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【实验研究】淡豆豉炮制中Y-氨基丁酸含量测定及其抗抑郁作用研究
陈青峰h2#，贺婧3#，谢小梅\王立元、谢卫华\苏明声、罗小泉、龙凯”
1. 江西中医药大学，江西南昌330004
2. 江西省中西医结合医院，江西南昌330003
过生日
3. 南昌大学转化医学研究院，江西南昌330031
摘要：目的检测淡豆豉炮制过程中各样本7_氨基丁酸（G A B A)含量并研究其抗抑郁作用。方法应用柱前在线衍生-高 效液相色谱技术测定原料黑大豆（H)、发酵第6天（F6)、再闷6d (Z6)、再闷15d (Z15)样本水煎液中GABA含量；将 昆明种小鼠随机分成对照组、模型组、盐酸氟西汀（阳性对照，0.01 g/kg)组、GABAC0.012 8 g/kg)组、H( 1.52 g/kg)组、厂6(1.52§化§)组26(丨.52£化8)组和215低、中、高剂量（0.76、1.52、3.04§/^)组，采用单笼饲养加慢性温和不可预知性应激（C U M S)制备小鼠抑郁模型，各组在造模同时开始ig给药，每日应激前l h给药，连续28 d。检测各组小鼠体质量、糖水 偏好、敞箱、悬尾、强迫游泳等行为学指标的变化。结果H和F6样本水煎液未检出GABA, Z6、Z15样本的GABA质量分 数分别为5.559、8.421 mg/g。与对照组比较，模型组小鼠的体质量、糖
水偏好、跨格数和直立数均显著减少（P<〇.〇l), 悬尾及游泳不动时间显著增加（•PCO.OSW.Ol)，表明CUMS抑郁模型制备成功。与模型组比较，盐酸氟西汀组、GABA 组、Z6组和Z I5高剂量组糖水偏爱度、敞箱实验跨格数和直立数均显著增加（尸<0.05、0.01), Z15中剂量组糖水偏爱度和 敞箱实验直立数显著增加（PCO.OS.O.Ol)；盐酸氣西汀组、GABA组、Z6组及Z15高、中剂量组悬尾实验的不动时间均显 著减少（PC O.O S A.O l)；各组小鼠强迫游泳实验的不动时间均显著缩短（尸<0.05、0.01)。结论发现淡豆豉炮制后期出现 高含量G A B A；淡豆豉显著改善小鼠的快感缺失、行为绝望等抑郁症状，具有良好的抗抑郁作用并与GABA含量可能有关。关键词：淡豆豉；“再闷”；氨基丁酸；慢性温和不可预知性应激：抗抑郁作用；行为学指标
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2021) 04-0688-07
DOl:10.7501 /j.issn. 1674-6376.2021.04.002
Determination of content of y - aminobutyric acid and its antidepressant effect at different time points during processing of Sojae Semen Praeparatum
CHEN Qingfeng1% HE Jing',XIE Xiaomei1,WANG Liyuan1,XIE Weihua1,SU Mingsheng1,LUO Xiaoquan1, LONG Kai'
1. Jiangxi University of Traditional Chine Medicine, Nanchang 330004, China
羊肉家常做法
2. Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Traditional Chine and Western Medicine, Nanchang 330003, China
3. Institute of Translational Medicine, Nanchang University, Nanchang 330031, China
Abstract: Objective To study the content of y - aminobutyric acid (GABA) and its antidepressant effect of each sample at different time points during the processing of Sojae Semen Praeparatum(SSP). Methods The GABA content in the decoction of raw black soybean (H), fermentation day 6 (F6), "condary fermentation" for 6 days (Z6) and 15 days (Z15) was determined by pre-column on-line high performance liquid chromatography (HPLC). KM mice were randomly divided into control group, model group, fluoxetine hydrochloride (positive control, 0.01 g/kg) group, GABA (0.012 8 g/kg) group, H (1.52 g/kg) group, F6 (1.52 g/kg) group, *
