上海医学2021年第44卷第4期
・124•
•论论•麻醉学•衣康酸衍生物通过调控肺上皮细胞趋化因子
减轻急性肺损伤的研究
章晓辰李盈科
【摘要】目的观察向小鼠气管内滴注衣康酸衍生物对脂多糖(lipopolysaccVrCe^LPS)诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用及其对肺泡内炎症细胞浸润程度的影响。方法野生型C57ELW小鼠26只。采用数字表法将其中8%小鼠随机分为PBSM、LPSM，每组4只，予腹腔内注射LPS建立脓毒症模型非4hR采用H-E染色观察肺组织的炎症细胞浸润程度。采用数字表法将另18%小鼠随机分为PBSM、二甲基衣康酸3MI)M、四辛基衣康酸31)组，每组6只，分别予气管内滴注PBS、DMI、OI；给药6hR，予腹腔内注射LPS建立脓毒症模型非4h后使用流式细胞仪测定肺泡支气管灌洗液中炎症细胞比例，肉眼和H-E染色后显微镜下观察肺组织炎症细胞浸润程度。将MLE-IO细胞随机分为LPSO、组、34组、6为组，每组4孑L，分别给予LPSM激0%%hR收集mRNA另取MLR-10细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组、低浓度(62.6受CKDM1组、高浓度％25受CKDM1组、低浓度受CKOI组、高浓度年25受CKOI组，每组4孑孔取A49细胞
随机分为二甲基亚砜3MSO)组、低浓度受CKDM1组、高浓度％25受CKDM1组，每组4孔。分别用相应药物预处理后加入LPS刺激9h，收集mRNA采用实时荧光定量PCR法测定肺上皮细胞［犜肺手犔和CXCL131或；肺小1<0\相对表达量。结果与PBSM相比，在LPSM小鼠肺组织中，炎症细胞浸润明显。FPS3R 9h AMLE-IO细胞犜犉肺各-6和CXCL13mRNA相对表达量较0、组显著升高3值分别001,2.05)/衣康酸衍生物经气管内给药可以减轻脓毒症模型小鼠的肺泡内出血，DM)和OI组小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞百分比分别为(41.467+6.850)，和年本767+5.临年％，均显著低于PBSM的年5.433+3.-9)%3值均—北)。衣康酸衍生物可降低细胞炎症因子和趋化因子水平。低浓度DMA高浓度DMA高浓度X)预处理的MLE-IO细胞经LPS诱导后，CXCL15、TNFp高犔mRNA相对表达量均显著低于DMSO组3值分别00%同-)，而低浓度X)组仅；肺mRNK 相对表达量显著低于DMSOM3003，高浓度OIM CXCL15、TNFp高LE mRNK相对表达量均显著低于低浓度X)组3值均003/高浓度DMI预处理的A49细胞在LPS诱导后犜犉高犔高犔mRNK相对表达量均显著低于低浓度DMIM和DMSOM3值分别<000.05)。结论气管内滴注衣康酸衍生物可减轻脓毒症模型小鼠急性肺损伤程度，其机制可能与调节肺上皮细胞趋化因子表达变化有关另
【关键词】急性肺损伤；衣康酸；炎症细胞浸润；细胞因子类
【引用本文】章晓辰，李盈科.衣康酸衍生物通过调控肺上皮细胞趋化因子减轻急性肺损伤的研究临J•上海医学, 2026,44(3):187-190.
