讨论 (42)
第四部分中药复方洁泽1号体外对HSV-2病毒囊膜g D蛋白表达的影响 (44)
实验材料 (44)
实验方法 (44)
实验结果 (46)
讨论 (50)
/E6E7细胞分泌因子的影第五部分洁泽1号体外对HSV-2感染VK
2响 (51)
实验材料 (51)
实验方法 (51)
实验结果 (54)
讨论 (62)
结语 (64)
参考文献 (64)
综述 (69)
致谢 (77)
英文缩略词表
英文缩写英文全称中文名称
Vero Afican green monkey kidney cells非洲绿猴肾上皮细胞VK2/E6E7Human immortalized vaginal epithelial cells永生化人阴道上皮细
胞
TCID50Tissue culture infective do半数组织细胞感染量HSV-2Herpes simplex virus type2单纯疱疹病毒II型CPE Cytopathic effect致细胞病变效应MTT3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H
-tetrazolium bromide
二苯基四氮唑溴盐DMEM Dulbecco's Modified EagleMedium MEM培养基的基础
上研制的培养基FBS Fetal bovine rum胎牛血清
DMSO Dimethyl sulfoxide二甲基亚砜
PBS Phosphate buffer saline磷酸缓冲盐溶液Cn-TPR Celln TeC-Prime Medium无血清角质细胞培养
基
D-Hanks Hank,s balanced salt solution(Ca2+、Mg2+
free)不含钙、镁的HBSS 平衡液
以一当十
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt乙二胺四乙酸
CBA Cytometric Beads Array流式细胞技术
IL-1Interleukin-1白细胞介素1
IL-6Interleukin-6白细胞介素6
IL-8Interleukin-8白细胞介素8
IL-10Interleukin-10白细胞介素10
TNF Tumor necrosis factor肿瘤坏死因子DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4，6-联脒-2-苯基吲哚
中药复方洁泽1号抗HSV-2部分作用机制研究
硕士学位申请者：艾雷
硕士生导师：陈琢教授
中文摘要
第一部分HSV-2感染VK
2
/E6E7细胞模型稳定性相关参数的
完善
【目的】前期课题组已构建相对稳定的体外HSV-2病毒感染VK
2
/E6E7细胞模型，但在后期实验中，发现此模型尚有不足之处，为了实验的顺利进行，故对该模型
相关参数进行进一步的完善。
【方法】由Vero细胞扩增HSV-2，利用半数致组织或细胞病变（TCID50）方法测定收获的HSV-2的毒力，平均每周测定一次，连续测定9周（HSV-2于4℃冰箱中保存）。将收获的于Vero细胞上扩增的HSV-2在Vero细胞上再次扩增，且进行病毒浓缩；观察Vero细胞的病变效应（CPE），选择合理时机收获；将收获的HSV-2
稀释5倍、10倍、20倍，与96孔板中的VK
2
/E6E7细胞共孵育24h，以MTT方法测定
串串虾
VK
2/E6E7细胞的存活率，评估HSV-2的毒力。选取状态较好的VK
2
/E6E7细胞，即细
胞呈梭形，如铺路石样且胞质丰富、细胞体积大、细胞膜、细胞核轮廓清晰，进
行培养，将HSV-2原液稀释10倍加入已接种此状态的VK
2
/E6E7细胞的96孔板中，使其共孵育48h-96h，于倒置显微镜下观察细胞病变情况，选取合适时机收获
HSV-2（第1代）；将HSV-2病毒（第1代）再次于VK
2
/E6E7细胞上复壮72h-96h，
表格怎么画斜线
待达收获标准后收获HSV-2（第2代），将其稀释5倍、10倍、20倍，并于VK
夹克衫的英语2
/E6E7细胞上用MTT方法测定其存活率，评价第2代HSV-2病毒的毒力；更换不同状态的
VK
2
/E6E7细胞，即为细胞较圆且体积较前减小、细胞膜、细胞核轮廓不清；核分裂相多样、细胞碎片增多，细胞间凋亡小体亦增多，且对数增长期较前明显缩短，多次重复上述实验，并将实验结果进行对比。
【结果】HSV-2病毒经Vero细胞扩增后，Reed-Muench方法测得其TCID50=10-7.69，从第1周到第4周，其毒力以TCID50=10-0.25/W的速度下降；第5周到第7周，TCID50=10-5.0；第7周到第9周，其毒力再次以TCID50=10-0.25/W的速度下降。将以浓缩方式获得的HSV-2稀释5倍、10倍、20倍，与VK
