小鼠慢性温和应激(Chronic mild stress，CMS)模型的建立
摘要：抑郁症(depression)具有发病率高、患病率高、复发率高、自杀率高，而知晓率低、治疗率低等特点，对社会造成了重大的经济负担，因而受到全球各国的关注。目前认为，遗传、生化、精神动力学及社会环境之复杂的相互作用能共同导致抑郁障碍。研究和治疗抑郁症的关键问题之一就是动物模型的建立。随着抑郁症应激理论的不断完善，由此开发的动物模型也得到相应的发展。模型之一慢性温和应激(Chronic mild stress，CMS)模型，应激后动物的行为特征改变、血浆皮质激素升高等均与内源性抑郁症状相似，且该模型持久而稳定，作为抑郁模型具有较高的价值，对抗抑郁药的筛选以及抑郁机制的研究有重大的帮助。本文将详细阐述CMS模型的建立过程。
关键词：慢性温和应激；抑郁模型；快感缺乏；糖水偏好；强迫游泳测试；BDNF Abstract: Depression with a high incidence, high prevalence rate, high relap rate, high suicide rate, and low awareness, low treatment rate，the society suffer a significant economic burden，was concerned by the world's countries.
Now，we think heredity, biochemistry, psychology dynamics and social environment’s complex interaction can cau depression disorder. Rearch and treatment of depression‘s one of the key questions is t up an animal model. With the stress theory of depression continued to be refined, the
红色主题development of animal models also has correspond develop. One of animal model is chronic mild stress (CMS) model, after stress, the behavior of animals change and plasma corticosteroid incread likes endogenous depression, and the model is lasting and stable, as a model of depression has the higher the value, there is a significant help for the screening of antidepressant drugs and rearch the mechanism of depression. This thesis will elaborate to explain the process of CMS model.
形容荒凉的成语Keywords: Chronic mild stress; depression model; anhedonia; sucro preferences; forced swimming test; BDNF
心理辅导方案引言
抑郁症患者，有显著的情绪低落，明显的精神运动性抑制或激越的客观证据，食欲明显丧失，体重减轻（上月体重的5%以上），失眠或睡眠节律紊乱，即白天睡眠多，性欲缺乏，无价值感和自我贬低，抑郁症患者约50%出现过自杀行为， 10—15%死于自杀。病人艰难地捱过一天又一天，缺乏精力和能量。不能振奋起来，也不能工作，不得不强迫自己干每一件事情，哪怕是最小的事情也要花巨大的努力，即使每一天最常见的事务，起床、穿衣、梳洗也要通过艰难的努力才能去做。
抑郁的原因主要是悲伤和哀伤这种正常的情绪导致的，但并不排除其他的情绪的放纵的外部原因，这
