中国组织工程研究第16卷第7期 2012–02–12出版
Chine Journal of Tissue Engineering Rearch February 12, 2012 Vol.16, No.7 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
1211 Department of Ophthalmology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Zhang Hai-feng☆, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Ophthalmology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China surgeonzhf@
< Correspondence to: Lu Xiao-he, Professor, Chief physician, Department of Ophthalmology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Supported by: Guangdong Science and Technology Plan Projects,
No.2008B080703037*
Received: 2011-12-09 Accepted: 2011-12-29
结膜下注射50 µmol/L p38信号转导通路抑制剂SB203580对角膜细胞的毒性*☆
张海峰，钟彦彦，黄淑馨，陆晓和
Toxicological effect of 50 µmol/L p38 signal transduction pathway inhibitors SB203580 via subconjunctival injection on rat corneas
Zhang Hai-feng, Zhong Yan-yan, Huang Shu-xin, Lu Xiao-he
Abstract
BACKGROUND: SB203580 which is one of the special inhibitors of p38 signal transduction has the anti-inflammatory ability and
can inhibit the growth of tumor vesls. However, the toxicity and irritation of SB203580 may be the obstacle of the application on
eyes.
OBJECTIVE: To study the toxicological effect of SB203580 with subconjunctival injection on rat corneas.
METHODS: Right eyes of SD rats were preformed with subconjunctival injection of 0.04 mL of 50 µmol/L SB203580 and saline in
the same do respectively, once per day for 7 days. At 7 days after injection, the corneal inflammation index was recorded and
all the right corneas were harvested for histopathological and ultrastructural examination.
RESULTS AND CONCLUSION: Reversible anemia-like conjunctiva was obrved in SB203580 group and disappeared at the
cond day after injection; After injection with SB203580 and saline, no significant difference of corneal inflammation index was
found between the two groups (P > 0.05), but the ciliary congestion score in saline group was higher than that in SB203580 group
(P < 0.05). Histological examination revealed that all rat corneal epithelium were completed, the stroma was arranged in order
and the cortex was continuous. No obvious abnormal corneal structures and organelles were found under transmission electron microscope. This suggests that subconjunctival injection of 0.04 mL of 50 µmol/L SB2036580 had no obvious toxicological effect
on rat corneas.
Zhang HF, Zhong YY, Huang SX, Lu XH.Toxicological effect of 50 µmol/L p38 signal transduction pathway inhibitors SB203580
via subconjunctival injection on rat corneas. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(7): 1211-1214.
[ ]
摘要
背景：p38信号转导通路抑制剂SB203580具有抗炎及抑制肿瘤血管生长的作用，但其刺激性和毒性成为眼表应用的障碍。
目的：观察结膜下注射SB203580对大鼠角膜的毒性作用。
方法：分别于SD大鼠右眼结膜下注射0.04 mL 50 µmol/L SB203580或等量生理盐水，1次/d，共7 d。注射后第7天记