2
/E6E7细胞共孵育24h后，在
倒置显微镜下观察VK
2/E6E7细胞的形态，发现稀释5倍、10倍组中的VK
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/E6E7细胞
数目减少、大部分细胞均呈圆形、细胞折光性较强；以MTT方法测定VK
2
/E6E7细
胞的存活率，HSV-2稀释5倍组、10倍组、20倍组的VK
2
/E6E7细胞存活率分别为
43.5%±1.4%、45.1%±1.1%、48.2%±1.8%。于状态较好的VK
2
/E6E7细胞中复壮的HSV-2，以MTT方法测定其毒力为，稀释5倍组、10倍组、20倍组中细胞的存活率
分别为44.6%±3.9%、53.3%±3.4%、62.7%±5.1%；在状态不佳的VK
2
/E6E7细胞复
壮的HSV-2，重复多次，用MTT方法测定其毒力时发现，HSV-2与VK
2
周一英文
/E6E7细胞共
孵育24h后，VK
2
/
E6E7细胞大部分未出现CPE，其存活率为85.7%±4.1%。
【结论】HSV-2病毒在4℃冰箱保存时，其毒力会随着时间推移而下降，且毒力以速率为TCID50=10-0.25/W衰减。借鉴前期课题组乔婷婷的研究，将“模型成功建立标准设定为细胞存活率达50%左右”，在Vero细胞中采用浓缩的方法扩增的
HSV-2毒力可达到使体外HSV-2感染VK
2
/E6E7细胞模型成功的标准，且结果较稳
定。状态不佳的VK
2
/E6E7细胞不能稳定复壮HSV-2，可知病毒毒力与宿主细胞状态亦可影响HSV-2病毒的复制和包装，表明病毒毒力与宿主细胞状态均是构建
HSV-2感染VK
张友谊
2
/E6E7细胞模型的参数。
【关键词】HSV-2；CPE；TCID50；VK2/E6E7；细胞存活率
第二部分不同制剂工艺中药复方洁泽1号体外抗HSV-2药
效比较
【目的】比较临床使用的院内制剂外用洁泽洗液（鄂药制字Z20103135）与精提工艺的洁泽1号体外抗HSV-2病毒的疗效，为后期实验提供借鉴。
【方法】设计实验分组，治疗组：HSV-2与VK
2
/E6E7细胞共孵育30min后弃去上
清，再加JZN0.1孵育24h；预防组：JZNO.1与VK
2
/E6E7细胞共孵育1h后，弃去上
清，再加HSV-2孵育24h；干预组：HSV-2、JZN0.1、VK
2
/E6E7细胞三者共孵育24h，
在倒置显微镜下观察VK
2/E6E7细胞的CPE，并结合MTT方法，测定VK
2
/E6E7细胞的
存活率，综合评价两者不同工艺制剂的中药复方洁泽1号抗HSV-2病毒的药效。【结果】病毒感染组细胞的形态约50%左右呈现圆形，细胞折光性较强，且细胞数量较正常组明显减少；与病毒感染组相比，两种制剂工艺药物中的治疗组和干预组的细胞较多呈梭形，细胞数量较病毒感染组多，且干预组的梭形细胞比例较治疗组多；但两种制剂工艺药物中预防组的细胞形态及数量均与病毒感染组无明显
差异。MTT结果如下：精提工艺的洁泽1号干预组、治疗组、预防组的细胞存活率分别为：98.2%±4.6%、82.2%±2.7%、42.5%±3.6%；临床使用的院内制剂鄂药制字Z20103135干预组、治疗组、预防组的细胞存活率分别为：62.1%±2.4%、57.0%±2.1%、42.6%±2.2%。经统计学分析：两种工艺制剂的洁泽1号治疗组和干预组与各自的病毒感染组相比，均有统计学差异（P〈0.05），但两种工艺制剂的洁泽1号预防组与相应的病毒感染组相比，无统计学差异（P〉0.05）；精提工艺的洁泽1号干预组、治疗组与临床使用的院内制剂鄂药制字Z20103135干预组、治疗组相比，均有明显统计学差异（P〈0.001）。
【结论】两种制剂工艺的洁泽1号在治疗和干预方面，均有抗HSV-2病毒感染的作用，且干预作用优于治疗作用；但采用先药物与VK
2
/E6E7细胞共孵育1h，再加HSV-2共孵育此种预防方法，两种制剂工艺的洁泽1号均表现出无抗HSV-2病毒感染的作用，提示在此种处理方式下，药物无干预病毒效应；精提工艺的洁泽1号体外抗HSV-2疗效优于临床使用的院内外用制剂洁泽洗液。
【关键词】制剂工艺；干预；预防；治疗；细胞存活率
第三部分中药复方洁泽1号体外抗HSV-2作用时间的研究【目的】前期实验证实体外JZNO.1确有抗HSV-2感染的作用，揭示JZNO.1
抗HSV-2作用机制，探讨HSV-2、VK
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/E6E7细胞、JZNO.1三者孵育时间，进一步明确JZNO.1是否对HSV-2粘附及穿入宿主细胞有影响，为后续研究奠定基础。