些原因是不成比例歧化的的。经典严重状态的抑郁症常常没有外部的直接原因。去分清抑郁与没有精神沉淀作用的事件的区别是很困难的。重症抑郁的诊断需要不同变化的方式，具有伤心或易怒性的特征，而且至少要伴随数个心理生理性疾病的变化，比如睡眠，食欲，性欲的紊乱，便秘，失去在工作和交友中得到愉悦的能力，哭泣，自杀念头，语言和行动能力的缓慢。这些改变至少要持续2周以上并对工作和家庭关系有相当大的影响，基于这些广义的定义，在美国一生中发病的几率，男人为12%，女人为20%.一些人提倡较狭义的定义严重抑郁，他们称之为忧郁症或生命的抑郁。
一小部分的重症抑郁的病人拥有或将要拥有偶发的狂躁包括兴奋过度，安乐感，和快感寻求行为的增加。尽管这些病例的一些发病机制和重症抑郁有些重叠，但是这种特殊的疾病历史
上称之为双向抑郁症。
抑郁作为一种复杂的疾病具有相当大的变量过程，对治疗的反应不一样，没有确定的发病机理。[1]
抑郁的核心症状包括心境或情绪低落，兴趣缺乏以及乐趣丧失。这是抑郁的关键症状，诊断抑郁状态时应包括三种症状中的一个。
1．情绪低落。病人体验到情绪低，悲伤。情绪的基调是低沉、灰暗的。病人常常诉说自己心情不好，高兴不起来。抑郁症病人常常可以将自己在抑郁状态下所体验的悲观、悲伤情绪与丧亲所致的悲哀相区别，在抑郁发作的基础上病人会感到绝望、无助与无用。小园香径独徘徊
convenient
绝望（hopelessness）：对前途感到失望，认为自己无出路。此症状与自杀观念密切相关。无助（helplessness）：是与绝望密切相关的症状。对自己的现状缺乏改变的信心和决心。常见的叙述是感到自己的现状如疾病状态无法好转，对治疗失去信心。
无用（worthlessness）：认为自己生活毫无价值，充满了失败，一无是处。认为自己对别人带来的只有麻烦，不会对任何人有用。认为别人也不会在乎自己。
2．兴趣缺乏。是指病人对各种以前喜爱的活动缺乏兴趣，如文体、体育活动、业余爱好等。典型者对任何事物无论好坏都缺乏兴趣，离群索居，不愿见人。
3．乐趣丧失。是指病人无法从生活中体验到乐趣，或曰快感缺乏（anhedonia）。
根据目前流行观念，快感丧失作为抑郁症的核心症状。即失去享受快乐的能力，被描述为是一种丧失情感的感觉，类似于可怕的空虚。
给啮齿类动物以慢性长期的应激可以诱导出快感缺乏。Katz和他的同事给老鼠21天的刺激
包含电击，固定老鼠，放入冷水中以及其他强烈的刺激，导致了老鼠对糖水的摄入减少这种类似于快感缺乏的行为。为了使老鼠的抑郁现象更加持久，在老鼠身上获取到更类似于人类的症状，Willner和他的小组运用了较温和的刺激，比如弄脏笼子，放入对老鼠而言是新奇的物体，限制食物和水等等，
持续时间达3个月使老鼠产生更长久的糖水摄入减低现象。[2]
慢性温和应激的操作过程在1980年后期做为一种抑郁模型发展起来，与其他有效的模型有3点主要方面的不同：诱导条件相对的更加现实，模型的焦点是抑郁的核心症状——快感缺乏，模型时间过程的延长更适合于慢性药物疗法效果的研究。[3]
慢性刺激除了导致老鼠对糖水溶液摄入量的减少，还可以导致生理学上和人类的抑郁症患者类似的现象，比如快动眼睡眠潜伏期减少、快动眼睡眠持续时间增加、血浆中糖皮质激素升高、睡眠周期紊乱。怎么熨衣服
我们设计了自己的刺激程序来建模，目标就是通过长期的各种温和刺激诱导老鼠失去或减低对快感的需要来建立起模型模拟人类的抑郁症。
实验方法
1.老鼠的状况以及动物房饲养条件
老鼠的年龄为八周，雄性，品系为C57BL，从北京大学医学部购买。动物房气温长年保持在22±1℃，相对湿度55%，食物长期供应。单笼饲养，光照时间为9：00——21：00。
2.实验流程
先饲养2周使老鼠适应动物房的环境，再训练2周测试老鼠对糖水偏好量的基线值（baline），接下去是为期4周的慢性温和应激时期，经过了慢性温和时期后，在最后一周对老鼠进行行为学上的测试后，解剖老鼠，取出海马，测量海马中BDNF(brain—derived neurotrophie factor)基因第4号剪切子mRNA表达的量。
Behavioral test
