YPD:
Difco peptone 20 g/L
Yeast extract 10 g/L
葡萄糖 20 g/L
YPD固体:
Difco peptone 20 g/L
Yeast extract 10 g/L
葡萄糖 20 g/L
Difco Agar (for plates only) 20 g/L
调pH至6.5，灭菌条件为高压1210C灭15 min(以下所涉及的需要加入碳源的培养基类型均与此相同)。
YPDA：
YPD冷却至550C，添加5mL/L 0.6% Ade。
每升加YMB酵母无氨基氮源6.7g（威佳），-leu氨基酸（takara），无水葡萄糖20g，琼脂20g，pH5.8
SMART III Oligo ( 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3')
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CDS III Primer (5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3')*
5' PCR Primer (5'-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3')
3' PCR Primer (5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3')
AD 5' CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC
AD 3' GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT
一、利用CDSⅢ引物合成单链cDNA
1.灭菌离心管加
1－2ul RNA( 0.025-1.0ug的m RNA)
1.0 ul CDSⅢ 引物
加入灭菌去离子超纯水至总体积为4.0ul.
2.混匀
3.72℃水浴2分钟
4.冰水中冷却2分钟
5.轻微离心
6.加入一下试剂
2.0 ul 5× First-Strand Buffer
1.0 ul DTT( 20m M)
1.0ul d NTP (10m M)
1.0ul MMLV反转录酶
7. 混匀
8. 42℃ 水浴10分钟
9．加入 1.0ul的 BD SMART Ⅲ 寡核苷酸
10．42℃ 水浴1小时（加石腊油）
11. 扩增仪上75℃放置10分钟，终止合成反应
12.冷却至室温，加入2.0ul(2.0单位)的RNa H.
13 37℃温浴20分钟。
14．－20℃条件下放置备用。
四、用LD-PCR扩增单链Cdna
1.PCR扩增仪预热至95℃
2.在离心管加入如下药品
2.0ul 单链cDNA
70ul 去离子超纯水
10ul 10×BD Advantage 2 PCR 缓冲液
2 ul 50×d NTP Mix
2 ul 5’ PCR引物
2 ul 3’ PCR引物
10ul 10× GC-Melt 溶液
2ul 50×BD Advantage 2 聚合酶混合液
3．小心混匀，轻微离心
4．加2滴灭菌石蜡油
5．扩增程序
95℃ 30 c
N个循环：
95℃ 10 c
68℃AREM 6 min (注意：每个循环过后，退火时间增加5秒
68℃ 5min
6．取7ul扩增产物，加Marker,在1.2％的琼脂糖胶电泳，与附录A中图谱对照，检测扩增结果。
7．－20℃条件下放置备用。
五．用BD CHROMA SPIN TE-400 滤柱纯化回收双链cDNA
1.取出滤柱，上下晃动几次，每95ul样品用一个滤柱
2.用食指和拇指夹出滤柱活动管子，把滤柱套入收集管，保存好两端帽子备用。
3.700×g 离心5分钟。
4. 取下滤柱，丢弃收集管和滤液。
5．滤柱重新套入另一2ml的收集管，小心的把95ul的cDNA样加到滤柱胶面中央，以免样品从胶面的内侧流出。
6. 700×g 离心5分钟。
军训新闻稿7．取下滤柱和收集管，纯化了的cDNA 集中在收集管的底部。
8．来自同一样品，纯化了的cDNA放入统一离心管。
9．加入如下试剂：
1/10 体积 乙酸钠（3M;PH 4.8）
2.5 体积 95％乙醇（－20℃）
10．轻微摇匀
11．－20℃条件下过夜。
12.室温下，14000rpm 离心20分钟。
13．小心吸出上清液
14．轻微离心使余液全都集中到离心管底部。
15．小心吸出余液，cDNA小团块在空气中干燥10分钟。
16．用20ul的去离子超纯水溶解cDNA小团块，－20℃条件下放置备用。
cDNA文库的建立
·YPD培养基加入25％甘油
·准备PEG/LiAc 溶液（参考Ⅲ部分）
1×PEG/LiAc sol: 8ml 50% PEG, 1ml 10xTE, 1ml 10xLiAc,
1.1×TE/LiAc施工方案审批流程:1.1ml 10xLiAc, 1.1ml 10xTE, 7.8ml H2O (water)
1．酵母感受态细胞的准备
在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株，培养时间≤4周，菌落直径为2－3mm
15ml灭菌离心管加3ml的YPDA液体培养基，每管一个菌落，30℃，250rpm，8h
吸取5μl种子液加入到含有50ml YPDA的250ml三角瓶中
30℃，250rpm，16~20h 测OD600=0.15~0.3，将培养液移至50ml离心管
室温，700rcf，5min，弃上清液
用100ml YPDA重悬沉淀，用500ml三角瓶摇，30℃，250rpm，3~5h
测OD600=0.4~0.5，将培养液分装到两个50ml离心管，室温，700rcf，5min，弃上清液
学习委员竞选
每管加入30ml 去离子超纯水，重悬沉淀，700rcf，5min，去上清
不必了
用3ml 1.1*TE/LiAc悬浮菌体，吸出与两支1.5ml离心管，12，000rpm 15~30s
弃去上清液，每管加入600μl 1.1*TE/LiAc 重悬沉淀，备用
Caution：制出的感受态必须马上使用
以下是转化过程
16．在一个15ml的离心管里加入如下药品
20ul ds cDNA
6ul pGADT7-Rec (0.54ug/ul)
20ul Herring Testes Carrier DNA(已变性)
（ Herring Testes Carrier DNA的变性：离心管加入约50ul的HerringDNA，100℃条件下变性5分钟，迅速在冰水中冷却。加入15ml的离心管前要再重复变性冷却一次）
17．在DNA中加入600ul的感受态酵母细胞
18．轻轻摇匀
19．加入2.5ml的PEG/LiAc溶液
20．轻轻摇匀
失去后才懂得珍惜
21．30℃条件下温浴45min,每15分钟混匀一次）
22．加入160ul DMSO,摇匀，42心理健康教育的内容℃条件水浴20分钟，每10分钟摇匀一次
23．700×g 离心5分钟
24．去掉上清夜，每个管加入3ml的YPD Plus液体培养基（注意：不能用标准的YPD培养基）
25．30℃摇菌90分钟。
26．700×g 离心5分钟
27．去掉上清夜，加入15ml 0.9%的NaCl溶液。
在SD/-Leu培养基上筛选转化株
28．在准备好的150mm含培养基的培养皿上涂抹150ul的菌液（约需100个）
（在100mm SD/-Leu含培养基的培养皿上分别涂抹1：10，1：100，1：1000，和1：100
00稀释了的菌液，以检测转化的效率）
29．培养皿倒置，在30℃条件下培养直至菌落出现，（一般要培养3－6天）
30．计算转化效率：一般要求≥1×106转化株/3ug pGADT7-Rec
转化株收集
31．培养皿在4℃条件下保存3－4个小时