录各组角膜炎症指数，并摘取角膜行组织学及透射电镜检查。
结果与结论：裂隙灯显微镜下观察发现SB203580注射部位结膜呈可逆性贫血状改变，在注射次日消失；注射SB203580
或生理盐水后，大鼠角膜炎症指数差异无显著性意义(P > 0.05)；但注射生理盐水后睫状充血程度重于注射SB203580的大
鼠(P < 0.05)；组织学检查发现所有大鼠角膜上皮层完整，基质层排列规则，内皮层连续，透射电镜观察发现细胞结构及细
胞器无明显异常。提示结膜下注射0.04 mL 50 µmol/L SB2036580对大鼠角膜无明显毒性作用。
关键词：角膜；SB203580；p38；毒性；抗炎
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.017
张海峰，钟彦彦，黄淑馨，陆晓和.结膜下注射50 µmol/L p38信号转导通路抑制剂SB203580对角膜细胞的毒性[J].中国
组织工程研究，2012，16(7):1211-1214. [h ttp:// h ttp://]
0 引言
正常角膜没有血管，在炎症、免疫、外伤等病理因素作用下，角膜缘血管逐渐侵入透明角膜内，形成角膜新生血管[1]。角膜新生血管不仅改变了角膜固有的免疫学特征，如免疫赦免机制丧失、炎性细胞浸润等，而且明显降低角膜透明度，产生角膜瘢痕，严重影响视功能。眼部新生血管一直都是研究的热点和难点，临床上对角膜新生血管的治疗策略有限，对于有可能导致角膜新生血管的眼表疾病缺乏有力的预防措施。
目前的研究发现，p38信号转导通路在调控炎症反应过程中发挥了重要作用[2]；p38通路抑制剂SB203580等能降低肉芽肿组织内血管密度[3-4]，抑制肿瘤组织血管生长[5-6]。但由于SB203580具有较大的刺激性和毒性，能否在眼表局部使用值得深入研究。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2011-01/10在南方医科大
张海峰，等. 结膜下注射50 µmol/L p38信号转导通路抑制剂SB203580对角膜细胞的毒性
P .O. Box 1200, Shenyang 110004
1212
www.CRTER
南方医科大学珠江医院眼科，广东省广州市 510282
张海峰☆，男，1979年生，河南省荥阳市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，主要从事角膜病的基础研究。 urgeonzhf@
通讯作者：陆晓和，教授，主任医师，南方医科大学珠江医院眼科，广东省广州市 510282 luxh63@
中图分类号:R318 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2012)07-01211-04
收稿日期：2011-12-09
修回日期：2011-12-29 (20111113010/ WLM ·C)
学珠江医院中心实验室完成。
材料：健康清洁级SD 大鼠20只，雌雄各半，体质量180~220 g ，鼠龄6~8周，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤) 2006-0015。实验过程中严格参照2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》处置实验动物[7]
。
主要试剂与仪器：
实验方法：
SB203580溶液的配置：在超净工作台中，二
甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)滤菌预冷备用，取0.05 mL 加入1 mg SB203580，密闭，充分振荡混匀，然后加入预冷的生理盐水 53.00 mL ，再次充分振荡混匀，配置成工作浓度为50 µmol/L 的SB203580溶液，按每支1 mL 分装于无菌冻存管中，-20 ℃冻存备用。
实验动物分组：SD 大鼠20只适应性饲养1
周，裂隙灯显微镜检查排除大鼠结膜、角膜疾病后开始实验。按随机数字法分为SB203580
组和生理盐水组，每组10只。
结膜下注射：大鼠空腹2 h ，腹腔注射100 g/L
水合氯醛溶液4 mL/kg 麻醉，均选取右眼进行干预。滴用5 g/L 盐酸丁卡因表面麻醉，冲洗结膜囊，手
术显微镜下，在角膜缘外0.5~ 1.0 mm ，沿顺时针方向，在12，2，4，6，8，10，12点位注射，依次每日选取1个注射点，每日1次行结膜下注射，共7 d 。按照实验分组分别注射50 µmol/L SB203580和生理盐水0.04 mL 。
临床观察：注射后次日麻醉后，在手术显微
镜及裂隙灯显微镜下观察，重点观察注射点结膜充血情况、角膜透明情况以及上皮是否完整等。
角膜炎症指数评分：结膜下注射7 d 后，麻醉
后在裂隙灯下观察中央角膜水肿程度、周边角膜水肿程度以及睫状充血程度并参照以下标准进行评分[8]
，将各分值求和后除以9，即为每个角膜的炎症指数。中央角膜水肿：无水肿，0分；有水肿，能分辨虹膜细节，1分；有水肿，虹膜细节不能分辨，但瞳孔可见，2分；严重水
肿，瞳孔窥不见，3分。周边角膜水肿：无水肿，0分；有水肿，能分辨虹膜细节，1分；有水肿，虹膜细节不能分辨，但虹膜组织可见，2分；严重水肿，虹膜组织窥不见，3分。睫状充血程度：无充血，0分；有充血，充血带宽度小于1 mm ，1分；有充血，充血带宽度大于1 mm 但小于 2 mm ，2分；充血带宽度大于3 mm ，3分。
组织学及透射电镜观察：结膜下注射7 d 后，
喝茶享受的句子>梦见被蜜蜂蛰麻醉后在手术显微镜下摘取角膜，仔细分离虹膜等组织，注意不带角膜缘，沿中心线剖切一分为二。一半用40 g/L 多聚甲醛固定，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色观察组织学改变；另一半迅速用遇冷的25 g/L 戊二醛固定，常规丙酮梯度脱水，置入1 000 g/L 丙酮及等量Epon812包埋剂中渗透1 h ，常规Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察。
主要观察指标：角膜炎症指数、组织学以及超微结构变化。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件包进行数据处理。结果用x _
