论文编号：硕士学位论文
线粒体标志分子COX IV和HSP60在肝癌的
表达分析及功能研究
学号2192011203
汤圆什么时候下锅培养类别全日制
学位类型学术学位单县羊汤
一级学科(专业类) 临床医学
二级学科(专业) 影像医学与核医学(介入)
研究方向肝癌线粒体相关研究
二O一四年五月
目录
缩略语表 (1)
中文摘要 (2)
英文摘要 (5)
前言 (9)
文献回顾 (10)
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第一部分COX IV在肝癌表达的研究及与预后的相关性分析 (18)
1材料 (18)
中国伟大人物2方法 (20)
小布头奇遇记读后感3.结果 (24)
4.讨论 (30)
第二部分HSP60在肝癌中的表达分析及功能研究 (32)
1材料 (32)
2方法 (33)
3结果 (47)
4讨论 (55)
小结 (57)
参考文献 (58)
缩略语表
缩略词英文全称中文全称
COX IV Cytochrome c oxida subunit IV 细胞色素c氧化酶亚单位IV COX Cytochrome c oxida 细胞色素c氧化酶
HSP HSP60 Heat Shock Protein
小满是什么意思Heat Shock Protein 60
热休克蛋白
热休克蛋白60
ATP adenosine triphosphate 三磷酸腺苷
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液PCR Polymera Chain Reaction 聚合酶链反应siRNA Small interfering RNA 小干扰RNA HSTF Heat transcription factor 热休克转录因子AFP α-fetal protein 甲胎蛋白
HSE heat shock element 热休克元素
IHC Immunohistochemistry免疫组织化学技术EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸HCC Hepatocellular carcinoma 肝细胞癌
线粒体标志分子COX IV和HSP60在肝癌的
表达分析及功能研究
中文摘要
关键词：COX IV，HSP60，肝癌，表达，预后，功能
网络培训中心肝癌是居全球第三位、居我国第二位的癌症死因，已成为我国公共卫生难题，严重危害我国国民身体健康。尽管肝癌的临床诊疗研究已经取得了很大进步，但是目前的肝癌分期系统仍然不能精确预测肝癌预后，因此筛选鉴定新的肝癌相关分子标志物，系统阐明其在肝癌发生发展中的作用机制，对于深入理解肝癌分子生物学特性、指导临床预后判断和治疗决策以及开发新的防治策略具有重要意义。线粒体是真核细胞中唯一具有独立基因组的细胞器，在能量代谢、细胞凋亡、ROS产生以及钙稳态调控等生命活动中发挥着极其关键的作用。近年来，线粒体与肿瘤发生发展的关系日益受到重视，线粒体异常改变可影响肿瘤细胞多方面的生物学特性。细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxida，COX）是线粒体氧化呼吸链电子传递的最后环节，由13个亚单位构成，其中亚单位IV（COX IV）是COX组装的关键分子，定位在线粒体内膜上，可作为线粒体的分子标志物。以往的研究表明，COX亚单位表达异常可显著影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药能力，但是COX IV在肝癌表达及其临床意义尚未见报道。热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）是由核基因组编码的线粒体分子伴侣蛋白，对于线粒体内蛋白的转运、折叠具有重要作用，是线粒体的另一个重要标志物。大量研究表明多种肿瘤中HSP60的表达水平发生了异常改变，而且HSP60表达水平与肿瘤的临床特点和预后密切相关，但是其在肝癌中的表达及临床意义尚无研究，其对肝癌细胞生物学特性的影响亦无报道。
【目的】
本课题以肝癌为研究对象，选择两个线粒体标志分子COX IV和HSP60，分别检测了它们在肝癌中的表达水平，分析其临床意义，并初步探索HSP60对肝癌细胞生物学特性的影响。
耗材清单【方法】
1. COX IV在肝癌的表达检测：利用real-time PCR检测COX IV mRNA在24例肝癌及对应癌旁组织中的表达，利用免疫组化进一步在323例肝癌及对应癌旁组织验证COX IV蛋白表达，并分析COX IV表达水平与肝癌临床病理学参数和预后的相关性。
2. HSP60在肝癌的表达检测：利用real-time PCR和Western blot分别检测HSP60 mRNA和蛋白在24例肝癌及对应癌旁组织中的表达，利用免疫组化进一步在331例肝癌及对应癌旁组织验证HSP60蛋白表达，并分析HSP60表达水平与肝癌临床病理学参数和预后的相关性。利用real-time PCR、Western blot和免疫荧光染色检测HSP60在肝癌细胞系中的表达。
3. 构建pcDNA3.1-HSP60表达载体，设计并合成HSP60特异性干扰片段，利用阳离子脂质体法转染肝癌细胞系，分别检测过表达和干扰HSP60后，肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的变化。
【结果】
1. COX IV在肝癌中的表达及其临床意义：（1）real-time PCR结果显示COX IV 在肝癌组织中的mRN
A表达水平显著低于癌旁组织（P <0.05），免疫组化分析进一步证实COX IV蛋白在肝癌细胞中的表达水平显著下降（P <0.001）。（2）COX IV表达与患者血清HBsAg（P = 0.045）、AFP（P =0.012）和肿瘤分化程度（P =0.030）等临床病理学参数显著相关。（3）COX IV表达水平与肝癌患者无复发生存显著相关，高表达患者的无复发生存显著优于低表达患者（P =0.024）。（4）COX IV低表达患者发生门静脉癌栓的风险大大增加（OR =
2.323；95% CI（1.044-5.169）；P =0.039）。
2. HSP60在肝癌中的表达及其临床意义：（1）real-time PCR结果显示HSP60在肝癌组织中的mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P =0.006），免疫组化分析进一步证实HSP60蛋白在肝癌细胞中的表达水平显著下降（P =0.0003），Western blot检测也表明HSP60蛋白在肝癌细胞中表达下降。（2）免疫荧光染色显示HSP60主要表达于
