肝小叶结构保存，少量炎性细胞浸润，肝细胞轻度变性；2分——肝小叶结构破坏，肝细胞变性明显；3分——细胞内淤胆或胆栓形成，伴肝脏纤维组织增生。
红色腊梅
② 血清肝功能指标：用全自动血清生化分析仪7150 system测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）、胆汁酸（BA）水平。
③ ABC转运蛋白家族基因mRNA表达：采用半定量逆转录酶多聚酶链式反应
（Rever transcripta polymera chain reaction, RT-PCR）技术检测肝组织ABC转运蛋白家族基因（bp、mdr1a/1b、mdr2和mrp2）mRNA表达水平。根据GeneBank中相应的基因序列，通过Primer Premier 5.0软件设计相应基因的特异性引物，见表2。
表2 相应基因的特异性引物设计
基因名 双向引物序列 长度 (bp)
β-actin Forward: 5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'一幅图画
Rever: 5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’
211
bp Forward: 5’GCTGCCAAGGATGCTAATGC3’
Rever: 5’TTTGCTTCTGCCCACCACTC3’
106
mdr1a/1b Forward: 5'-TTCTTTCAGGGCTTCACATTTG-3’ Rever: 5’-TCCCGAGGTTTGCTACATTCT-3’
223
mdr2 Forward: 5'-CACTTCTGCTGTTATCGGTTGTT-3’ Rever: 5’-ATGAATGCTTGGGAGATGCTA-3’
274
mrp2 Forward: 5'-TGTAACATCAAGAGCACCGAGA-3’ Rever: 5’-GCAGTCCAATGGAGGCAATA-3’
148
三、统计方法采用SPSS for windows 11.5统计软件。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验或秩和检验。当P＜0.05时，认为差异显著性有统计学意义。相关性分析采用Pearson线性相关分析。
结果
一、一般情况：
接受右颈静脉置管术的C57BL/6J小鼠共计52只，成功置管46只，置管术成功率为88.5%。最终完成7天输液的情况， PN组存活率41.9%（13/31），对照组小鼠存活率66.7%（10/15）。小鼠体重变化：对照组小鼠体重增加，而PN组小鼠跌磅，两组小鼠终点体重有显著差异（P<0.05）。详见表3。
表3 两组小鼠体重变化比较
n 体重 (g)
一个愿打一个愿挨
术前 终点*
PN组 13 23.1 ± 1.3
(21-26)
20.4 ± 1.5
(18-23)
对照组 10 24.3 ± 1.8
(22-28)
25.3 ± 1.8
(23-29)
t -1.773 -6.591
P0.091 0.000
学期评语
* P < 0.05，组间差异有显著性
二、肝病理检查：
对照组肝组织病理形态正常，偶有炎性细胞浸润，无细胞变性坏死，没有胆汁淤积；PN 组小鼠存在明显脂肪变性和局部坏死，2例有胆栓形成。PN组病理评分均值显著高于对照组（Z= -3.698，P=0.000<0.05）。
表4 两组病理学评分比较
组别 例数 0分 1分 2分 3分
PN组 13 1 2 4 6
对照组 10 8 2 0 0
三、血清肝功能指标：PN组小鼠血清ALT、AST、DBil与BA水平显著高于对照组（P<0.05）（表5）。表5 两组肝功能指标比较
指标 PN 组 对照组 t P
ALT* (U/L) n = 11
72.1 ± 70.2
(25.0 -
119.2)
n = 10梅花图片大全
澳大利亚人英语
20.4 ± 5.5
(16.5 -
24.4)
2.318 0.035
AST* n = 10 75.3 ± 12.2n = 10 47.5 ± 8.9 5.841 0.000
(U/L) (66.6 -
84.0) (41.2 - 53.8)
Tbil (µmol/L) n = 11
9.7 ± 4.3
(6.8 - 12.6)
n = 10
8.6 ± 3.0
(6.4 - 10.7)
0.726 0.477
Dbil* (µmol/L) n = 10
2.6 ± 1.9
(1.2 - 3.9)
n = 10
0.5 ± 0.5
(0.1 - 0.8)
3.430 0.003
BA*
(µmol/L) n = 10
26.3 ± 3.3
(24.0 -
28.7)
n = 10
7.1 ± 2.9
(5.1 - 9.2)
13.805 0.000
ALT = 丙氨酸转氨酶；AST = 天门冬氨酸转氨酶；ALB = 白蛋白；Tbil = 总胆红素；Dbil = 直接胆红素；BA = 胆汁酸 * P < 0.05，组间差异有显著性
四、肝组织ABC转运蛋白家族基因（bp、mdr1a/1b、mdr2和mrp2）mRNA表达水平检测结果示PN小鼠本组基因mRNA表达均明显低于对照组（P<0.05）（表6）。
表6 肝组织ABC蛋白家族mRNA表达水平比较（与β-actin的比值）
n bp mdr1a/1b mdr2 mrp2
眉头紧蹙PN组 13 0.22 ± 0.17