-28 -21 -14 -7 0 7 14 21 28 35
共21只老鼠被分为CMS组和对照组，CMS11只，对照组10只。
3.应激流程。人本管理
应激程序包含倾斜笼子、持续一整夜的光照、往笼子里灌水来使垫料潮湿、在没有垫料的笼子里留一部分水、调转昼夜周期、老鼠配对、在一段时间内开/关灯。
①倾斜笼子：将笼子一端抬高，往笼底放入一铁制架子使笼子倾斜约30度。
②持续一整夜的光照，调转昼夜周期，在一段时间内开/关灯：灯的开和关由微电脑开关控制，
③调转昼夜周期即灯为白天关，晚上开。开/关程序持续2个半小时，开10分钟，再关20分钟，再开10分钟，如此循环。
④往笼子里灌水来使垫料潮湿：在烧杯里盛入约200ml自来水倒入笼底，倒的过程中要注意水不要溅到小鼠身上。
⑤在没有垫料的笼子里留一部分水：此程序进行在‚往笼子里灌水来使垫料潮湿‛程序之后，先去掉湿的垫料，再留一部分水，留水量为薄薄一层约8毫米深。
⑥老鼠配对：从一只鼠笼里取出老鼠，在小鼠的尾巴上用标记笔标记，放入另一只老鼠的笼子里，使俩只老鼠在一起呆2小时，2小时后取出鼠尾被标记的老鼠放回原来的笼子，注意配对时间不能太久以免老鼠间厮打的过于厉害使老鼠受伤死亡。[4]
具体流程见表1
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表1
（一）糖水溶液偏好测验；大量的文献显示，CMS导致的是小鼠自我奖赏的降低，而不是对糖水味觉有特别的作用，糖水测量可以有效的测量小鼠的自我奖赏。
实验方式如下：指示快感缺乏度的指标为糖水溶液偏好值。在24小时内，在鼠笼上给予老鼠2只瓶子
供老鼠自由选择，一只瓶子里装有150毫升的汇源牌矿泉水，另一只瓶子里装有浓度为1.5%的蔗糖水溶液。24小时后取出2只瓶子记录老鼠对水以及蔗糖水的摄入量，再计算出两者摄入的比值来得出糖水溶液偏好值。为了消除老鼠对摆放在鼠笼俩边的瓶子某一边可能有的位臵偏好，下一周水瓶和糖水瓶的摆放位臵要相互交换。[5]
（二）悬尾测验：实验中，老鼠被迫被悬吊在铁架子上，开始老鼠会试图挣扎逃脱，随后则处于一种悬吊不动的状态。
实验方式如下：先将老鼠转移到实验室放臵1小时使其适应环境，把小鼠的尾巴用自动化的悬尾装臵悬吊一厘米在铁架子上，悬吊6分钟，目视观察记录小鼠不挣扎的时间。
（三）强迫游泳测验：实验中，小鼠被迫在一个局限的空间内游泳，它们首先试图逃跑，随后小鼠在经历一段时间的挣扎后就会发生行为改变，即由积极状态转变为消极状态(仅保持头部浮出水面的最小幅度的运动姿式)，处于一种漂浮不动状态，放弃逃脱的希望，即‚行为绝望(behavioral despair)‛。这和小鼠对自身状态的认识有关，开始进入泳池时竭力想摆脱这种困境，失败后才转变为抑制；抑郁程度越重的老鼠对这一趋势(无法逃出泳池)认识越快，消极逃避行为出现越早，表现为挣扎时间越短，不动状态出现越早，此实验观测的指标——不动时间（累计动物在水中停止挣扎呈直立漂浮状态，或仅有偶尔的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间）越长。
目前普遍认为，这种行为绝望(小鼠在强迫游泳期间的不动时间)类似于人类抑郁症的成分。当大鼠被放进水里时，开始拼命游动力图逃脱，很快就变成不动状态，这是动物放弃逃跑，出现行为绝望的表现。其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机理更接近，临床上有效的抗抑郁药可缩短小鼠的不动时间，而已知的能导致人抑郁的药物则增加小鼠的不动时间，这些资料都显示强迫游泳实验的有效性。强迫游泳测验的数据被作为一种评价动物是否具有抑郁行为的重要指标，广泛应用于抗抑郁药的研究。[6]
实验方式如下：先将老鼠转移到实验室放臵1小时使其适应环境，再将动物小鼠放进一个盛有9.5厘米高(应注意水的深度，以免大、小鼠的前、后肢能在水中触及底面而支撑自己的身体)，盛有650毫升，温度达30度水的玻璃圆筒中进行游泳测验，每缸1只。时间为6分钟，目视观察记录漂浮时间（头与身体没有剧烈摆动的时间）。在实验的过程中为了保持数据的可靠性，会隔一段时间就把玻璃圆筒中的水倒掉并清洗干净后再开始测试。[7]