DOR17.3〜2/j.—kO issn.0253-9—4.2026.03.016
Itaconate attenuates acute lung injury by regulating the expressioe oO chemokinee io pulmonary epithelial cello ZHANG Xiaochee,LI Yingkn.Departmeot T Anesthesiology,SeconC AffiliateC CospiZC T Na vol Medicnl Cniversits, Shanghd200003,Chinn
Correspondiny auther:LI Yingks.E・mC：
【Abstract】Objective T o obrve the effect of intratracheal instillation of itaconate on lipopolysaccharide(LPS)-i nducey acute lung injury and the infiltration of inflammation cells in elveoli dn ptis mice.Methode A total of26wild type C57BL/6 mico wero ud.Eight mico were randomlp divided into phosphato buffer saline(PBS)group and LPS group with4mico in oach group.Sepsis model was established by intraperitpneal injectipn of LPS.After24hours,the mice were sacrificed any tho lung tissues wero harvested.Tho changes o L inflammatory cell infiltration wero obrved by H-d staining.Another)mico 基金项目国家自然科学基金面上项目年15715-限2—〜)
作者单位：2-0-上海供军军医大学第二附属医院麻醉科
通信作者：李盈科供子邮箱为liyingkeARtrnaid-m
•188•ShangAi RedJ,2021,Vol.04,No.3
were randomly divided into PBS group,bimethyl itaconate(DUI)proup and4-octyl itaconate⑴)proup wits T mice C each group.Tip hours after intratracheal instillation of PBS,AMI and01,psis model was established by intraperifoneal injectioe ot LPS.The mice were sacrificed20hours later,and bronchoalveolar lavage fluid(BALE)and lung tissue were taken.The proportion of inflammatorp cells C bronchoalveolar lavage fluid was determined by flow cytometrp.The infiltration ot inflammatorp cells C lung tissue was obrved by eyes and H-O staining.MLE-13cells were randomlp divided inH LPS00 group,73group and C3group wits T wells C each group.Total mRNA was collected after LPS stimulatio n for C h,33and 3h,respectivelp.MLE-13c ells were also randomlp divided inH dimethyl sulfoxide(DMSO)group,low concentratioc (62.5pmol/E)DSI group,high concentration(125pmol/E)RSI group,low concentration(62.5pmol/E)Rl group and high concentration(25pmol/E)Rl group with h wells C each group.M545cells were randomlp divided into DMSO group,low concentration(62.5pmol/E)DSII group and high concentration(125pmol/E)DSII group with h wells C each group.Total mRNA was collected after stimulation with LPS for C3.The mRNA expression of cytoPines P TNF-c and IL-h)and chemoPines (CXCL3or/L-O)were determined by real-time quantitative polymera chain reaction(PCN).Resulte Oompared with PBS group,the infiltration of inf
lammatorp cells C the lung tissue ot ptic mice was obvious C LPS group.The levels ot pulmonary epithelial cytoPines and chemoPines C LPS group were significantly higher than tho C the control group. Intratracheal administration of itaconaH coulO reduce intra-alveolar hemorrhage C ptic mice.The proportion of neutrophils in BALE ot mice was⑶.467—7.850)C in DMI group and(30.767—7.393)C C Ol group,Thich was significantlp lower Has that C PBS group(住5.433±5.17—%,both P V0.05).Itaconate coulO reduce the levels ot inflammatorp cytoPines and chemoPi nes,Thich was positivelp correlated with the concen t ratio n of itac o n a te.C the in vitrn experime n t ot MLE-13cell line,the mRNA expressions ot TNF-c,IL-O and OXCL-3C low concentration DMI group,high concentration DMI group and high concentration Ol group were significantly lower than tho C DMSO group(本<<.01,0.05).The mRNA expression ot IL—C low concentration Ol group was significantly lower than that in DMSO group(住^^).The mRNA expression levels ot TNF-c,IL-O and OXCL-3C high concentration Ol group were significantly lower than tho C low concentration Ol group (all P V0.05).C the in vitrn experiment ot A547cell line,the mRNA expressions ot TNF-c,—O and IL-O C the high concentration DMI group were significantly lower than tho C the low concentration DMI group and DMSO group(本<<.41, 0.05).Conclusioc In t ratracheal in s tillatio n o f itaco n aH ca n reduce acute lu n g injury C ptic mice,which ma y b e related to the regulation of the expression of chemoPines C pulmonary epithelial cells.