收稿日期：2020-07-06
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81660664)；江西省重点研发计划一般项目（20192BBG L70051)；江西省教育厅科学技术研究项目（G JJ190636、G JJ180655、G JJ170719)
#共同第一作者：陈青峰，药师，从事药学研究。E-mail:
冬的组词
痛不欲生
贺婧，讲师，主要从事微生物学研究。E-mail:
*通信作者：龙凯，高级实验师，从事中药学研究。E-mail:
罗小泉，教授，从事实验动物学教学及动物模型研制。E-mail:
Z6 group (1.52 g/kg) and Z15 low, high, medium and dos (0.76, 1.52 and 3.04 g/kg). The mou depression model was prepared by single cage feeding plus chronic mild unpredictable stress, each at the same time in the building began to ig drugs. The drug was given 1h before daily stress for 28 concutive days. The body weight, sugar water preference and open box of each group were detected. Changes in behavioral indicators such as hangovers and forced swimming were detected. Results GABA content in each sample decoction: H and F6 were not detected, and the content of Z6 and Z15 were 5.559, 8.421 mg/g. Antidepressant effects of each sample: Compared with control group, the weight, syrup preference, cross-grid number and erect number of model group were significantly decread (P <0.01), and the time of suspension and swimming was significant. An increa (P <0.05 or 0.01) indicates that the CUMS depression model was successfully constructed. Compared with model group, the preference for sugar water, the cross-cell number and the upright number of open box experiment in metformin hydrochloride group, GABA group, Z6 group and Z15 h
igh-do group were significantly incread (P < 0.05 or 0.01) , and the preference for sugar water and the upright number of open box experiment in Z15 medium-do group were significantly incread (P < 0.05 or 0.01) . The immovable time of tail suspension test in metformin hydrochloride group, GABA group, Z6 group and Z15 high-do and medium-do groups was significantly decread (P < 0.05 or 0.01) . The immobility time of forced swimming test was significantly shortened in all groups (P < 0.05 or 0.01). Conclusion It was found that there was high content of GABA in the later stage of processing of Sojae Semen Praeparatum, Sojae Semen Praeparatum significantly improved the depression symptoms of mice, such as lack of pleasure and behavior despair, which had good antidepressant effect and might be related to the content of GABA.