(0.11-0.32)
0.42 ± 0.20
(0.30-0.54)
0.26 ± 0.19
(0.14-0.37)
0.40 ± 0.20
(0.28-0.52)
对照组 10 1.07 ± 0.59
(0.19-0.65)
2.01 ± 1.23
(1.13-2.89)
1.15 ± 0.59
(0.72-1.57)
1.12 ± 0.46
(0.79-1.46)
t -4.438 -4.038 -4.572 -4.613
P0.001 0.003 0.001 0.001
五、小鼠肝组织ABC转运蛋白家族基因表达水平与病理评分相关：实验小鼠肝组织bp、mdr1a/1b、mdr2和mrp2 mRNA表达水平均与肝病理评分呈负相关，相关系数r分别为-0.578, -0.571, -0.536和-0.526（P=0.004, 0.004, 0.008和0.010，均<0.05）。
讨 论
PNALD是由PN引起的肝损害，早期病变通常是可逆的，及早恢复肠内营养，停用TPN （Total parenteral nutrition, TPN）可减轻肝脏损伤；晚期表现为肝纤维化、肝硬化等终末期肝病，甚至死亡。成人PNALD多表现为肝细胞脂肪变性，而小儿PNALD则多表现为胆汁淤积（PNAC），尤其是新生儿，我国新生儿PNAC发病率为2.94%[4]，临床高危因素包括肝功能不成熟的早产婴儿、缺乏肠道喂养、反复感染或败血症，以及PN溶液中存在毒性物质或缺乏某些营养物质[5-7]。迄今，PNAC分子学发病机制尚不清楚，而通过有效的动物模型可以更好地观察PNAC时肝细胞损伤的分子进程。
一系列研究发现，肝细胞小管膜侧的三磷酸腺苷结合盒（ATP binding castte, ABC）转运蛋白家族
的编码基因突变是胆汁淤积的重要发病机理[1,8-10]，人类ABC蛋白家族成员包括胆盐输出泵（Bile Salt Export Pump, BSEP）、多药耐药蛋白3（Multidrug resistance Protein 3, MDR3）、多药耐药相关蛋白2（Multidrug Resistance-associated Protein2, MRP2）和多药耐药蛋白1（MDR1），以上各ABC家族成员的小鼠同源体分别是bp、mdr2、mrp2和mdr1。BSEP调节胆汁酸向胆汁中的排泌，避免胆汁酸在细胞内堆积而引起肝损害，并间接影响胆汁流[11]。James等应用DNA探针研究了小鼠各脏器中mdr基因的表达，发现小鼠肝细胞mdr2表达明显高于mdr1和mdr3，其中mdr2的功能为通过胆小管膜转运磷酸卵磷脂（phosphatidylcholine, PC），mdr1主要转运化疗药物和毒物至胆汁。ABC蛋白家族的另一个成员mrp2是位于肝细胞胆小管侧的外向转运蛋白，能够将内源性和外源性的化学物质泵入胆汁，其中最重要的就是谷胱甘肽（glutathione, GSH）。GSH除了能够防止自由基和烷化剂对肝细胞的损害外，还能通过提供重要的渗透压力来驱动不依赖胆酸的胆汁流。因此，如果GSH分泌入胆汁增多，胆汁流亦会增加，而GSH分泌受抑制，则胆汁流会相应减少。实验表明，缺乏mrp2蛋白的大鼠会出现慢性高胆红素血症以及非胆酸阴离子清除障碍[9]。Vos 等将内毒素注入大鼠造成胆汁淤积，6小时后发现mrp2 mRNA表达明显减少[10]，提示MRP2亦与胆汁淤积发生相关。
PNALD与ABC蛋白家族相关性研究的文献报道仅有两篇动物实验[12,13]，其中之一涉及小鼠PN，作者发现应用PN 7天后，小鼠肝组织mdr2基因表达显著减少，而mdr1表达明显增
加[13]，但该研究中PN小鼠尚未出现肝细胞损伤，仅血清胆汁酸水平升高，属早期PNAC病变，而本
实验PN小鼠的PNALD表现典型，PN组小鼠血清转氨酶、直接胆红素和胆汁酸均明显升高，病理学检查存在肝细胞变性坏死以及胆汁淤积。由此说明，TPN造成小鼠肝细胞胆小管膜侧ABC蛋白家族基因表达下调，可能影响胆小管膜转运功能。
此外，本实验的模型动物小鼠可接受基因改造，用于研究特定基因在PNAC发病机理中的作用，优于其他PNAC模型动物（如大鼠、兔、新生猪等），但小鼠体型小、插管难度较大以及手术耐受性差，死亡率高，国内尚无人尝试。国外文献报道，仅有三个实验室将6-8周龄小鼠用于PNALD研究[14-16]，但各自PN时间长短不一（5-19天），PN溶液中脂肪用量有很大不同（0-120mg/qod），脂肪所占总热卡比也不统一（0-14%）。本实验TPN配方主要依据临床新生儿TPN配方的脂肪热占比（25-50%），采用与文献报道[17]总热卡相同，脂肪占总热卡30%的配方进行建模，并在原有PNAC模型兔的基础上，改进操作技术，自行设计实验操作步骤和小鼠旋转输液装置，为进一步研究PNALD和PNAC分子学发病机制奠定基础。 参考文献
1. Yuko Tazuke, Daniel HT. Alteration of canalicular transporters in a mou model of total parenteral nutrition. JPGN. 2009, 48:193–20
2.
2. Wu J, Hong L, Cai W, et al. Glutamine attenuates TPN-associated liver injury in infant rabbits. Eur
J Pediatr 2007;166:601-606.