【Key words】Acute lung injure；Itac o n a te；Inflammatorp cell in f iltratio n；OytoPi n es
急性肺损伤（acute lung iRurp,ALA是以肺部炎症和肺泡毛细血管屏障破坏为特征的临床综合征，常继发于重症肺炎、脓毒症、严重创伤等疾病2。多种炎症细胞参与了ALI是部炎症的发生、发展过程。中性粒细胞在清除肺部病原体的同时破坏了肺泡毛细血管屏障，甚至促使疾病进展为呼吸窘迫综合征。趋化因子在中性粒细胞、巨噬细胞的定向聚集过程中发挥重要作用。趋化因子CXCL1在小鼠黏膜上皮细胞中特异性表达2，其与人类ILR基因同源，在肺部发生炎症时对炎症细胞的聚集和浸润起到重要作用21。
衣康酸由免疫应答基因-（immune-responsive gene A具G1）编码的顺乌头酸脱竣酶与三羧循环中的顺乌头酸发生脱羧反应而来，在活化状态的巨噬细胞中大量产生并分泌21。衣康酸可在巨噬细胞中发挥杀菌活性21，还可以通过影响细胞因子的表达和炎症细胞的分化发挥重要的抗炎作用21，但其是否对上皮细胞发挥作用尚不明确。二甲基衣康酸（DMI）和四辛基衣康酸（01）是两种膜浸润性较强的衣康酸衍生物，在细胞培养过程中可以自由透过细胞膜，在细胞内发挥作用。本研究利用小鼠肺上皮细胞系脓毒症模型，探索衣康酸对肺上皮细胞趋化因子的表达影响，对趋化因子介导的炎症细胞浸润的调节作用，以及其在脓毒症条件下的器官保护作用。
1材料与方法
1.9动物和细胞株来源与主要试剂6〜8周C57BL/C小鼠，购自海军军医大学实验动物中心2物生产许可证号SCXKt2）201003，使用许可证号SYXKt沪是22种例患小鼠级肺上皮细胞系MLL-10（CKL-2152和人非小细胞肺癌细胞系A549（CCL-15）均购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。脂多糖（LP提购自美国Sigma公司；DMIU自阿拉丁试剂（上海）有限公司；OI购自美国Cayman Chemical公司；实时定量PCO引物购
上上医学2021年第44卷第4期•189•
自上海生工生物科技有限公司；紫草素叶绿素（PerCP）标记的抗小鼠CD43抗体、藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠CD110抗体购自BioLegend公司。多聚甲醛经BS等常用试剂均由海军军医大学医学免疫学研究所提供另
1.0小鼠脓毒症模型的建立采用数字表法将0只C57BL/6小鼠随机分为PBSM和LPSM，每组4只。LFS组小鼠予腹腔内注射3mg/ky LPS MBS组注射等量PBS。24hR处死小鼠，收集其肺组织进行后续实验。
）3衣康酸衍生物干预LPS处理的肺上皮细胞将MLE-10细胞培养于含2%的胎牛血清（FBS，购自美国Gibcu公司）和2的青霉素、链霉素、两性霉素溶液（购自美国Thermo Fishes公司）的DMEM/F10培养基中，置于37C恒温箱培养24hR换液，将细胞悬液接种于24孔板中，随机分为二甲基亚砜（DMSO）
组、低浓度DM）组、高浓度DMIM、低浓度01组、高浓度01组，每组4孔。低浓度和高浓度衣康酸组分别加入终浓度为62.3gmol/W和〜5gmol/W的DM）或01溶液，DMSO组加入等体积DMSO；4后余□入LFS （终质量浓度为67mg/E），刺激6h后收集细胞，提取细胞总RNA，继续后续实验。将A5-细胞培养于含〜％FBS（购自美国Gbcu公司）和2的青霉素、链霉素、两性霉素溶液的DMEM培养基，置于—C恒温箱培养24hR换液，将细胞悬液接种于08孔板中，随机分为DMSO组、低浓度DMI或、高浓度DMI或，每组4—，分别加入DMSR 和终浓度为62.6受ol/W高5受ol/L DMI预处理3本后静入LPS（终质量浓度为％mg/W；刺激6h 后收集细胞，提取细胞总mRNA，静行后续实验另
）4应用衣康酸衍生物干预小鼠肺损伤模型