Key words: Sojae Semen Praeparatum\"condary fermentation"; y-aminobutyric acid; chronic unpredictable mild stress; antidepressant effects; behavioral indicators
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淡显豉狀Sem eA?尸以黑色种皮品
系大豆为主要原料、桑叶和青蒿为辅料经发酵炮制加工而成。历代本草和历版《中国药典》收载并列 入卫生部首批药食两用名单。淡豆豉既有食物的营养价值还有中药的功效，功能与主治为解表、除 烦
、宣发郁热，用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦 不眠⑴。
本课题组前期首次发现淡豆豉中存在较高含量Y-氨基丁酸(GABA)W，并已筛选鉴定出产GABA 的优势微生物[3],GABA是一种非蛋白质组成天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统首要抑制性神经递质，具有镇静、抗焦虑、增强记忆及改善睡眠的作用，对抑郁、失眠、自主神经失调等疾病有明显改善 作用，与淡豆豉传统功效“除烦”、主治“烦躁胸 闷，虚烦不眠”相吻合，推测淡豆豉可能有抗抑郁作用。慢性温和不可预知性应激(CUMS)模型是经典 的抑郁模型，本实验应用CUMS模型研究淡豆豉炮 制过程中不同时间点各样本GABA含量及其抗抑郁作用。研宄结果将为药食两用淡豆豉开发成安全有效、价格低廉的天然抗抑郁药提供科学依据，并对揭示淡豆豉传统功效“除烦”的科学涵义、规范 淡豆豉炮制工艺等有重要意义。油豆腐的做法
1材料
1.1药材及主要试剂
四川丰都黑大豆、桑叶、青蒿均购自安国冷背药材有限公司，由江西中医药大学附属医院杨安金主任中药师鉴定，分别为豆科大豆属植物大豆G/yc/ne max (L.)Merr.的成熟种子，桑科桑属植物桑Moms a/6a L.的干燥叶，菊科嵩属植物黄花蒿Jrtewh/a
Linn.的干燥地上部分。淡豆豉，按本实验室建立的 规范炮制工艺制备m，储藏4 °C冰箱；GAB A，批号 11509001，质量分数99%，上海阿拉丁生化科技股份 有限公司；盐酸氟西汀胶囊，礼来苏州制药有限公司，批号6621A。冰淇淋的简笔画
1.2实验动物
清洁级KM小鼠100只，体质量(20±2) g，雌雄 各半，由江西中医药大学动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(赣)2018-0003。适应性饲养I 周，温度（25±1)°C，光照时间7:00—19:00，环境湿 度40%〜70%，期间自由摄食和饮水。
1.3主要仪器
MILLI-Q超纯水仪，美国Millipore公司；安捷 伦1260高效液相色谱仪，安捷伦公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；V-1001旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；BS124S电子天平，北京 赛多利斯科学仪器有限公司；20 cm X 20 cm X 30 cm 自制悬尾箱；36 cm X 45 cm X 30 cm自制敞箱。
2方法
湖北咸宁市2.1淡豆豉的炮制和取样
本课题组前期按《中国药典》2015年版建立了规范的淡豆豉炮制工艺[7](历版《中国药典》记载的 淡豆豉制法相同，含2020年版）。炮制过程简述如下：取桑叶90 g、青蒿100 g，分次加入10、8倍生药量的水煎煮1h，滤过，合并滤液并浓缩至1 000 mL ,
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煎液拌入净黑大豆1〇〇〇g中，待吸尽后，隔水蒸1.5 h，取出，稍晾，置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，置温度（30±2)°C、湿度70%的培养箱内发酵6d至 豆粒表面均匀布满黄衣（称“黄衣上遍”，此过程在 发酵第6天时取样，记为F6)。洗去黄衣，装入陶瓷 容器中，置温度为(30 ±2)°C的培养箱再闷15 d(称“再 闷”，此过程在再闷第6、15天取样，记为Z6、Z15)，至充分发酵，香气溢出时取出，略蒸，干 燥，即为淡豆豉成品。成品性状和各项理化指标均符合《中国药典》2015年版要求，各样本置于4 °C保存。
2.2各给药组的药物制备
盐酸氟西汀（阳性对照）组：取盐酸氟西汀胶囊(20 mg)加入20 mL蒸懷水制成1mg/mL的混悬液；GABA组：精密称取12.8 mg GABA，用10 m L蒸 馏水溶解配成质量浓度为1.28 mg/mL的GABA溶液。
淡豆豉炮制过程中不同时间点各组样本：①黑 大豆（H)、F6及Z6组，分别精密称取各样本15.2 g，加入500 mL蒸馏水，浸泡]h后煎煮3次，滤过合并 3次滤液，于旋转蒸发仪中浓缩至100 mL得0.152 g/mL 的样品溶液。②Z15中剂量组：精密称取Z15的样 本30.4 g，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至200 mL; Z15高剂量组：取Z15中剂量组样品100 m L，浓 缩至50 m L即得；Z15低剂量组：取50 m LZ15中剂 量样品，用蒸馏水稀释至100 mL即得。
