基于CMV启动子构建CVB3感染性克隆的初步研究
viral lifecycle.
Our Objective is to construct a CMV promoter-bad infectious clone of coxsackivirus B3．First，the plasmid pcDNA3.1(+)was ud and the downstream quence of its CMV promoter is replaced with multiple clone site quence we designed，and then we inrted two element（the core quence of HdvRz and polyA tail）into its multiple clone site，this lead to plasmid pc-H-A．We transfected pc-H-A into Hela cells to evaluate its availability；Second，Hela cells is infected with wild type CVB3（nancy），and the viral RNA is extracted from supernatant．Then，the full length CVB3 cDNA was amplified by long RT-PCR and long PCR through condition optimization．At last we inrt this full length cDNA into plasmid pc-H-A and the recombinant particles is verified by quencing．
The framework vector pc-H-A was constructed bad on CMV promoter and its availability was initially evaluated．A full length pc-CVB3-H-A cDNA clone was obtained with its quence similarity 98% compared with CVB3 quence in gene bank,but the efficiency of this system still needs futher study．This work will be of great value for the further study of RNA polymera Ⅱ driven system．
[Key words] CVB3；CMV promoter；infectious clone
缩略语表
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缩略语英文全称中文译名CVB Coxsackie virus B 科萨奇病毒B CVB3 Coxsackie virus B3 科萨奇病毒B3 EGFP Enhanced green fluorescence protein增强型绿色荧光蛋白HdvRz Hepatitis Delta Virus Ribozyme 丁型肝炎病毒核酶PolyA Poly adenyl acid多聚腺苷CMV cytomegalovirus巨细胞病毒Amp ampicillin氨苄青霉素DNA deoxynucleic acid脱氧核糖核酸LB luria-bertani medium LB培养基mRNA Mesnger RNA信使RNA PCR polymera chain reaction聚合酶链式反应OD optical density光密度值
RT-PCR Rever
transcription-PCR 逆转录PCR FBS fetal bovine rum 胎牛血清
世界杯集锦acid核糖核酸RNA ribonucleic
MCS multiple cloning site多克隆位点ORF Open reading frame开放阅读框PBS phosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液bp ba pair碱基对
rpm round per minute转/分钟DEPC Diethylpyrocarbonate焦炭酸二乙脂DMEM dulbecco's modified eagle's medium脱氧核糖核酸
h hour 小时
min minute 分钟
s cond 秒
一本书图片
基于CMV启动子构建CVB3感染性克隆的初步研究
交强险规定
前言
1 RNA病毒感染性克隆
1.1RNA病毒感染性克隆技术的兴起和发展
RNA分子的基因组在体外较DNA分子难以操作，所以相对于DNA病毒而言RNA病毒的分子生物学研究比较缓慢。虽然RNA基因组的修饰比DNA 要困难的多，但难以置信的是RNA病毒的反向遗传学操作差不多跟DNA病毒的操作同步发展起来。起初，对RNA的定点修饰是在体外RNA复制过程中完成的，步骤繁琐且突变的范围有限。尽管如此，以反向遗传学作为技术手段来研究RNA病毒的潜能在当时是显而易见的[1,2]。70年代重组DNA技术的发展推动了RNA病毒的研究，RNA病毒学家们由RNA病毒基因组得到互补的DNA 拷贝再将其插入质粒并在细菌宿主中复制以进行简单的遗传学操作。最早进行遗传学操作的是Qβ噬菌体。令人惊喜的是含有Qβ噬菌体完整cDNA的质粒是有感染性的，而且有能力完成病毒的整个复制周期[3]。随后，这项技术被应用于其它的病毒，包括脊髓灰质炎病毒和植物类病毒。脊髓灰质炎病毒的感染性克隆在很多年后仍是脊髓灰质炎病毒遗传学的主要材料。随后，另外一项技术发展起来，即用病毒cDNA模板连接上大肠杆菌或噬菌体的DNA依赖的RNA 聚合酶所识别的启动子进行体外转录。当RNA的体外转录物转入细胞时，会引起病毒RNA的复制[4]。最先用此方法研究
的是烟草花叶病毒，它是一个较小的植物病毒基因组包括三个RNA片段，大小分别是3.2，2.8和2.1kb。与DNA 转染方法相比，RNA转染所产生的RNA与天然RNA病毒序列的识别末端更匹配。这种方法使得病毒学家们能够利用反向遗传学技术来操作相对较小的RNA 基因组和复杂的RNA片段。
至此，感染性克隆是指能够得到有感染性活病毒的遗传材料。一般是含有整个病毒基因组的cDNA拷贝的质粒。质粒的cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性[5]。由感染性克隆得到活病毒的过程称为病毒的回复或拯救。在上述的方法中，病毒RNA的大小是回复时主要的限制。Qβ噬菌体RNA 是4.5kb，而脊髓灰质炎病毒RNA为7.5kb。随着时间的发展，这种方法已经能应用于越来越大的病毒RNA。现在，却大多数长达15kb的RNA病毒已经能被
前言
克隆。PNAS已经报道一个长达27kb的猪瘟感染性克隆也已经构建，这在以前看来是不可能完成的工作。因为冠状病毒是最长的RNA病毒（也有可能是自然界最长最稳定的RNA），这表明任何长度的RNA病毒都可以通过反向遗传学得到回复。孩子不听话
回顾反向遗传学发展的历史：1978年Taniguchi首次从cDNA克隆获得了RNA噬菌体Qβ建立了反向遗传学的研究基础；1981年从脊髓灰质炎病毒cDNA首次获得动物病毒的感染性克隆，从此对正链RNA 病毒的反向遗传学研究系统逐步完善起来；随后，对负链RNA病毒，包括分节(如流感病毒)和不分节(狂
犬病毒)的cDNA感染性克隆研究也获得成功；最近对双链RNA病毒的反向遗传学研究也有了突破。至此，对RNA病毒的反向遗传学研究已涵括了大部分的RNA病毒
近年来，随着各类研究方法和实验技术手段的不断更新，反向遗传学技术也在与时俱进，各种新型的回复系统不断建立，各种RNA病毒都有望通过感染性克隆得到回复。
学习党章的心得体会1.2目前常用的几种RNA病毒回复系统的比较
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RNA病毒反向遗传学首先是得到该病毒的全长cDNA，二是得到感染性转录物（体内转录和体外转录），最后产生感染性病毒颗粒并对其进行鉴定[6]。其中获得感染性转录物对于整个反向遗传学的成败至关重要，而想要获得感染性的转录物，就必须建立合适的转录回复系统，使得病毒的全长cDNA成功转录为RNA。体外转录步骤烦琐且费用昂贵，在此不再赘述，目前就几种体内转录系统进行简介。
三明治的做法家常做法1.2.1原核RNA聚合酶回复系统
原核RNA聚合酶回复系统即采用原核RNA聚合酶可以识别的启动子来进行病毒的反向遗传学操作。
目前常用的有噬菌体T7，T3，SP6启动子等。其中最常用的为T7RNA聚合酶启动子，T7RNA聚合酶定位于细胞质，负链RNA病毒大多在细胞质内复制，所以大多数回复系统使用T7 TNA聚合酶驱动的回
牟姓复系统。但是由于T7 RNA启动子需要T7 RNA聚合酶识别才能启动转录，而T7 RNA聚合酶对于哺乳动物细胞来说一种外源蛋白，所以T7TNA聚合酶的引入必须通过质粒，稳