3. Loff S, Waag KL, Kranzlin B, et al. Long-term total parenteral nutrition induced hepatobiliary dysfunction in a rabbit model. J Pediatr Surg 1998;33:694–699.
4. Tang QY,Wang Y, Feng Y, and et al. Factors derived from parenteral nutrition associated with cholestasis in 612 neonates. Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2007, 45: 838-842.(Chine)
5. Sokol RJ.Total parenteral nutrition-related liver dia. Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za Zhi.1997, 38: 418-428.
6. Kelly DA. Liver complications of pediatric parenteral nutrition—epidemiology. Nutrition.1998, 14:153-15
7.
7. Btaiche IF and Khalidi N. Parenteral nutrition-associated liver complications in children.Pharmacotherapy. 2002, 22: 188-211.
8. Meier Y, Pauli-Magnus C, Zanger UM,, et al. Interindividual variability of canalicular ATP-Binding-Castte (ABC)–transporter expression in human Liver. Hepatology. 2006, 44: 62-74.
9. David RJ, Sultan SMH, Curtis DK. Increa in bile flow and biliary excretion of Glutathione-derived sulfhydryls in rats by drug-metabolizing enzyme inducers is mediated by multidrug resistance protein 2. Toxicological sci. 2002, 66: 16-26.
10. Vos TA, Hooiveld GJ, Koning H, et al. Up-regulation of the multudrug resistance genes, Mrp1 and Mdr1b, and down-regulation of the organic anion transporter, Mrp2, and the bile salt transporter , Spgp, in endotoxemic rat liver. Hepatology. 1998, 28:1637-1644.
11. Suchy FJ, Ananthanarayanan M. Bile salt excretory pump: biology and pathobiology. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;43 Suppl 1:S10-6.
12. Nishimura M, Yamaguchi M, Yamauchi A, et al. Role of soybean oil fat emulsion in the prevention of hepatic xenobiotic transporter mRNA up- and down-regulation induced by overdo of fat-free total parenteral nutrition in infant rats. Drug Metab Pharmacokinet. 2005; 20(1):46-54.
13. Tazuke Y, Kiristioglu I, Heidelberger KP, et al. Hepatic P-Glycoprotein changes with total parenteral nutrition administration. J Parenter Enteral Nutr. 2004, 28: 1-6.
14. Fukatsu K, Lundberg AH, Hanna MK, and et al. Incread expression of intestinal P-lectin and pulmonary E-lectin during intravenous total parenteral nutrition. Arch Surg. 2000, 135: 1177-1182.
15. Javid PJ, Greene AK, Garza J, et al. The route of lipid administration affects