采用数字表法将〜只C57BL/6小鼠随机分为PBSM、DMIM、OIM，每组6只。按照52mg/ky 分别计算DM）和OI的用量，用PBS配置成悬液。DMIM、0I组小鼠气管内滴注相应的药物悬液〜受静BS组气管内滴注等体积PBS。6为后，所有小鼠予腹腔内注射LPS（5mg/kg,，饲养24R每组随机选取3只小鼠提取其支气管肺泡灌洗液，之后取所有小鼠肺组织，继续后续实验。
）6肺组织病理学检查右下叶肺组织以4%多聚甲醛固定24R制备石蜡切片（厚度为—m和经H-EW色后置于光学显微镜下观察。以镜下肺泡壁宽度评估肺组织水肿情况，通过肺泡壁周围有核细胞密度评估炎症细胞浸润情况。）0支气管肺泡灌洗液的获取和流式细胞术检测各组小鼠经PBS或衣康酸衍生物
预处理，腹腔内注射LFS08h后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠，手术暴露气管，并插管。用2%LPBS反复冲洗后吸出，置于eppendoct管中；立即于4恒200Xg离心5min，获取的细胞用350加入荧光抗体的PBSM悬，并避光孵育67min，再次离心（200X g, -min,6恒），并以100受PBSM悬后，使用流式细胞仪检测3
1—实时定量聚合酶链反应（PCR）检测利用总RNA极速抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）按照实验步骤提取各组MLE-10—A545细胞总RNA，置于-％C保存至使用。对于每个样本，在07受反转录体系中，使用反转录酶MWW反转录637c VA。实时定量PCO反应按照TE Green （日本TaKaDa公司）说明书混合转录模版、引物和试剂，进行定量PCR。以GAPDH作为内参对照，对比TNF-a、L6、CXCL2或L WnRNA相对表达量，引物序列见表士
表1引物序列
引引名称引引序列D'S）
小鼠GAPD11
郭沫若的诗集有正向引引
反向引物
AGA TCN GTH TGK ACT GA TTY
TGH AGA OCA TGH AGH TGA GGT CT 小鼠TNF~o
小鼠L W
人GAPDH
正向引物CAG GCG GTG CCT ATA TCH C
反向引物CGA TCA AC CGA AGT HCA GK A
正向引物TAG TCH TCC T A C CCC ANT TTC C
反向引物TTG GTC CTH AGO CAO TCC TTC 小鼠CXCL16
正引引物
反引引物
TOO AGA AA AT AM?GCA ACK A
ONT TGC CGA TGG AAA TTC CTH 正向引物CTH GGC TAC ACT GAG ETC C
反向引物A A G TGG TCA TTG AGA GCA ATA
正向引物TGC ACT TTG GAG TGK TCT GC
反向引物ACT CGG GGT TCT AGA AGA TH
正向引物ACT CAO NO TTC AGA AU A A TH
bd销售反向引物COA TCT TTG GAA GGT TCA GGT TG
正向引物CTA GCC GTG GCT CTC TCT HA
反向引物CCT TAG CAA AKC TAC ACC TH 1.0统计学处理应用SPSS22.0统计学软件。呈正态分布的计量资料采用士s表示，多个独立样本采用单因素方差分析（one-was GNOVK-；多组相关样本采用多重检验。以><0—5为差异有统计学意义。
2结果
2.6LPSM导的脓毒症小鼠模型和肺上皮细胞模型特征在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中发现，LPSM小
鼠肺部中性粒细胞浸润较PBSM明显，见图1另与未处理的MLKW细胞购h）相比，
•年2 •
Shanghai Red J,2021 Moi. 44, No. 3
LPS 诱导小鼠MLL-10细胞〜6 h 后，RNF ra
LR 和CXCL10的mRNA 相对表达量均显著升
高纵值分别＜2版2岁见表阻
图1腹腔内注射LPSM 导脓毒症模型小鼠肺部
炎症细胞浸润情况（H-E 染色无1%