±s 表示，组间比较采用t 检验，以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 实验共纳入20只大鼠，全部进入结果分析。
2.2 临床观察结果 实验过程中，两组大鼠表现出比较好的耐受性，在麻醉清醒后，大鼠无明显瞬目、流泪等症状；在SB203580组，注射
局部结膜呈轻度贫血貌；在每次结膜下注射后次日，注射部位结膜贫血样外观基本消失；而生理盐水组伴有轻度结膜充血；两组角膜均透明，无明显水肿。
2.3 两组大鼠的角膜炎症指数 见表1。
注射后7 d ，SB203580组与生理盐水组角
试剂及仪器
来源
SB203580 裂隙灯显微镜 透射电镜H-7500
手术显微镜-M841
显微手术器械
美国Invitrogen
德国Zeiss 日本Hitachi 美国Leica 苏州明仁
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膜炎症指数差异无显著性意义(P > 0.05)。但睫状充血
程度评分，生理盐水组高于SB203580组(P < 0.05)。
2.4 两组大鼠角膜的组织学改变苏木精-伊红染色
显示，两组角膜上皮层排列整齐，无水肿，基质层排列
规整，内皮层连续、光滑、无断裂；未见明显炎性细胞
浸润，未见血管样结构，见图1。
2.5 大鼠角膜的超微结构改变透射电镜观察显示，
两组大鼠角膜上皮细胞间隙无扩大，细胞膜完整，核膜、
核仁完整，细胞器未见明显异常，见图2。
3 讨论
p38信号通路在炎症过程中发挥了重要作用[9-16]，
但SB203580具有较大的刺激性，在研究中需要研究人
员适当隔离防护，并避免沾染黏膜、皮肤、眼睛等。实
验将SB203580注射在大鼠结膜下，研究其对于大鼠角
膜的毒性作用。
SB203580是吡啶异咪哒唑类化合物，分子式为
C21H16FN3OS，相对分子质量为377.4，通常在-20 ℃
下保存，为固体粉末，易溶解于DMSO，具有较大的刺
激性和毒性[17-18]。处于工作浓度的SB203580溶液需要
-20 ℃冷藏保存，避免反复冻融，以免影响其品质。在
实验中，首先将SB203580溶解于遇冷的DMSO中，
然后再参照实验要求将其溶于生理盐水中。DMSO是一
种良好的有机溶剂，但是研究发现培养液中DMSO浓
度为10%时，细胞生长抑制率接近100%[19]；即使是
0.004%的浓度，DMSO对细胞的生长也可能有不利的
影响；但是一般认为DMSO在0.1%以下，基本不会对
实验结果产生影响[20-21]。上述数据均来自细胞培养实
验，体外培养细胞对培养条件要求较为苛刻；而实验最
终选用的工作液中DMSO浓度为0.094%，并且为体内
实验，因而在实验操作中并未将其作为影响因素进行评
估。
目前报道SB203580浓度有：10，20，25 µmol/L
等[21-23]，分别用于不同细胞培养和在体动物实验。在预
实验中课题组曾经选择了25，50，100 µmol/L滴眼，
100 µmol/L SB203580滴眼对大鼠眼表刺激很大，大鼠
瞬目、流泪症状比较剧烈，并且短时间出现了角膜上皮
水肿，因此100 µmol/L SB203580可能对角膜毒性很
大，而25，50 µmol/L SB203580无明显刺激性。考虑
到在使用SB203580溶液时需要进行适当的生物防护，
并且药物本身具有刺激性，因此将0.04 mL 50 µmol/L
SB203580注射于结膜下，以避免滴眼可能引起的药物
外溢，同时避免对实验操作者的潜在伤害。当然在眼部
用药中，滴眼是最为便捷的用药方式，在以后的研究中，
适当改良制剂类型，或者选用其他的p38信号转导通路
射手座的性格
抑制剂也许仍然可以考虑滴眼这一便捷的用药方式。
在SB203580结膜下注射过程中，仅发现在注射部
位结膜轻度水肿，呈贫血状，并呈可逆性改变，注射后
第1天裂隙灯显微镜检查即恢复正常，毗邻注射部位角
膜未发现可观察到的临床改变；而生理盐水组注射部位
结膜轻度充血。实验采用顺时针方向从12点位置开始
八一建军节手抄报沿角膜缘不断变更注射部位并避开结膜血管，大鼠表现
出了比较好的耐受性。
研究发现结膜下注射SB203580与结膜下注射生
理盐水刺激症状无明显差异，耐受性较好，麻醉清醒后，Figure 1 Pathohistological change of rat corneas
(Hematoxylin-eosin staining, ×200)
图1 大鼠角膜的组织学改变(苏木精-伊红染色，×200)耳熟能详
a: Saline group
b: SB203580 group
咨询服务Figure 2 Ultrastructure of rat corneas in two groups
(Transmission electron microscope)
图2 大鼠角膜组织的超微结构(透射电镜观察)
a: Saline group (×15 000)
b: SB203580 group (×25 000)
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大鼠无明显瞬目、流泪等症状。但是实验操作中大鼠麻醉清醒需要一个过程，通常在注射后4 h ，才进行临床观察，因而刺激症状评估具有相对的滞后性；换言之，假如在表面麻醉后行SB203580结膜下注射，也许刺激症状会比较大，但是在注射后4 h ，刺激症状轻微，具有很好的耐受性。
角膜炎症指数评估是经典的角膜临床观察方法。在裂隙灯显微镜下对角膜中央、角膜周边水肿程度以及睫状充血程度进行评分。实验发现，在连续7 d 结膜下注射SB203580后，各组角膜基本保持透明，SB203580组与生理盐水组角膜炎症评分无明显差异。实验中发现生理盐水组睫状充血评分略高于SB203580组，临床观察到生理盐水组睫状充血较为明显，而SB203580组睫状充血不明显。可能与SB203580对炎症反应的拮抗有一定的关联。
在连续7 d 大鼠结膜下注射SB203580后，角膜上皮层排列整齐，基质层纤维排列有序，内皮层完整，未见明显水肿及炎性细胞浸润；进一步透射电镜检查未发现细胞器有明显损伤性改变。这些结果表明，在体内实验中，结膜下注射50 µmol/L SB203580对大鼠角膜无明显毒性作用。
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