2.3各组样本中GABA的含量测定
将各组样品水煎煮液稀释至适宜浓度，本课题 组己建立淡豆豉中GABA定量检测的柱前在线衍生-高效液相色谱法[2]，用该法对淡豆豉炮制过程中 不同时间点样本的GABA含量进行检测。
2.4分组与给药
小鼠适应性饲养1周后随机分组，将10 0只小 鼠随机分成对照组、模型组、盐酸氟西汀（阳性对照，0.01 g/kg)组、GABA (0.012 8 g/kg)组、H( 1.52 g/kg)组、F6C1.52 g/kg)组、Z6C1.52 g/kg)组和Z15低、中、高剂量（0.76、1.52、3.04g/kg)组，每 组10只，雌雄各半。1.52 g/kg相当于淡豆豉的成人 601<^临床用量每天10§，丨8给药，给药体积1〇111[/^1>模型组和对照组i g给予等体积双蒸水。各组在造模同时开始给药，每日应激前l h给药，连续 28 d。
2.5 CUMS模型的制备[1I M2]
除对照组外，其他组均采取单笼饲养给予以下慢性应激刺激：禁食24 h、禁水24 h、潮湿垫料、夹尾1min(以小鼠发出哀鸣声为宜)、45 °C热水刺激3 min、斜 笼24 h、4 °C冷水刺激3 min、震荡2 min、通宵照明 24 h共9种刺激，每天随机选取1种应激，持续应激 28 d，使小鼠无法预知将要给予的应激。
2.6小鼠行为学指标的测试[|0~|2]
2.6.1体质量应激前及应激第7、14、21、28天分别测定各组小鼠体质量。
2.6.2糖水偏好实验应激第1、28天进行糖水偏好实验，蔗糖饮水实验是根据动物对甜味的偏好而设计的一种检测方法，当小鼠出现抑郁样行为时，其对糖水的偏嗜度降低。操作简述如下：在进行糖 水偏好实验前训练小鼠使其习惯对糖水的饮用，训 练完成后各组小鼠均禁食禁水24 h后进行2 h的糖 水偏好实验。每笼同时放置事先称好质量的一瓶1%蔗糖水溶液和1瓶蒸馏水，1h后位置互换，2 h 后同时取下所有瓶子称质量，计算蔗糖溶液和蒸馏 水的消耗量。
糖水偏爱度=1 %蔗糖溶液消耗量/(1%蔗糖溶液消耗 量+蒸馏水消耗量）
2.6.3敞箱实验应激前及应激第28天进行敞箱 实验，用来评价实验动物在陌生环境中自主行为、探宄行为与紧张度。制作1个36cm X45cm X30cm 的敞箱，敞箱四周涂黑，箱底用记号笔划分为4X5 个边
长为9 cm方格。实验开始时先将小鼠放入箱中适应1min，再将其置于方格中央并记录3 m in内的行为：水平穿越格子数（3支爪及以上进入同一格 中）、竖直次数（两前足离地后到放下计为1次）。
2.6.4悬尾实验造模结束后进行悬尾实验，悬尾 后拼命挣扎企图逃脱但又无法成功逃脱，从而放弃 挣扎并因此进入特有的“抑郁不动状态”，反映了一 种“行为绝望状态”。将小鼠用胶带在尾部2 cm处 固定于铁架台的试管夹上，使小鼠成倒置状态，小 鼠身体置于20 cm X20 cm X30 cm的自制悬尾箱中，头部离悬尾箱底30 cm。实验时使小鼠倒挂适应2 min，适应后记录4 m in内的累计不动时间。不 动标准：小鼠倒挂静止不动放弃挣扎。
2.6.5强迫游泳实验造模结束后进行强迫游泳实验，动物被迫放在局限且不可逃避的游泳环境中，其将拼命游动试图逃脱，随之感到逃脱无望，便 不再挣扎和游动，此状态称为“行为绝望”。将小鼠 放入高30 cm，直径20 cm，水深10 cm的玻璃缸中，水温25 °C。小鼠先适应2 min，适应后记录4 m in内的累计不动时间。不动标准：小鼠在水中保持漂浮不挣扎的状态。
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2.7统计分析
使用统计学软件SPSS21.0进行分析和统计处理。利用单因素方差分析（One-wayANOVA)进行 组间比较，当方差齐时选用LSD法，方差不齐时选用 Tamhane’sT2 (M)法。
3结果
3.1淡豆豉炮制过程中不同时间点样本的GABA 含量检测
如图1所示，H、F6样本不含GABA，Z6、Z15的 GABA含量分别为5.559、8.421 mg/g。GABA组的 用药剂量相当于Z15中剂量对应的GABA含量。3.2体质量指标
如表1所示，应激前各组小鼠体质量无差异。与对照组比较，模型组小鼠体质量在应激第7、14、21、28天均极显著降低(户<0.01)，表明(：1]1\45抑郁 小鼠的体质量增加缓慢。与模型组比较，盐酸氟西 汀组、GABA组、Z6组在应激第7、14、21、28天体质 量显著增加（P<0.05)，Z15高剂量组在应激第21、28天体质量显著增加(P<0.05)，Z15中剂量组在应 激第14、2丨、28天显著增加（P<0.05),H组、F6组及 Z15低剂量组在应激第7、14、21、28天均无差异。表明Z6和Z15卨、中剂量能显著改善CUMS抑郁小 鼠的体质量增加缓慢的状态。
3.3糖水偏好指标
各组糖水偏爱度见表2，各组在应激前均无差异。应激结束后各组小鼠出现不同程度差异，与对照组比较，模型组对糖水偏爱度极显著降低（P<0.01 )，表明CUM S模型小鼠的糖水
A
GABA
B
C.