表2 LPSR 导的各时间点MLL-15例胞各炎症因子
可NA 相对表达量的比较
（2=4敷土表
LPSW 激时间CX.CL1
TNF-2
L R
0 h
荷叶怎么画>青年大学习特辑答案5. 009 + 0. 15
5. 069 + 0. 19
5. 012 + 0. 25
0 h 2. 24士0. 28① 5. 22 + 5. 91① 5. 849 + 5. 551①5 h
5. 498 + 0. 835®
2. 698 + 5. 2②
6. 61士2. 29②
与0 h 比较:①犘＜0. 0%②犘＜0. 05
22 衣康酸衍生物降低LPS 诱导的MLL-10细
胞炎症因子mRNA 表达量低浓度和高浓度 DMI 组各细胞炎症因子mRNA 相对表达量均显
著低于DMSO 组（D 值均V02）。高浓度01模桌签
各细胞炎症因子mRNA 相对表达量均显著低于 低浓度01组和DMSN 组纵 值分别V 02%
0.上）；低浓度01组仅ILR mRNA 相对表达量显
著低于DMSO 组（DV02）。见表0。
表3
两种衣康酸衍生物预处理后MLL-15细胞各炎症
因子可NA 相对表达量的比较
(2=4M±5)
组别
CX.CL1
TNF-3
L R
DMSN
5. 001 + 0. 052
5. 003 + 0. 090 5. 001 + 0. 01
低浓度DM ）0. 559 + 0. 28①0. 486 + 0. 072①0. 353 + 0. 035®高浓度DM ）0. 497 + 0. 030®
0. 470 + 0. 013®0. 351 + 0. 027①低浓度0（0. 833 + 0. 25
0. 831 + 0. 25
0. 71 士0. 065①
高浓度0（
0. 566 + 0. 27②③ 0. 508 + 0. 01①③0. 391 + 0. 027①
22 DM ）降低可组诱导的A5—细胞炎症因子
mRNA 表达量 低浓度DM ）预处理后 何5倍 细
胞的TNFm 、ILm 小Lm mRNA 相对表达量与
DMSO 组的差异无统计学意义纵值均〉0. 2岁
高浓度DMI 预处理的A5—细胞的 犜种、镇R 、 L R mRNA 相对表达量均显著低于低浓度DM ）
组和DMSO 组纵值分别V02 限2岁 见表％
表4 DM ）预处理后AO9例胞各炎症因子
mRNA 相对表达量的比较
（2=4敷土表
组别
L R
TNF-3
LR
DMSN
低浓度DM ）
高浓度DM ）
移动笔试
5. 003 + 0. 085®0. 923 + 0. 021 ①0. 773 + 0. 070
5. 008 + 0. 1 北②0. 842 + 0. 054②0. 568 + 0. 01
5. 005 + 0. 200. 952 + 0. 071②0. 51 + 0. 075
与高浓度DMIM 比较：①犘＜0. 05,②犘＜0. 85
8.-衣康酸衍生物经气管内给药减轻脓毒症模 型小鼠肺损伤 观察小鼠肺脏大体标本发现i
DMIM 和MM 小鼠肺泡内出血面积均小于PBO
组，见图阻 IE 染色示：DMIM M 组小鼠肺组
织肺泡内炎症细胞浸润水平均低于PBO 组i
见图0。
图2不同预处理的脓毒症模型小鼠肺部损伤情况
各组小鼠的肺泡灌洗液流式细胞术检测示：
DMI 组和M 组小鼠肺泡灌洗液中CD11阳性细胞
（中性粒细胞）分别占总细胞数的阻1.17 + 5. 850）＞
和29. 767 + 3.上〜编，均较PBO 组的25. 433 士
0. 2）%显著降低纵值均V0. 21，见图士
与DMO O 组比较：①犘＜02,②犘＜0. 2。与低浓度OI 组比 较：③犘＜0. 85
A PBS 组
B DM ）模
C OI 模
图3不同预处理的脓毒症模型小鼠肺部炎症细胞浸润水平（H-E 染色无
1%
上海医学2021年第44卷第3期
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A PBS组
B DMI组C01组