5.生化测试
生化测试选定BDNF的原因：选定海马可分为海马回和齿状回2个部分，与人类的神经系统结构可塑性、学习、记忆及情感等高级认知功能密切相关。海马回包括CA1、CA2、CA3、CA4，主要由锥体神经元构成；齿状回则主要由颗粒神经元构成。成年哺乳动物脑内神经干细胞的发现彻底打破了中枢
神经系统神经元缺乏再生能力的传统观点。海马齿状回(dental gyrus，DG)终生保持了生成新神经元的能力，即神经发生(neurogenesis)。海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone，SGZ)产生新生神经元的前体细胞，迁移到颗粒细胞层，分化为颗粒细胞，产生树突、轴突，形成突触联系，整合到海马功能的神经环路中。虽然这些颗粒细胞的具体功能不清楚，但比成熟的神经细胞更具可塑性。
目前研究结果表明：抑郁症的病理生理和发病机制不限于神经递质和神经肽及其受体数量和密度异常等神经生物化学的改变，同时与下丘脑一垂体肾上腺轴之间的功能、海马发生结构和功能改变等有着密切的交互作用，尤其是受体后的改变近来已经引起人们的极大关注，这些环节可能包括信号传导、基因转录、基因调节甚至涉及神经元的凋亡和再生以及神经遗传
药理的一些问题。从抑郁症的研究进展看，人们的注意焦点已从受体转移到基因翻译因子和基因表达的变化上，其中，神经营养因子系统，特别是脑源性神经营养因子(BDNF，brain．derived neurotrophi factor）的作用不容忽视。
BDNF本身在抑郁动物模型中有抗抑郁作用，BDNF对抗应激诱发的神经元损害，并可能影响海马的神经元再生，而海马被认为参与情绪障碍的发病机制。
低水平的BDNF可以通过影响5-HT （5-羟色胺）的含量参与抑郁症的形成，抑郁时BDNF的mRNA 减少，海马BDNF的表达减少，可能造成前额皮质、海马神经细胞凋亡的增加，神经可塑性 (突触连接性
功能和长时程电位活动)也下降了，继而造成额前皮质、海马、纹状体灰质的减少等形态学的变化。
因此本试验选择测定抑郁小鼠海马中BDNF第4号剪切子mRNA表达状况，以检验本抑郁模型的成功与否。
实验方法：
实验方式如下：①海马组织提取。将选取的小鼠以干冰迅速杀死，提取其新鲜的海马组织，提取后的海马组织迅速放至-70℃保存。②海马总RNA提取。将抑郁小鼠和控制组小鼠提取的海马组织各自按左右海马匀浆混合，每30-50mg组织加入1mlTRNzol，用匀浆仪进行匀浆处理。匀浆样品在15-30℃放臵5分钟后以4℃ 12,000rpm离心十分钟，取上清。每1mlTRNzol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放臵3分钟。抽取上清水相，加入等体积异丙醇，混匀，室温放臵20-30分钟。然后，进行RNA沉淀、冲洗及溶解。③检测RNA质量。UV下观察。分光光度计：260nm，A260/A280大于1.70为宜。混合等量体积的RNA和2*RNA Loading Buffer，70℃温热5分钟，电泳。④RT-PCR实时定量PCR（Real time PCR）。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始
量，不需要取出PCR产物进行分离。取提取好的RNA配制成混合液20 μl（其中RNA1~10μl，引物2μl，dNTP Mix 4μl，10* RT Buffer 2μl，RNa Inhibitor 1μl，M-MuLV反转录酶 1μl），42℃保温一小时后，95℃5分钟使酶变性后稀释体积至50μl，每个PCR反应使用2-5μl。PCR反应条件：94℃预变性，退火、延伸，延伸最佳温度68℃。
测试结果
统计方法：我们使用统计软件spss13.0进行统计分析，糖水偏好和小鼠的体重的数据分析，我们采用重复测量的双因素分析法进行分析。而悬尾实验和强迫游泳实验得到的数据，我们采用t检验方法来检验对照组和实验组的数据的差别是否有统计学意义。
表2
糖水溶液偏好值(The sucro perference)