1A,A a A j
p
10^~~~ 15~~ ~~~~20 ~~~~^5
//m in
图 1GABA 标准品(A)、H(B)、F6(C)、Z6(D)、Z15(E)
样本高效液相色谱图
Fig. 1High-performance liquid chromatogram of GABA
(A), H(B), F6 (C), Z6 (D) and Z15 (E) each sample
消耗降低、快感缺失明显。与模型组比较，盐 酸氟西汀组、G ABA组、Z6组糖水偏爱度均极显著增加（P<0.01) ;Z15高、中剂量组的糖水偏爱度均显著增加（尸< 0.05 ) ;H组、F6、Z15低 剂量组均无显著差异。结果表明，Z6组和Z15 高、中剂量组能显著改善CUM S抑郁小鼠的糖
表1各组小鼠的体质量变化（*±s,n=10)
Table 1Comparison of weight results of different group mice (x±5,/f=10)
体质量/g
造模0d造模第7天造模第14天造模第21天造模第28天对照—23.82土 1.9330.10 士3.5634.06士4.8735.9U5.1837.37土 5.16模型—23.88土 1.7226.33土2.83#28.51 土3.59"#30.75±3.46#f l29.62土2.28##盐酸氟西汀0.0123.83±2.2229.48士 2.19*32.95±3.30"34.87±3.98*33.49i3.59*
GABA0.012 823.92±1.4629.26±1.73*32.44土2.25*35.08土 3.14.33.50i2.13*
H 1.5223.58±1.9328.38±2.4231.20 士3.1232.77土2.5031.87 土2.91
F6 1.5223.83±1.8527.87±2.6630.51 土 3.2932.74土3.6931.73 土3.43 Z6 1.5223.96±1.9229.10±3.14*32.25±3.47，34.68土3.72*32.93士2.91* Z15 3.0424.00il.8028.07±3.6431.63±4.1134.49±4.43*32.93±5.18.
1.5223.64±1.7028.68±3.6531.97±3.95'34.88±4.34_33.26 土3.69.
0.7624.08±1.7729.06土3.6731.58 土4.1734.36 土4.6132.85土3.99
与对照组比较:，<o.o i：与模型组比较^〈o.os”尸<0.01
< 0.01 vs control group :*/5 < 0.05 m，P < 0.01 vs m odel group
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表2各组小鼠糖水偏爱度变化，/i=l0)
Table 2 Changes in sugar and water preferences of mice
in each group (尤±5,«=10)
组别
剂量/糖水偏爱度(g.kg 丨）第1天第28天
对照—0.47±0.090.54 土0.05
模型—0.48 土0.040.40 土0.04#a
盐酸氟西汀0.010.47±0.090.52±0.07"
GABA0.012 80.53 土0.050.51 土 0_08"
H 1.520.48 土0.060.43±0.07
F6 1.520.51±0.060.44 土0.05
Z6 1.520.47 土0.040.51 ±0.06**
Z15 3.040.45 土0.060.46 士0.04.