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图4不同预处理的脓毒症模型小鼠肺泡灌洗液中CDllb阳性细胞比例
3讨论
中性粒细胞参与肺部炎症的发生与发展，而过度的中性粒细胞浸润，可能引起上皮细胞和内皮细胞的死亡S加重局部组织损伤。趋化因子对炎症条件下中性粒细胞的局部定向性聚集有重要影响，尤其是组-8(小鼠体内表达为CXCL15)在肺黏膜等部位表达水平较高■在局部炎症趋化反应中发挥重要的作用。所以而制中性粒细胞的过度聚集而持适当的组织炎症反应程度，在控制ALI的发展中可能发挥重要的作用。
经组织病理学检查发现，LPS诱导的脓毒症模型小鼠肺脏出现了明显的炎症细胞浸润。在小鼠MLE-15细胞系中也观察到，细胞系经LPS诱导3、6h后而NFp、IL-1和CXCL1)mRNA相对表达量即明显升高，说明在脓毒症的早期，上皮细胞即可对炎症细胞有直接的趋化作用，诱导中性粒细胞聚集说而使ALI的发生成为可能。
衣康酸除可在小鼠巨噬细胞内发挥免疫调控的作用外说整个免疫调节过程中也发挥着重要的作用。作为线粒体能量代谢和细胞免疫功能之间的桥梁5，衣康酸可作用于包括Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-l(Keapl)-核因子E2相关因子2 (Nrf2)页、组"TF3⑺等通路，调节巨噬细胞免疫功能⑻，发挥抗炎作用。同时，衣康酸被发现对体内组织有一定的抗氧化作用，衣康酸预注射可以缩小心肌缺血小鼠模型心肌梗死的面积(提示衣康酸存在潜在的器官保护作用。IRG1不仅仅在活化状态下的巨噬细胞、小胶质细胞等免疫细胞中表达；在病毒感染的肺组织、神经元说至妊娠期的子宫内膜细胞中，IRG1的表达水平也有提高55；这些都提示了IRG5和衣康酸不仅表达于免疫细胞诱时也在实质细胞的病理生理过程中表达，并可能发挥作用。
本研究使用DMI和01预处理MLE-12和 A549细胞系诱、鼠气管内滴注衣康酸衍生物诱探索衣康酸在ALI中的作用。结果发现，虽然LPS可诱导肺上皮细胞炎症细胞因子和趋化因子mRNA相对表达量增加，但两种衣康酸衍生物均对LPS诱导的炎症有抑制作用；并且说在较高浓度下(小5M mol/E-可以降低CXCL1)mRNA 的表达，而DMI在较低浓度下小2.5M mol/E-即可发挥炎症抑制作用。在后续的小鼠体内实验中，经气管内给予DMI或01的小鼠在LPS诱导后肺出血面积较小、肺上皮毛细血管屏障破坏较少提泡内炎症细胞浸润程度较低。经肺泡灌洗液细胞组成比例分析验证说DMI或01处理的小鼠肺泡灌洗液中说性粒细胞的比例均较对照组显著下降。
综上所述说肺泡内局部应用衣康酸衍生物可以减少脓毒症小鼠肺泡内炎症细胞的聚集和浸润说机制可
能与衣康酸衍生物可以减少肺上皮细胞在脓毒症条件下细胞因子和趋化因子的表达相关。说明了衣康酸在脓毒症或全身炎症反应的发生和发展过程中具有潜在的器官保护作用。
空气炸锅炸鸡参考文献
:5]SAP0ZNIK0V A,GAE Y,FALACD G,et al.Early disruption o2the alveolar-capillary barrier in a ricin-induced
ARDA mousr model:neutrophil-dependeot and-independeot
impairmeot ot junction proteins]J、Am J Physiol Lung Cell
Mol Physiol,2019,316(D：L255-L26(.DOI：10.1152/
ajplun C.00301.2018.
J J5SCHMITZ J M,MCCRACKEA V J,DIMMITT R A,et al.
Expression of CXCL12(Lungkine-in murine
gastrointestinal,erogenital,at endocrine organs H J S-J
Mistochem Cytochem,2007,55(5)：515-529.DOI:10.
1369/jhc.6A7129.
2007.