1.520_46 土0.080.47±0.06*
0.760.48 士0.040.43 土0.08
与对照组比较^^C O.O l；与模型组比较：7><0.05 "尸<0.01; 与F6组比较:><0.05
<0.01 vs control group；*P < 0.05 m，P <0.01 vs model group；P <0.05 F6 group
水消耗降低和快感缺失现象。与F6组比较，Z6组的糖水偏爱度显著增加（P<0.05)，Z15高、中、低剂量均无差异。
3.4敞箱实验
应激前各组之间均无差异，应激结束后各组小鼠出现不同程度差异。与对照组比较，模型组小鼠 的跨格数、直立数均极显著减少（P C0.01)，表明 CUMS模型小鼠对新环境的好奇探究程度降低，自发活动减弱，紧张度增加。与模型组比较，盐酸氟西汀组和GABA组跨格数和直立数，Z15中、高剂量 组和Z6组跨格数均极显著增加（P<〇.〇l):Z15高 剂量组的直立数显著增加（P<0.05),Z15中剂量组 和Z6组直立数无显著差异：H组、F6组、Z15低剂量 组跨格数、直立数均无显著差异。结果表明，Z6组 和Z15高、中剂量组明显改善CUMS抑郁小鼠的自 主活动、对新环境的探宄和紧张度。与F6组比较，Z15高剂量组在应激28 d后跨格数显著增加(/>< 0.05),Z6组、Z15中、低剂量组均无差异；Z6组、Z15 高、中、低剂量组应激28 d后直立数均无差异。各 组小鼠敞箱实验结果见表3。
3.5悬尾、强迫游泳实验
各组小鼠悬尾、强迫游泳实验的累计不动时间 结果见表4。与对照组比较，模型组的悬尾、强迫游 泳后4〇1丨11不动时间均显著增加(/3<0.05、0.01)，表 明C U M S抑郁小鼠行为绝望程度增加。与模型组 比较，盐酸氟西汀组、G A B A组的悬尾、强迫游泳不 动时间均极显著减少（P<0.01)，表明阳性药
、GABA能显著改善CTJMS抑郁小鼠的行为绝望程度。
悬尾实验中，与模型组比较，Z15高、中剂量组 不动时间极显著减少C P<0.01)、Z6组显著减少C P< 0.05);H组、F6组及Z15低剂量组均无显著差异，表 明悬尾实验中，Z6和Z15高、中剂量组对CUMS抑 郁小鼠的行为绝望程度有明显的改善作用。与F6 组比较，Z15高剂量组悬尾累计不动时间显著减少(PCO.OS^ZG组和Z15中、低剂量组均无显著差
表3各组小鼠的敞箱行为变化U iv,«=10)
Table 3 Open-field test results of different group mice (*±5,/i=10)
组别
剂量/跨格数直立数
(g-kg 丨）第0天第28天第0天第28天
对照—78.90士15.2788.80±8.9314.70 土7.1021.00 士9.49模型—88.00土17.0367.30土13.44 料20.20±5.4510.90 土3.72抽盐酸氟西汀0.0186.60士14.7892.30土12.72”20.20士 6.2522.70土7.5 广GABA0.012 875.70士18.3185.90土12.56"17.50
土7.5321.00±6.88**
H 1.5279.00土11.9375.89土10.8918.55±7.8018.50 士8.59
F6 1.5279.30土20.1475.20土12.7915.50 士4.8416.80±8.52
Z6 1.5283.60土16.9184.00
士10.61"19.30 士7.2617.30 土11.75
Z15 3.0485.37土18.8487.22±14.68”a15.50
土6.2218.55 士7.89*
1.5276.56士15.7584.56
土9.02“15.50 土8.4116.56 士7.48
0.7680.63±11.7973.87±12.8216.12
土7.4914.87 土5.72与对照组比较，P<0.01；与模型组比较：：P<〇.〇5 "P<0.01；与F6组比较:，<0.05
n n P < 0.01 V5 control group；< 0.05 **P < 0.01 model group；AP < 0.05 F6 group
